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端粒-端粒酶假說是新近提出的腫瘤形成的新理論。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的具有保持染色體的穩(wěn)定功能的DNA-蛋白復(fù)合體，端粒酶是一種RNA依賴性的DNA聚合酶，端粒酶的激活使端粒長度得以穩(wěn)定，細(xì)胞獲得無限增殖能力，成為永性細(xì)胞，而獲得永生性是細(xì)胞惡變的關(guān)鍵步驟。近年的研究表明測定肺癌各種標(biāo)本的端粒酶活性不僅有助于肺癌的診斷，還可用于肺癌的惡性程度、病理分期及預(yù)后的判斷。端粒酶有望成為有價值的肺癌診斷的標(biāo)記物。
端粒（telomere）是真核細(xì)胞線形染色體末端的DNA序列，其生物學(xué)功能是保持染色體的穩(wěn)定。端粒DNA是由端粒酶（telomerase）以逆轉(zhuǎn)錄方式合成的。端粒長度縮短及端粒酶活化是細(xì)胞獲得永生和癌癥發(fā)生的重要因素。因此，利用端粒酶作為腫瘤的特異性標(biāo)記物用以診斷和評估預(yù)后，并通過抑制端粒酶活性來治療腫瘤已成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。本文就端粒酶的結(jié)構(gòu)和功能及其有肺癌診斷方面應(yīng)用的研究近況作一綜述。
端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能簡介
端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種富含鳥嘌呤的DNA-蛋白復(fù)合體，是維持染色體結(jié)構(gòu)完整所必需的。端粒的DNA和多種蛋白質(zhì)成分組成。人體端粒DNA由6個核苷酸重復(fù)序列TTAGGG組成。端粒可保護(hù)染色體末端不被降解，防止染色體相互融合、重組，減數(shù)分裂時維持染色體正確的配對移動，并能防止DNA復(fù)制時末端序列的丟失，提高一些物種有絲分裂時染色體分離的精確性。因此，一旦端粒功能喪失，將導(dǎo)致染色體末端融解，出現(xiàn)雙著絲粒，有絲分裂不穩(wěn)定和細(xì)胞死亡[1]。
端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，由結(jié)構(gòu)RNA和蛋白組成，可調(diào)控端粒的復(fù)制，能以端粒的3’端為引物，自身的RNA組分為模板，從頭合成端粒以修被細(xì)胞分裂時染色體末端（端粒）的縮短。在人體端粒酶布端粒酶RNA成分（hTR）、催化亞單位（hTERT/hEST2）和端粒相關(guān)蛋白1（TEP1）三個亞單位組成[2，3]。HTR是端粒DNA合成的模板，hTERT/hEST2是決定端粒酶活性的限速決定子，TEP1的功能尚未完全闡明，可能不僅是一個結(jié)構(gòu)蛋白，還可能是介導(dǎo)端粒酶與其它分子相互作用的調(diào)節(jié)亞單位。
端粒酶與腫瘤發(fā)生
盡管導(dǎo)致腫瘤的詳細(xì)過程尚未完全清楚，但已經(jīng)明確腫瘤發(fā)生需要有基因異常改變的積累。新近提出了腫瘤形成的新理論，即端粒-端粒酶假說[4]，通過端粒及端粒酶，將細(xì)胞衰老與腫瘤緊密聯(lián)系起來。該假說的提出主要基于以下發(fā)現(xiàn)：①正常體細(xì)胞隨年齡的增加端粒逐漸縮短；②胚系細(xì)胞及胚胎組織端粒酶活性陽性，同時具有較長的端粒；③大部分腫瘤細(xì)胞端粒較短，端粒酶活性升高；④老年人易患腫瘤。端粒-端粒酶的激活使端粒長度得以穩(wěn)定，細(xì)胞獲得無限增殖能力，成為永生細(xì)胞（immortal cells），而獲得永生性是細(xì)胞惡變的關(guān)鍵步驟。端粒酶的激活究竟是通過何種機(jī)制使細(xì)胞獲得永生的呢？當(dāng)抑癌基因p53和Rb發(fā)生突變或癌基因如Ha-ras激活，或細(xì)胞受到腫瘤病毒/病毒蛋白（如HPV、E6/E7、E1A/E1B、SV40T抗原和EB病毒）作用時，細(xì)胞可越過第一致死期（M1）繼續(xù)分分裂，端粒長度繼續(xù)縮短，最終進(jìn)入第二致死期（M2）。