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摘要: 唑類抗真菌藥耐藥的念珠菌株呈現(xiàn)增多趨勢，許多學(xué)者從不同方面進行了研究。綜述念珠菌對唑類藥物的耐藥現(xiàn)象和耐藥產(chǎn)生的相關(guān)因素，以及對耐藥機理從基因水平進行研究的新進展。
隨著抗真菌藥的臨床應(yīng)用，耐藥菌株逐漸產(chǎn)生。近年來有關(guān)對真菌藥物耐受的念珠菌報道增多，已引起醫(yī)學(xué)界和藥學(xué)界廣泛關(guān)注，許多學(xué)者對此進行了深入探討和研究。
一、念珠菌對唑類藥物的耐藥現(xiàn)象
�。ㄒ唬┠退幘甑脑龆嗯c傳播：HIV感染、器官移植、惡性腫瘤患者，由于免疫功能低下或抑制，易伴發(fā)條件致病性感染特別是真菌感染，60%～80%艾滋病患者有一種或幾種真菌感染。唑類藥物廣泛用于臨床治療和預(yù)防，由于長期反復(fù)和大劑量應(yīng)用，耐藥菌株和發(fā)生率日趨升高。據(jù)報道法國Pasteur醫(yī)院和其它幾個研究中心1994年分離自艾滋病患者的念珠菌株10%對氟康唑耐藥[1]。而新近的統(tǒng)計資料顯示，在艾滋病患者口咽感染念珠菌中，33％以上是耐藥菌株，對氟康唑的最小抑菌濃度（MIC）＞12.5μg/ml（敏感菌株MIC值一般＜4μg/ml）[2]。
Dromer等報道在10對已保持性關(guān)系專一并穩(wěn)定1年以上的HIV陽性伴念珠菌感染的患者中，有13例口咽分離的感染菌株對氟康唑耐藥。從未用過唑類藥物的5例患者，其性伴感染的念珠菌株卻均對氟康唑有耐藥性。進一步通過DNA限制性片段長度多態(tài)分析（RFLP）發(fā)現(xiàn)，這些感染菌株具有很近的種系關(guān)系，上述10對性伴中有6對的分離菌具有一個以上的相同克隆片段，因此可認為耐藥菌株可以通過性伴傳播[3]。
�。ǘ┠退幘陮蝾愃幬锞哂薪徊婺退幮裕篐e xiaoGang對分離自HIV感染者的212株白念珠菌（以下簡稱白念）研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株對氟康唑敏感，MIC值＜2μg/ml,這些菌株對伊曲康唑的MIC50及MIC90值也相應(yīng)較低,范圍在0.05μg～0.1μg/ml之間。另有61株對氟康唑敏感性較差，其MIC值為4μg～62μg/ml,MIC50及MIC90值分別是8μg/ml、64μg/ml；同時測得伊曲康唑?qū)@些菌株的MIC50和MIC90值分別是0.2μg/ml和0.4μg/ml。由此可見，這些菌株不但對氟康唑不敏感，對伊曲康唑的MIC50和MIC90值也相應(yīng)增高了約4倍。盡管臨床上尚未證實唑類藥物間的交叉耐藥性，但這項實驗室研究結(jié)果顯示了氟康唑與伊曲康唑間的交叉耐藥現(xiàn)象[4]。另有研究結(jié)果也支持這一論點，并進一步指出靶酶編碼基因和膜上轉(zhuǎn)運泵編碼基因的突變、缺失和過分表達是交叉耐藥產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。
�。ㄈ┠退幀F(xiàn)象導(dǎo)致了感染菌種的變遷：Price等對美國一家醫(yī)院1987至1992年5年間分離的念珠菌進行氟康唑體外敏感試驗，并對血標本中菌種的分布進行了氟康唑使用前后對比研究，發(fā)現(xiàn)MIC值具有明顯的種間差異，白念對氟康唑最敏感，而光滑念珠菌敏感性最差。這一結(jié)果與５年間菌血癥致病菌種的變遷相一致。在氟康唑使用前和使用初期，白念感染率為87%，但到1992年（氟康唑已廣泛應(yīng)用）只占感染菌株的31%。在此期間，光滑念珠菌的感染率由2%升到26%；熱帶念珠菌從2%升到24%；克柔念珠菌從9%升到20%。由此可見，隨著氟康唑廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了念珠菌菌血癥致病菌向非白念的變遷[6]。然而并非所有學(xué)者認為臨床治療可導(dǎo)致酵母感染菌種變遷。Sobel在10余年的臨床實踐中，對許多念珠菌性陰道炎患者盡管長期給予酮康唑治療，但并未發(fā)現(xiàn)引起陰道炎的酵母菌種發(fā)生改變[7]。
二、念珠菌對唑類藥物產(chǎn)生耐藥的相關(guān)因素
