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摘要: 酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶，可能是白癜風(fēng)自身免疫的重要抗原。最近發(fā)現(xiàn)部分白癜風(fēng)患者血清中有酪氨酸酶抗體，且與白癜風(fēng)臨床類(lèi)型和分期密切相關(guān)。提示自身免疫性白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制與酪氨酸酶抗體水平有關(guān)，為其免疫治療提供依據(jù)。酪氨酸酶抗體可以作為白癜風(fēng)活動(dòng)性的一個(gè)指標(biāo)。
酪氨酸酶（TYR）是一種75kD含銅酶，來(lái)源于胚胎神經(jīng)峭細(xì)胞，是黑素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶。Spritz等[1]證實(shí)人TYR是一種銅結(jié)合蛋白，有銅A和銅B位點(diǎn)。離子銅特異性能與人TYR結(jié)合，一個(gè)位點(diǎn)的銅結(jié)合可以促進(jìn)另一個(gè)位點(diǎn)的銅結(jié)合。組氨酸在銅B位點(diǎn)協(xié)調(diào)其結(jié)合。TYR的多肽鏈的適當(dāng)折疊對(duì)銅結(jié)合及其催化活性是關(guān)鍵性的，TYR突變可中斷銅結(jié)合使其催化活性喪失。眼、皮膚白化病是由于TYR基因突變所致，該病TYR陽(yáng)性患者色素性皮膚損害發(fā)生率高[2]。超氧化物負(fù)離子（O2-）能穿透黑素細(xì)胞（MC）入胞內(nèi)，TYR通過(guò)利用O2-保護(hù)MC，免受O2-細(xì)胞毒作用[3,4]。在黑素瘤患者黑素瘤細(xì)胞（MMC）和MC中抗氧化系統(tǒng)失衡，內(nèi)源性反應(yīng)性氧生成，細(xì)胞內(nèi)不能抵御內(nèi)源性超氧化物的攻擊[5]。白癜風(fēng)患者血清中TYR抗體的生成，提示白癜風(fēng)的發(fā)病與自身免疫有關(guān)。
一、酪氨酸酶的抗原性
酶是多種自身免疫紊亂性疾病的自身抗原[6]，TYR作為抗原必需具備下列條件：①酶活躍性；②免疫原性；③能誘導(dǎo)識(shí)別自身的抗體。
TYR能暴露于免疫系統(tǒng)中，從惡性或正常色素細(xì)胞來(lái)源的TYR，可以作為自身抗體產(chǎn)物的靶抗原；TYR與蛋白酶等無(wú)交叉反應(yīng)，提示抗TYR抗體對(duì)TYR是特異性的，MC能表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子，可作為抗原遞呈細(xì)胞。人MMC能分泌TYR，TYR抗體在黑素瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)，其它惡性腫瘤患者血清中則沒(méi)有，提示惡性黑素瘤可產(chǎn)生抗TYR的抗體[7,8]，TYR基因編碼抗原能被黑素瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）識(shí)別[9]，顯示系統(tǒng)免疫系統(tǒng)能對(duì)TYR發(fā)揮作用[10]。
哺乳動(dòng)物黑素生成由多個(gè)基因位點(diǎn)共同參與調(diào)控。不同位點(diǎn)基因及相關(guān)蛋白具有多種特征性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)（B位點(diǎn)，C位點(diǎn)，S位點(diǎn)和P位點(diǎn)）。哺乳動(dòng)物色素細(xì)胞調(diào)節(jié)基因有多種，這些基因的最大特點(diǎn)是定位于C位點(diǎn)（C-allbino locus），編碼TYR。鼠C位點(diǎn)基因長(zhǎng)70kb，定位第7號(hào)染色體，人C位點(diǎn)基因長(zhǎng)50kb，定位11號(hào)染色體。鼠及人C位點(diǎn)基因均含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。TYR是一種膜糖蛋白，可在MC中特異性表達(dá)。B位點(diǎn)（brown locus）基因編碼TRP-1（gp75）。鼠B位點(diǎn)基因長(zhǎng)18kb，有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，定位14號(hào)染色體。人B位點(diǎn)基因定位第9號(hào)染色體。TRP-1能在MC中表達(dá)且定位黑素體膜，具酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶活性。S位點(diǎn)（slaty locus）基因編碼TRP-2，小鼠S位點(diǎn)基因位于第14號(hào)染色體，為多巴色素異構(gòu)酶。鼠及人P位點(diǎn)（Pmel-17 locus）基因編碼stablin蛋白，人及鼠P位點(diǎn)基因定位第10、12號(hào)染色體，參與黑素合成終末途徑的調(diào)節(jié)。