目前對于如何越過M2期的機(jī)制知之甚少，但此階段與端粒酶活性的表達(dá)密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證明SV40T抗原、EB病毒、E6/E7以及突變的p53轉(zhuǎn)染后的初級細(xì)胞可以延長壽命，培養(yǎng)一段時期后，大部份獲得永生，繼續(xù)生長。已發(fā)現(xiàn)E6能直接誘發(fā)死亡前細(xì)胞的低水平的端粒酶活性；突變型p53轉(zhuǎn)染人乳腺上皮細(xì)胞，可以激活其端粒酶而獲得永生；B淋巴細(xì)胞用EB病毒轉(zhuǎn)染后可以穩(wěn)定縮短的端粒和表達(dá)端粒酶活性[5，6]。從端粒-端粒酶假說可以看出，端粒酶對腫瘤研究有兩方面的意義：一是端粒酶可能是惡性腫瘤的標(biāo)記物，可用于診斷；二是它與腫瘤的生成的增殖有關(guān)，端粒酶可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。
最近有些研究對腫瘤形成的端粒-端粒酶理論提出了挑戰(zhàn)。有學(xué)者通過基因操作破壞培養(yǎng)的癌細(xì)胞系端粒酶功能，發(fā)現(xiàn)一些癌細(xì)胞卻具有正常甚至較長的端粒[7]�；蚯贸╧nock out）去掉端粒酶活性的種系鼠，仍能正常生活和生育，并能發(fā)生癌變[8]。提示真核細(xì)胞可能通過端粒酶旁路途徑維持端粒的DNA復(fù)制。由此看來，細(xì)胞的永生化以及癌變的形成以端粒酶途徑為主（85%~95%惡性腫瘤端粒酶活性陽性），也存在非端粒酶途徑。
端粒酶活性的檢測
以往檢測端粒酶活性的方法繁瑣，組織需求量大，所得信號弱。1994年Kim等[9]報道了以PCR為基礎(chǔ)的端粒重復(fù)擴(kuò)增法（telmeric erpeat amplification protocol,TRAP），以端粒酶合成引物作為模板用于擴(kuò)增，大大改進(jìn)了以往的測定方法。由于該法簡單、敏感性高，有力地推動了端粒酶表達(dá)的研究。盡管測定端粒酶活性的擴(kuò)增方法直接且應(yīng)用相對容易，但是人們?nèi)院荜P(guān)心各個實(shí)驗(yàn)室之間的差異。最近不少學(xué)者[10，11]對TRAP法進(jìn)行了改進(jìn)，包括設(shè)立內(nèi)對照（internal standard），可以達(dá)到半定量或定量測定水平，并可以檢測可能存在于某些組織提取物中的擴(kuò)增抑制劑。此外Gelmini等[12］報道了一種新的改良的快速定量非同位素法，該法使用敏感的DNA的熒光PicoGreen染料，通過測量在端炷酶反應(yīng)和PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的雙鏈DNA含量而對端粒酶含量進(jìn)行定量測定，是測定端粒酶較精確、快速的方法。目前可對大多數(shù)病理標(biāo)本（包括脫落細(xì)胞、針吸標(biāo)本、體腔積液和手術(shù)切除標(biāo)本等）進(jìn)行端粒酶活性測定，還有學(xué)者報道了原位TRAP法，可對細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行定位測定[13]。
大多數(shù)正常體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶活性，但胚系細(xì)胞以及小腸的腺腔都能檢測到端粒酶活性，正常的白細(xì)胞也表達(dá)低水平的端粒酶活性，而正常的睪丸和卵巢組織卻表達(dá)高水平的端粒酶活性，且源于苗勒氏管上皮的宮頸、子宮內(nèi)膜以及輸卵管也能檢測到端粒酶活性。另外，半數(shù)的肝炎組織以及絕大多數(shù)肝硬化組織中也能檢測出弱陽性的端粒酶活性[14-16]。Feng等[17]克隆了人類端類酶RNA，發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)的hTR較正常體細(xì)胞和端粒酶陽性組織高得多。端粒酶活性大多數(shù)常見的癌癥，如前列腺、乳房、結(jié)房、結(jié)腸、肺和肝等癌癥均可測得，其陽性率為85%～95%[4]。
