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內(nèi)容提要 目的：在細(xì)胞水平探討中藥復(fù)方肝豆湯治療肝豆?fàn)詈俗冃缘臋C理。方法：通過建立23例肝豆?fàn)詈俗冃云つw成纖維細(xì)胞模型，觀察加入含肝豆湯兔血清前后細(xì)胞內(nèi)Cu2＋、Zn2＋等微量元素含量的變化。結(jié)果：加入含肝豆湯兔血清前與加入24h后相比較，細(xì)胞內(nèi)銅含量從(80.94±34.76)ng/mg，減少到(46.90±22.14)ng/mg(P＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)鋅含量從(140.43±33.81)ng/mg，增加到(151.43±37.83)ng/mg(P＜0.01)。結(jié)論：肝豆湯具有顯著的細(xì)胞內(nèi)排銅作用和使細(xì)胞內(nèi)鋅含量增加的作用。
Effect of Gandou Decoction on Copper Metabolism of Skin Fibroblast of Hepatolenticular Degeneration Model
Objective: To explore the cytological mechanism of Gandou Decoction (GDD) in treating hepatolenticular degeneration (HLD).Methods: Twenty-three in vitro models of cultured skin fibroblast of HLD were established to observe the intracellular change of microelements (Cu2＋， Zn2＋, etc.) content before and after adding rabbit′s serum containing GDD.Results: After being treated with GDD contained serum for 24 hours, the intracellular content of Cu2＋ decreased from (80.94±34.76) ng/mg to (46.90±22.14) ng/mg, P＜0.01, while that of Zn2＋ increased from (140.43±33.81) ng/mg to (151.43±37.83) ng/mg, P＜0.01.Conclusion: GDD is quite effective in removing the intracellular copper and increasing the intracellular zinc.
Key words hep atolenticular degeneration, Gandou decoction, model of cultured skin fibroblasts of hepatolenticular degeneration, rabbit serum containing Gandou decoction, intracellular contents of copper and zinc
肝豆?fàn)詈俗冃?HLD)又稱Wilson病，是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。本病由于銅離子緩慢地在肝、腦、腎等全身各器官廣泛沉積，出現(xiàn)錐體外系及肝癥狀等復(fù)雜多樣的臨床表現(xiàn)。因此HLD患者須終身使用驅(qū)銅藥物以糾正體內(nèi)Cu2＋離子的正平衡。目前國內(nèi)外使用的青霉胺等驅(qū)銅藥物雖可獲得一定療效，但有較多的近期或遠(yuǎn)期毒副作用，使部分患者被迫放棄長期維持治療。楊任民等于70年代首創(chuàng)中藥復(fù)方肝豆湯治療HLD，初步獲得了較好的排銅效果，且在20余年的臨床應(yīng)用中不斷合理調(diào)整組方，取得了較為滿意的臨床療效(1，2)。本研究通過以HLD患者皮膚制備的HLD皮膚成纖維細(xì)胞模型(以下簡稱細(xì)胞模型)中加入含肝豆湯兔血清(以下簡稱含藥血清)，觀察加入含藥血清前后細(xì)胞模型中銅、鋅等微量元素含量的變化，以探討肝豆湯在細(xì)胞水平的排銅效果，進(jìn)一步闡明肝豆湯的排銅機理。
材料與方法
1 材料 隨機選取臨床表現(xiàn)及銅代謝檢查全部符合診斷標(biāo)準(zhǔn)(3)的23例HLD住院患者。其中男18例，女5例；年齡8～40歲，平均(22.43±9.19)歲。隨機選取雄性成年新西蘭白兔10只，體重(3.0±0.1)kg。實驗動物由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。