�。ㄒ唬┘毎庖叩拖禄蛉毕菀讓�(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生：對伴口咽念珠菌感染的HIV患者研究發(fā)現(xiàn)，細胞免疫降低者對念珠菌有易感性，同時在這些患者身上也易發(fā)生耐藥現(xiàn)象。在臨床治療失敗的病例中，測其MIC值明顯升高，且在CD4細胞數(shù)＜20μl患者身上耐藥顯著高發(fā)，提示耐藥的產(chǎn)生除與氟康唑的長期應(yīng)用有關(guān)外，CD4細胞數(shù)減少更易產(chǎn)生耐藥菌株[8]。Redding觀察1例反復(fù)發(fā)生口咽念株菌感染的患者，在2年反復(fù)14次治療中，氟康唑有效量由100mg/d快速升至800mg/d，MIC值亦由0.25μg/ml上升到＞64μg/ml。其間測得患者CD4細胞數(shù)是9/μl。在第15次再次發(fā)病時，氟康唑800mg/d已經(jīng)無效[9]。有學(xué)者推斷，免疫系 統(tǒng)嚴重缺陷可能阻止抗真菌藥物效應(yīng)的正常發(fā)揮。
�。ǘ┧幬锱c機體感染狀況對念珠菌耐藥有誘導(dǎo)作用：Vuffray等對口服氟康唑150mg/d已耐藥的口咽念珠菌感染的HIV患者改用更高劑量，其中91例次治療失敗者既往用藥的平均累積量是10600mg,而119例次治療有效的平均累積量是4400mg。兩者用藥累積量有顯著性差異（P＜0.001）。提示藥物的應(yīng)用與菌株耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[10]。Cameron等隨機選擇87例HIV陽性患者分組研究，對其中22例有口咽或食管感染癥狀和17例無癥狀的白念分離菌株進行唑類藥敏感試驗（兩組患者均有唑類藥應(yīng)用史），兩組MIC值有非常顯著性差異（P＜0.0001）；前者高于后者。接著又對分別來自未經(jīng)唑類藥治療的無癥狀和有癥狀患者的分離菌株進行MIC值對比分析，其P值＜0.0001，有癥狀者顯著高于無癥狀者。以上研究結(jié)果顯示藥物應(yīng)用史和感染癥狀與唑類藥物對其致病菌株的MIC值升高顯著相關(guān)。作者又對其余非白念菌株進行上述對比研究，結(jié)論相同[11]。
（三）菌株的耐藥性可能經(jīng)遺傳獲得：挪威學(xué)者對13株挪威念珠菌進行氟康唑藥敏試驗，其中11株分離自1990至1996年門診就醫(yī)的8例惡性病患者，其中僅2例有氟康唑治療史，另2株為60年前的保藏菌。結(jié)果對所有菌株MIC值均＞32μg/ml。60年前的保藏菌株和未經(jīng)治療者的致病菌株亦出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，提示耐藥并非均為唑類藥物應(yīng)用所誘導(dǎo)，菌株的耐藥性很可能具有遺傳性[12]。有研究推測這些耐藥表型至少可以穩(wěn)定600代[13]。
因而，患者最初感染的可能即為具有遺傳穩(wěn)定性的耐藥菌株，也可能在長期唑類藥臨床應(yīng)用中由敏感菌株突變成為耐藥菌株。耐藥的產(chǎn)生與許多已知和未知的因素有關(guān)，但藥物的長期反復(fù)治療和預(yù)防應(yīng)用起著關(guān)鍵作用。因此有學(xué)者指出應(yīng)最大限度地避免上述用藥方式。并提出兩條防止和延緩耐藥產(chǎn)生的措施：①短期大劑量用藥以盡快有效地殺滅真菌，降低耐藥突變的發(fā)生率。②對于唑類耐藥的菌株，除了加大劑量外，適時換用其它藥物也是非常必要的[14]。
三、念珠菌對唑類藥物的耐藥機理
迄今為止，多數(shù)學(xué)者認為念珠菌對唑類藥物的耐藥主要通過以下三條途徑：①細胞膜對唑類藥物通透性改變，細胞攝取和蓄積的藥物量降低。②藥物作用的靶酶C-14去甲基化酶（14DM）產(chǎn)生過多。③靶酶對藥物的親和力降低。后二條可歸納為唑類藥物作用靶酶的改變。通常認為，膜通透性的改變起更重要的作用。有學(xué)者對敏感和耐藥的光滑念珠菌研究發(fā)現(xiàn)，對3H標記的氟康唑，敏感菌株攝入率是0.33±0.02pmol/min，耐藥菌株幾乎不能顯示熒光攝入。同時測兩者IC50（50% inhibition of incorporation）值相近，IC50反映藥物對靶酶抑制作用，靶酶改變無明顯差異。說明膜通透性改變在耐藥產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[15]。
�。ㄒ唬⿲Π忻缸兓难芯浚哼蝾愃幬镒饔玫陌兴崾悄こ煞蛀溄枪檀己铣芍胁豢扇鄙俚闹虚g合成酶，唑類藥物對此具有強的親和性，從而抑制酶的催化活性，麥角固醇合成受阻，胞膜結(jié)構(gòu)破壞，真菌生長抑制。靶酶結(jié)構(gòu)改變以及其過度表達均可導(dǎo)致念珠菌耐藥，許多學(xué)者對這一耐藥機理進行了研究。