TYR、gp75、TRP-2結(jié)構(gòu)相似，其基因產(chǎn)物有下列特點(diǎn)：①高同源性（氨基酸序列相同40％，相似45％）。②分子量幾乎相同。③三級(jí)結(jié)構(gòu)有高度保守序列半胱氨酸殘基。④具有酶活性銅結(jié)合位點(diǎn)。⑤含有跨膜區(qū)。
TYR是黑素合成的關(guān)鍵酶，其已知的氨基酸序列含有一段前導(dǎo)信號(hào)肽和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)基元（motif），與黑素體膜上的錨定蛋白（anchorin）相一致。HLA-A2遞呈TYR抗原，不同的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞克隆識(shí)別具有活性基元的九肽LLAVLYCLL，說(shuō)明TYR在不同個(gè)體的表達(dá)呈相當(dāng)高的同源性。TYR的表達(dá)均一性?xún)?yōu)于TRP-2，表達(dá)頻率亦較TRP-1高。除CD8+T細(xì)胞外，人CD4+T細(xì)胞也能特異性識(shí)別TYR基因編碼的相關(guān)抗原。黑素瘤患者中檢出TYR，TYR是MMC上的分化抗原�？勺鳛橹鲃�(dòng)免疫的良好抗原靶。TYR既受MHC-Ⅰ限制，又受MHC-Ⅱ限制的黑素瘤共同抗原，誘生的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞均能產(chǎn)生有效的抗腫瘤應(yīng)答。TRP-1原位雜交證實(shí)編碼基因位于人第9號(hào)染色體q23區(qū)，為IgG抗體識(shí)別抗原，具有DHI-2羧酸氧化酶活性，非突變型TRP-1抗原可被HLA-A31特異性CTL識(shí)別。外源性TRP-1cDNA在MMC等中表達(dá)。gp100即MC/MMC特異性蛋白P mel-17，免疫電鏡證實(shí)gp100主要位于Ⅰ、Ⅱ期黑素體膜，廣泛表達(dá)于人MMC（50％）。HLA-A2 mMC的gp100可被自體腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL）識(shí)別。識(shí)別部位是十肽LLDGTATLRL（aa457-486），從gp100提取的十肽能體外誘導(dǎo)TIL，將TIL細(xì)胞與IL-2配伍應(yīng)用于HLA-A2+黑素瘤患者，可消除自發(fā)性黑素瘤的轉(zhuǎn)移灶。
二、酪氨酸酶抗體
（一）檢測(cè)方法：TYR抗體在白癜風(fēng)患者血清中檢出。Song等[11]1994年用細(xì)菌合成人TYR，免疫印跡法檢測(cè)TYR抗體。這種方法相對(duì)不敏感且不能定量檢測(cè)。Baharav等[12]1996年使用蘑菇TYR，ELISA法檢測(cè)TYR抗體，此法敏感，但所用蘑菇TYR與人TYR同源性低。而Xie等[13]1996年則用人MC提取物作為T(mén)YR的來(lái)源，免疫沉淀法等檢測(cè)TYR抗體。Kemp等[14]1997年采用放免法（RIA）檢測(cè)TYR抗體。近來(lái)此法已被用來(lái)檢測(cè)自身免疫性疾病患者血清中的特異性抗體[15-17]。這種方法能敏感定量檢測(cè)抗體。
�。ǘ┊a(chǎn)生、特點(diǎn)、特性：
1.抗TYR抗體的產(chǎn)生：用人TYR cDNA轉(zhuǎn)染L細(xì)胞，獲得L-TY細(xì)胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY細(xì)胞與等量Frend佐劑混合，腹膜內(nèi)注入有6周鼠齡的雌性C3H鼠體內(nèi)，每次間隔2周，第3，4次用5×106細(xì)胞裂解物與等量Frend佐劑混合免疫動(dòng)物。第4次注射后3天，抽血，分離血清，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染L細(xì)胞去除非特異反應(yīng)性成分，結(jié)果用人TYR cDNA轉(zhuǎn)染L細(xì)胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只對(duì)TYR cDNA轉(zhuǎn)染L細(xì)胞的鼠血清抗體滴度＞10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠對(duì)L-TY細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。用L-TY細(xì)胞免疫動(dòng)物獲得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC細(xì)胞裂解物。免疫沉淀法可見(jiàn)分子量為70kD～80kD的寬幅條帶，可能為T(mén)YR生物合成中間代謝產(chǎn)物，未轉(zhuǎn)染L細(xì)胞，TYR陰性無(wú)色素MMC中未見(jiàn)特異性條帶。