2 方法
2.1 含藥血清制備 按肝豆湯組方(大黃8g黃連10g 黃芩10g 半枝蓮15g 澤瀉15g 魚腥草15g)分別準(zhǔn)確稱取大黃等6味中藥煎煮，制備成不含大黃或僅含大黃或含大黃的肝豆湯分別用真空冷凍干燥系統(tǒng)濃縮至各約150ml。以肝豆湯中的君藥大黃的有效成分之一大黃酚為代表成分判斷肝豆湯血藥濃度(4)。隨機選取5只新西蘭白兔，每只兔先灌服不含大黃的肝豆湯濃縮液30ml，24h后再灌服等量僅含大黃的肝豆湯濃縮液，24h后再灌服等量含大黃的肝豆湯濃縮液。每隔30min采血2ml以HPLC(Beckman公司)檢測(5)。求取兔一次灌服肝豆湯后血藥濃度及達(dá)峰時間。次日開始逐日每只灌服肝豆湯濃縮液30ml，每日首次灌藥后于達(dá)峰時間采血2ml檢測。達(dá)穩(wěn)態(tài)濃度后于第10日在首次灌藥后達(dá)峰時間采血制備含藥血清(6)。隨機選取5只新西蘭白兔，實驗前禁食1天，按上法制備空白血清。
2.2 肝豆湯細(xì)胞藥理學(xué)實驗 從HLD患者取皮膚進(jìn)行離體皮膚成纖維培養(yǎng)制備HLD細(xì)胞模型。細(xì)胞培養(yǎng)參照陳秀珍等方法(7)。待細(xì)胞總數(shù)達(dá)10５～10６個，可檢測出細(xì)胞內(nèi)Cu2＋、Zn2＋含量，此即構(gòu)成1個細(xì)胞模型。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，可同時建立多個相同的細(xì)胞模型。采用改良Loway法(7)計算細(xì)胞模型總蛋白含量及Cu2＋、Zn2＋含量。以細(xì)胞模型Cu2＋、Zn2＋含量與總蛋白含量的比值(ng/mg)作為細(xì)胞模型Cu2＋、Zn2＋含量測定值。從23例細(xì)胞模型中隨機選取5例，每例含6個相同的細(xì)胞模型。分別加入含藥血清及空白血清各0.04、0.4、4.0ml(分別含大黃酚0.04、0.4、4.0μg)，重新培養(yǎng)24h后檢測Cu2＋含量，根據(jù)結(jié)果確定最適加藥劑量。仍取上述5例細(xì)胞模型，每例含14個相同細(xì)胞模型。每7個相同細(xì)胞模型為1組。分別加入等量含藥血清及空白血清(加入量取上述最適加藥劑量)。重新培養(yǎng)4、8、16、24、32、40、48h測定Cu2＋含量，根據(jù)結(jié)果確定加入含藥血清后最佳收集細(xì)胞時間。肝豆湯對23例細(xì)胞模型的療效：每例3個相同細(xì)胞模型，將23例細(xì)胞模型平行分為3組，每組含23個細(xì)胞模型，一組未加血清，另兩組分別加入等量含藥血清及空白血清，重新培養(yǎng)后測定其Cu2＋、Zn2＋含量。
結(jié) 果
1 含藥血清血藥濃度 兔一次灌服肝豆湯血藥濃度檢測結(jié)果顯示，大黃酚的吸收峰與 其他成分吸收峰分離良好，表明肝豆湯中非大黃的其他成分，空白血清中的成分及大黃中非大黃酚的成分對大黃酚的檢測均無干擾。將血藥濃度測定值與對應(yīng)時間數(shù)據(jù)按中國藥學(xué)會數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會的實用藥代動力學(xué)計算程序3P87進(jìn)行處理，得到如下藥代動力學(xué)參數(shù)：半衰期T1/2(ke)＝6.3596h，達(dá)峰時間T(peak)＝2.7816h，最大血藥濃度Cmax＝0.9489μg/ml。次日開始逐日灌服肝豆湯濃縮液，理論上達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度時間為5T1/2(ke)≈32.8h。根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行推算穩(wěn)態(tài)血藥濃度C＝FX/vkt≈1.01μg/ml。5只兔血藥濃度測定均值第1～9天分別為1.0213、1.0065、1.0702、1.0800、1.1005、1.1026、1.0907、1.1036、1.1042μg/ml。測定值與理論值接近。為盡量使肝豆湯中其他有效成分達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度，故延長灌藥時間到10天。第10日首次灌藥后2.7h取血制備含藥血清，血藥濃度測定值分別為1.1073、1.0802、1.0604、1.0538、1.1023μg/ml。對含藥血清和空白血清的Cu2＋含量進(jìn)行測定表明二者無顯著性差異。