端粒酶活性測定在肺癌診斷中的應(yīng)用
肺癌手術(shù)標(biāo)本端粒酶活性測定肺癌手術(shù)標(biāo)本不受取材的限制，能較客觀地反映肺癌組織端粒酶的活性情況。Hiyama等[18]用TRAP法測定了136例原發(fā)性肺癌的手術(shù)切除標(biāo)本癌組織端粒酶活性，其陽性率80.1%(109/136),而正常鄰近組織標(biāo)本的端粒酶活性陽性率僅為4.4%（3/68）。小細(xì)胞肺癌端粒酶活性均為陽性（11/11），非小細(xì)胞肺癌的端粒酶活性呈高水平見于有肺癌轉(zhuǎn)移破壞者。Albanell等[19]也測定了99例非小細(xì)胞肺癌手術(shù)標(biāo)本，其陽性率為85%（84/99），特異性為100%。由此可見，端粒酶測不出或活性很低的非小細(xì)胞肺癌可能含有非永生性癌細(xì)胞，而高活性的小細(xì)胞肺癌可能主要含有永生細(xì)胞。由于肺癌標(biāo)本有很高的端粒酶陽性率和特異性，故測定端粒酶活性可以作為肺癌診斷的標(biāo)記物。此外，測定切緣肺組織或淋巴結(jié)的端粒酶活性可能有助于判斷癌組織是否切除徹底。
肺癌支氣管沖洗液端粒酶活性測定 肺癌支氣管沖洗液是經(jīng)纖維支氣管鏡比較容易獲得的標(biāo)本，通常用于細(xì)胞學(xué)檢測，但往往陽性率比較低。Arai等[20]用TRAP法測定了肺癌病人支氣管肺泡灌洗液的端粒酶活性，37例中29例（79%）陽性，而細(xì)胞學(xué)僅24例（67%）陽性。細(xì)胞學(xué)和端粒酶聯(lián)合檢測其陽性率高達(dá)89%，表明支氣管肺泡灌洗液端粒酶測定尤其是結(jié)合細(xì)胞學(xué)檢測有很好的應(yīng)用價值。最近Yahata等[21]聯(lián)合應(yīng)用以細(xì)胞抽提為基礎(chǔ)的TRAP法和用于測定細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的原位TRAP法檢測支氣管沖洗液標(biāo)本的端粒酶活性，對肺癌診斷的陽性率為82%（18/22），而用同樣的標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查陽性率僅為41%，兩者有顯著性差異（P＜0.01）。因此，聯(lián)合慶用支氣管沖洗液標(biāo)本的端粒酶活性檢測與細(xì)胞學(xué)檢查，可大大增加對肺癌診斷的可靠性。
肺癌胸水標(biāo)本端粒酶活性測定肺癌和結(jié)核性胸膜炎均常出現(xiàn)胸腔積液，有時兩者的鑒別較困難，有必要尋找更為可靠的診斷方法。Hiyama等[18]用TRAP法測定了3例肺癌病人的胸水端粒酶活性，結(jié)果均為陽性，最近Yang等[22]測定了144例胸腔積液病人胸液端粒酶活性，結(jié)果顯示70例惡性胸水中64例陽性，52例非惡性胸水中僅3例陽性，22例未經(jīng)證實(shí)而疑為惡性胸水的病人中有20例陽性，端粒酶活性測定對惡性胸水診斷的敏感性為91.4%,特異性為94.2%，陽性和陰性預(yù)計值分別為0.96、0.89。提示端粒酶活性測定可作為胸腔生活會液有效的診斷和鑒別診斷的輔助方法。
肺癌纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本端粒酶活性測定 經(jīng)纖維支氣管鏡活檢是肺癌診斷的重要手段，因其創(chuàng)傷小、安全、可靠，被廣泛應(yīng)用于臨床。但目前尚未見纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本端粒酶活性測定的報道。根據(jù)對端粒酶的認(rèn)識，推測用纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本本端粒酶活性測定結(jié)合其組織學(xué)檢查有可能有效地提高肺癌診斷的陽性率和可靠性。