2.免疫印跡法檢測(cè)TYR抗體：用抗TYR血清10-3稀釋度，在TYR轉(zhuǎn)染L細(xì)胞和有色素MMC可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)顆粒染色，親代L細(xì)胞內(nèi)無(wú)胞內(nèi)染色，在L-TY細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)染色顆粒位于核周和胞質(zhì)內(nèi)。無(wú)色素MMC，不表達(dá)TYR mRNA，無(wú)TYR活性，與TYR抗體無(wú)相互作用。有色素MMC和培養(yǎng)MC，高度表達(dá)TYR活性，黑素形成多，細(xì)胞質(zhì)顆粒深度染色。
單克隆抗體TA99能識(shí)別TRP-1糖蛋白，TA99能與人有色素MMC表達(dá)的TRP-1和轉(zhuǎn)染L-GP細(xì)（用編碼TRP-1全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)染鼠L細(xì)胞獲得）表達(dá)的全長(zhǎng)人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭實(shí)驗(yàn)證實(shí)TA99不耗竭能產(chǎn)生分子量為70kD～80kD條帶的抗TYR血清，免疫熒光分析抗TYR抗體與TRP-1，TYR l-GP細(xì)胞無(wú)相互作用，抗TYR抗體不沉淀來(lái)自L-GP細(xì)胞的TRP-1。
3.TYR抗體使TYR活性喪失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY細(xì)胞裂解物，提示免疫鼠血清能滅活有色素MMC及L-TY細(xì)胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，見(jiàn)黑素形成，提示TYR活性恢復(fù)，免疫沉淀時(shí)如用免疫前血清則無(wú)黑素形成[7]。
三、白癜風(fēng)
白癜風(fēng)與TYR抗體：TYR抗體在白癜風(fēng)中常常發(fā)生。Song等[11]應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)了26例白癜風(fēng)患者血清，其中有16例（61％）可與重組TYR特異性結(jié)合。26例白癜風(fēng)患者，有16例（61％）血清TYR抗體陽(yáng)性，其中7例伴發(fā)非胰島素性糖尿病（IDDM）有4例（57％）、8例伴發(fā)橋本甲狀腺炎有4例（50％）、3例伴發(fā)Grave病有3例（100％）、7例伴發(fā)Addison病有4例（57％）陽(yáng)性。Kemp等[14]應(yīng)用35S標(biāo)記人TYR，放免法（RIA）檢測(cè)白癜風(fēng)患者血清TYR抗體。在被檢測(cè)的46例白癜風(fēng)患者的血清中，5例（10.9％）TYR抗體陽(yáng)性，20例對(duì)照血清及10例橋本甲狀腺炎患者血清陰性。Baharav等應(yīng)用固相ELISA法檢測(cè)18例白癜風(fēng)患者（彌漫性7例，局限性1例）血清中的TYR igG抗體滴度，結(jié)果（OD均值）彌漫性白癜風(fēng)為0.658±0.251，局限性白癜風(fēng)0.188±0.05，健康對(duì)照組0.093±0.049， 顯示彌漫性白癜風(fēng)TYR igG抗體滴度較局限性白癜風(fēng)及健康對(duì)照組顯著增高。這些TYR抗體與TYR的親和力高，與b位點(diǎn)基因產(chǎn)物TRP-1沒(méi)有交叉反應(yīng)[12]。
大多數(shù)急性白癜風(fēng)及黑素瘤患者有對(duì)MC、MMC的抗體，這些抗體在體外通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒作用和抗體依賴(lài)細(xì)胞毒作用殺傷MC。Cui等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30例黑素瘤患者血清有24例（80％）、29例白癜風(fēng)患者血清有24例（83％）抗體陽(yáng)性，而28例對(duì)照組只有2例（7％）陽(yáng)性。人及動(dòng)物黑素瘤中，白癜風(fēng)的出現(xiàn)能改變其進(jìn)程。用MMC免疫動(dòng)物可誘發(fā)白癜風(fēng)。重組抗MMC抗體對(duì)黑素瘤有效[18]。黑素瘤伴發(fā)白癜風(fēng)時(shí)預(yù)后較好，白癜風(fēng)患者抗體出現(xiàn)的頻率和水平與黑素瘤退變（regression）一致。提示抗白癜風(fēng)和黑素瘤抗體作用于色素細(xì)胞（MC，MMC）上有相同的抗原，并且這些抗原能在MC和MMC上表達(dá)[19]。白癜風(fēng)MC抗體既能溶解MC，致皮膚白斑形成，又能有效破壞MMC；MMC抗體也能與正常MC結(jié)合，誘導(dǎo)黑素瘤產(chǎn)生白癜風(fēng)樣白斑，TYR抗體則是二者之間的橋梁。