2 肝豆湯細(xì)胞藥理學(xué)實驗 23例細(xì)胞模型隨機選取5例，以△Cu2＋比值(加空白血清Cu2＋比值－加含藥血清Cu2＋比值)為療效指標(biāo)，分別加入含藥血清及空白血清各0.04、0.4、4.0ml重新培養(yǎng)24h，其△Cu2＋比值分別為1.376、44.206、48.270ng/mg，表明加入0.4ml含藥血清時療效增加已較明顯，故取此量為最適加藥劑量。仍取上述5例細(xì)胞模型，分別加入0.4ml含藥血清及等量空白血清重新培養(yǎng)4、8、16、24、32、40、48h，其△Cu2＋比值分別為1.86、8.93、15.80、49.05、54.22、56.90、56.94ng/mg，表明加含藥血清重新培養(yǎng)24h療效已近最大。故取其為加含藥血清后最佳收集細(xì)胞時間。23例細(xì)胞模型平行分成3組，一組未加血清，另兩組分別加入0.4ml含藥血清及等量空白血清，重新培養(yǎng)24h，Cu2＋、Zn2＋含量測定結(jié)果通過配對t檢驗統(tǒng)計學(xué)處理表明：23例細(xì)胞模型加入肝豆湯后細(xì)胞內(nèi)Cu2＋含量較加藥前顯著減少(t＝9.736，P＜0.01)；細(xì)胞內(nèi)Zn2＋含量較加藥前顯著增加(t＝2.827，P＜0.01)；Cu2＋/Zn2＋比值較加藥前顯著下降(t＝9.11，P＜0.01)，見表1。
表1 23例細(xì)胞模型肝豆湯治療前后細(xì)胞內(nèi)
Cu2＋、Zn2＋含量比較 (±s)
組 別 Cu2＋比值(ng/mg) Zn2＋比值(ng/mg) Cu2＋/Zn2＋
未加血清 80.94±34.76* 140.43±33.81* 0.61±0.29*
加空白血清 78.71±33.59* 143.71±36.88* 0.59±0.28*
加含藥血清 46.90±22.14 151.43±37.83 0.34±0.20
注：與加含藥血清組比較，*P＜0.01
討 論
HLD雖已確定為常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病，但其確切的發(fā)病機制尚未完全闡明。Uzman推測HLD患者肝細(xì)胞內(nèi)可能存在一種與銅有特殊親和力的異常蛋白(8)。Shapiro和Erans先后用凝膠柱層析法在HLD患者肝細(xì)胞中分離出含銅較健康人高10倍以上的金屬巰蛋白(MT)(9，10)。近年在HLD離體培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了大量MT，其含銅量較正常對照組高數(shù)倍(11)。因細(xì)胞內(nèi)銅沉積部位在細(xì)胞漿和溶酶體(12)，更有人推測細(xì)胞內(nèi)銅傳遞鏈為：銅→大分子蛋白→金屬巰蛋白→溶酶體→排出細(xì)胞(13)�，F(xiàn)已確認(rèn)，HLD基因位于13號染色體長臂上(13q14.3)，編碼一種P型銅轉(zhuǎn)運ATP酶(ATPTB)(14，15)，稱ATPTB基因。故推測HLD患者是由于基因缺陷造成HLD細(xì)胞內(nèi)MT含量異常增高，因細(xì)胞內(nèi)MT具有原發(fā)性高銅親和力和對銅的高誘導(dǎo)性兩種異常(16)，使細(xì)胞內(nèi)銅離子蓄積，同時也引致掌管金屬代謝功能的細(xì)胞內(nèi)溶酶體障礙(17)。
安徽中醫(yī)學(xué)院肝豆研究組根據(jù)大多數(shù)患者具有眼黃、口苦口臭、尿黃便秘、舌質(zhì)紅、苔黃或黃膩、脈弦數(shù)或弦滑等癥候，依中醫(yī)辨證推斷：銅毒內(nèi)聚、肝膽濕熱內(nèi)蘊為其主要病機，故立清熱解毒、利膽燥濕，通腑利尿之法，同時結(jié)合現(xiàn)代HLD病理生理機制而取兼具利膽、高鋅低銅的中藥組成肝豆湯復(fù)方(1，2)。胡文彬等對34例HLD患者服肝豆片2號(與肝豆湯組方同)的臨床觀察表明(18)，肝豆湯確有顯著的向膽汁、大便及尿中排銅效果。臨床癥狀也獲得了改善。
本實驗結(jié)果進(jìn)一步表明，肝豆湯確有顯著的細(xì)胞內(nèi)排銅和使細(xì)胞內(nèi)鋅含量增加的作用，細(xì)胞內(nèi)Cu2＋、Zn2＋比值也顯著降低，從而在細(xì)胞水平進(jìn)一步證明了肝豆湯的確切療效，同時證明在肝豆湯的治療作用下，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)低銅高鋅的改善。有作者證明，HLD細(xì)胞模型在含藥血清作用下，細(xì)胞內(nèi)MT含量及MT結(jié)合銅的能力顯著下降。Menard等研究表明，食物中的銅和口服鋅劑誘導(dǎo)小腸粘膜細(xì)胞合成MT，通過鋅和銅與MT競爭性地結(jié)合，鋅劑可對組織中已沉積的銅具有間接的清除作用(19)。故推測除富含鋅的肝豆湯中的鋅離子可能通過載體蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，競爭與MT的結(jié)合而阻止銅在細(xì)胞水平的沉積，并促進(jìn)銅從細(xì)胞內(nèi)排出外，肝豆湯尚有降低細(xì)胞內(nèi)MT含量的作用，但其排銅的確切機制尚待進(jìn)一步探討。
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