從理論上講，靶酶編碼基因Erg16的擴增可致其過度表達。Sanglard等人用URA3-14DM雜交基因探針對分離自5例艾滋病患者的16株白念進行DNA分析，結(jié)果無論耐藥還是敏感菌株，其靶酶基因Erg16的拷貝數(shù)均無變化。因而推測靶酶的過度表達并非由基因Erg16的擴增所致。Sanglard又采用Northern blot方法對耐藥和敏感菌株靶酶的mRNA含量進行測定。發(fā)現(xiàn)大部分mRNA含量高的菌株，其MIC值相應(yīng)增高。但有1株靶酶mRNA含量高的菌株，MIC值卻顯著低于另1株mRNA含量低的菌株。因而僅用靶酶mRNA含量升高只能部分地解釋耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生[16]。由靶酶過分表達而耐唑類藥物的實驗室依據(jù)有待進一步深入探討。
White曾對17株白念Erg16基因進行分析，該基因含有始動區(qū)域的5個片段（PA～PE），編碼區(qū)域的7個片段和終止區(qū)域的3個片段（TA～TC）。利用PCR-SSCP技術(shù)對這些片段擴增后行序列分析。與敏感菌株相對照，耐藥菌株在編碼區(qū)域第7片段近3’端的1547位點發(fā)生堿基突變，鳥嘌呤（G）由腺嘌呤 （A）取代，相應(yīng)地Erg16編碼蛋白質(zhì)也發(fā)生改變，位于467位點的精氨酸（Arg）由賴氨酸（Lys）替代。這一位點正處于靶酶的活性中心，它改變了酶的活性，也引起菌株對唑類的耐藥。對PE片段位點-367至-284序列分析發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株可以有多處等位基因異質(zhì)性（heterogenicity），并在-284位點有等位基因缺失突變。推測可能與基因重組和基因轉(zhuǎn)換有關(guān)，這些突變基因與菌株對唑類耐藥有關(guān)[17]。
（二）細胞膜對唑類藥物通透性改變是真菌耐藥的一個主要因素：有實驗測知敏感白念菌株胞內(nèi)唑類濃度是胞外的2.5倍以上，而耐藥菌株胞內(nèi)僅是胞外的1/2。耐藥菌株膜通透性的改變，主要依賴膜上兩種蛋白泵的功能改變。一種泵是ATP能量依賴型的多藥載體（亦稱ABC transporters） ，進行能量依賴的主動運輸；另一種泵簡稱BEN，通過電化學(xué)勢能進行被動運輸，屬于非能量依賴型載體。這兩種與耐藥有關(guān)的載體被劃屬于ABC超家族和MF超家族[16]。這兩種泵將細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞外。研究發(fā)現(xiàn)，膜對唑類通透性降低不是由于藥物攝入的減少，而是由胞內(nèi)泵出藥物的增多，即兩種泵功能的增強與耐藥密切相關(guān)。
有學(xué)者對這兩種蛋白泵的基因進行分析，在分離自5例艾滋病患者的17株白念中，菌株2號、3號、16號、17號的MIC值較基余菌株有明顯升高。用斑點雜交的方法檢測兩種蛋白泵基因CDR（編碼ABC蛋白泵）和MDR（編碼BEN蛋白泵）的mRNA水平。結(jié)果CDR的mRNA水平在16和17號菌株比在1～15號菌株約增高5倍。MDR的mRNA水平基本呈現(xiàn)隨MIC值而升高的趨勢，第1株反映mRNA水平的熒光信號很弱，mRNA水平很低，2號和3號菌株熒光信號大大增強，mRNA水平分別是1號的12倍和25倍。因此推測蛋白泵的mRNA水平升高是耐藥的分子生物學(xué)改變[5]。進一步分析認為轉(zhuǎn)錄水平的升高和mRNA加帽和多聚尾的修飾改變可能是mRNA含量升高的主要原因。也有學(xué)者認為一些開放閱讀框架（ORFs，編碼氨基酸的三聯(lián)體長鏈，無終止密碼子，是基因存在的區(qū)域）可能與ABC和MF兩家族的基因編碼有關(guān)。Alarco的研究結(jié)果顯示對白念MF家族的編碼基因BEN的啟動子AP1的過分表達可致菌株耐藥，但開放閱讀框架有缺失突變時該菌株的耐藥性可被大大地抑制或消失。FLR1（Fluconazole resistance 1）的表達又受AP1蛋白的調(diào)節(jié)，F(xiàn)LR1的表達可被AP1的過分表達所誘導(dǎo)。因而FLR1，這個編碼MF家族多藥載體的開放閱讀框架可能是受AP1蛋白調(diào)控的一種決定菌株耐藥性的分子因素[18]。
上述研究顯示，在菌株產(chǎn)生耐藥過程中，可能通過三條耐藥途徑，也可能主要通過一條途徑。但耐藥機理的闡明尚需多方面拓寬和深入研究。
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