肺癌針吸標(biāo)本端粒酶活性測定 針吸細(xì)胞學(xué)是一種創(chuàng)傷小、簡單易行的診斷方法，對于靠近胸壁的肺部腫塊有較高的診斷價值，但是單憑細(xì)胞學(xué)其診斷的準(zhǔn)確性和可靠性有限。Sugino等[23]測定了乳腺針吸標(biāo)本的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)15例細(xì)胞學(xué)陽性的乳腺癌中10例端粒酶活性測定陽性，而29例良性乳腺病變中26例端粒酶活性測定陰性。Aogi等[24]也發(fā)現(xiàn)組織學(xué)肯定為甲狀腺惡性腫瘤者的針吸標(biāo)本有83.3%（5/6）端粒酶活性陽性，良性腫瘤僅8.3%陽性，表明針吸標(biāo)本端粒酶活性測定對良、惡性腫瘤的判斷有較高的實(shí)用價值。盡管目前尚未見關(guān)于肺癌針吸標(biāo)本端粒酶活性測定的報道，預(yù)測可能有較好的診斷價值，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
端粒酶活性測定對判斷肺癌惡性程度和病理分期的價值 albanell等[19]的研究表明，端粒酶活性水平與非小細(xì)胞肺癌腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、K-67免疫染色（腫瘤細(xì)胞增殖的指標(biāo)）呈顯著正相關(guān)，與病人的年齡呈負(fù)相關(guān)。Yashima等[25]發(fā)現(xiàn)，除了類癌樣瘤和壞死的鱗狀細(xì)胞癌的角化部位），大支氣管基底膜上皮細(xì)胞組織學(xué)正常者26%呈弱陽性，有增生者71%呈弱陽性，23%外周肺標(biāo)本呈弱陽性，上皮進(jìn)一步的病理演變（化生、非典型增生和原位癌）與端粒酶的失調(diào)有關(guān)。由此可見端粒酶活性測定對判斷肺癌的惡性程度和病理分期有重要的價值。
端粒酶對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值淋巴結(jié)是肺癌常見的轉(zhuǎn)移部位，明確淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移對于制定治療方案很有幫助。Yashima等[26]研究發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)陰性的淋巴結(jié)96%表達(dá)低水平的端粒酶活性（均值3.0U/ug蛋白），可能是由于激活的淋巴細(xì)胞表達(dá)了端粒酶活性；所有的惡性淋巴結(jié)構(gòu)均表達(dá)較高水平端粒酶活性（均值17.8U/ug蛋白），兩組差異有顯著性。此外，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞原位hTR表達(dá)相對較高，繼發(fā)性濾泡發(fā)生中心hTR表達(dá)較低。由此可見，盡管激活的淋巴細(xì)胞端粒酶的表達(dá)限制了其應(yīng)用，端粒酶活性的測定結(jié)合原位雜交法測定hTR仍有助于淋巴結(jié)的組織病理學(xué)診斷。
結(jié) 語
現(xiàn)已證實(shí)端粒酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，現(xiàn)有的研究結(jié)果初步顯示，端粒酶活性測定對于肺癌的診斷有良好的應(yīng)用前景。但是有些問題仍需解決：所用的端粒酶活性測定方法費(fèi)用偏高，操作過于繁復(fù)，設(shè)備要求也較高，不利于臨床推廣應(yīng)用；目前文獻(xiàn)報道所用方法多為定性或半定量測定，容易受一些具有弱陽性表達(dá)的細(xì)胞如支氣管基底膜上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的影響而可能出現(xiàn)假陽性，開發(fā)更簡便易行的端粒酶定量測定方法，便于區(qū)分不同程度上皮病理變化（化生、非典型增生和原位癌）和肺癌之間的界限；對各種不同的標(biāo)本，尤其是便于獲取的標(biāo)本如痰液、胸水進(jìn)行大系列的研究，將進(jìn)一步提高端粒酶活性對肺癌的診斷價值。
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