白癜風(fēng)患者血清MC抗體滴度與該病活動(dòng)性和嚴(yán)重程度密切相關(guān)，50％局限性白癜風(fēng)患者血清中有對(duì)MC的抗體，而彌漫性白癜風(fēng)則高達(dá)93％，且彌漫性白癜風(fēng)MC抗體能與MMC結(jié)合，抑制其增殖。在補(bǔ)體存在的情況下溶解細(xì)胞，減少體內(nèi)鼠黑素瘤轉(zhuǎn)移，MMC上抗體表位滴度在白癜風(fēng)較健康者及黑素瘤高。黑素體是黑素合成和貯存的亞細(xì)胞器，Ando等[20]認(rèn)為黑素體數(shù)量變化與TYR mRNA水平有關(guān)。UVB上調(diào)TYR mRNA水平致皮膚色素沉著[21]。TYR和gp75都是黑素體轉(zhuǎn)膜糖蛋白，TYR抗體與gp75沒(méi)有交叉反應(yīng)[22]。
白癜風(fēng)患者血清含有抗MC抗體，MC抗體在Smyth雞模型中于脫色前數(shù)周被檢測(cè)到。近來(lái)黑素瘤患者血清中亦分離到TRP-1自身抗體，循環(huán)中的這些抗體被認(rèn)為是導(dǎo)致Smyth雞色素脫失斑的主要原因[23,24]。白癜風(fēng)患者血清中TYR抗體的檢出，進(jìn)一步提示白癜風(fēng)的分子發(fā)病機(jī)制，為臨床分型、分期、治療及預(yù)后提供依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
1 Spritz RA et al.J Invest Dermatol,1997;109:207-212
2 Janet E et al.Int J Dermatol,1997;36:831-836
3 Valverde P et al.Exp Dermatol,1996;5:245-253
4 Valverde P et al.Pigment Cell Res,1996;9:77-84
5 Picardo M et al.J Invest Dermatol,1996;107:322-326
6 Tomer Y et al.Arthritis Rheum,1995;38:1375-1381
7 Bouchard B et al.J Invest Dermatol,1994;102:291-295
8 Bagarav E et al.Melanoma Reserch,1995;5:337-348
9 Brichard V et al.J Exp Med,1993;178:489-495
10 Lepoole IC et al.J Immunol,1993;151:728 4-7292
11 Song YH et al.Lancet,1994;344:1049-1052
12 Baharav E et al.Clin Exp Immunol,1996;105:84-88
13 Xie Z et al.J Invest Dermatol,1996;106:938(abstr)
14 Kemp HE et al.J Invest Dermatol,1997;109:69-73
15 Falorni A et al.Autoimmunity,1994;19:113-125
16 Falorni A et al.J Clin Endocrinol Metab,1995;80:2752-2757
17 Peterson P et al.Clin Diagn Lab Immunol,1996;3:290-294
18 Neri D et al.J Invest Dermatol,1996;3:164-170
19 Cui J et al.Arch Dermatol,1995;131:314-318
20 Ando H et al.J Cell Physiol,1995;163:608-614
21 Imokawa G et al.J Invest Dermatol,1995;105(1):32-37
22 Seth J et al.J Invest Dermatol,1995;105:3-7
23 Wang BR et al.J Exp Med,1995;181:1799-1804
24 Austin LM et al.Am J Clin Pathol,1995;146:152
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