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［摘要］ 目的：研究苦參素對成纖維細(xì)胞增殖、形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響，闡明其抗肝纖維化的作用機制。方法：用甲基噻唑基四唑MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)比色法、HE染色及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別檢測小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(NIH3T3)增殖、形態(tài)學(xué)及TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：苦參素能明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖及TGF-β1的表達(dá)，并呈劑量依賴性。結(jié)論：苦參素可通過抑制成纖維細(xì)胞增殖及TGF-β1的表達(dá)而起到抗肝纖維化作用。
Affect of kwoninone on fibroblastic proliferation, morphology and expression of TGF-β1
�。跘BSTRACT］ AIM:To study the affect of kwoninone on fibroblastic proliferation, morphology and expression of transforming growth factor-beta (TGF-β1) and elucidate its mechanism in fibrosis. METHODS: The proliferation, morphology and expression of TGF-β1 of fibroblast was measured by MTT bioassay, HE dyeing and immunocytochemistry. RESULTS: The kwoninone has an could significantly inhibit fibroblastic proliferation, growth and expression of TGF-β1 in concentration-dependent manner. CONCLUSION: The kwoninone anti-hepatic fibrosis effect through inhibiting fibroblastic proliferation, growth, and expression of TGF-β1.
�。跭EY WORDS］ kwoninone; fibroblasts; transforming growth factor beta; sophora subprastrata
苦參素(k woninone)，是從中藥廣豆根(Sophora Subpsostarata)中分離所得生物堿類，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗腫瘤等生物學(xué)作用［1］。近來有研究報道，用它治療慢性肝炎，可有效的降低ALT、改善臨床癥狀、并使乙型肝炎及丙型肝炎病毒標(biāo)志物轉(zhuǎn)陰、減輕炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死，另具有防治肝纖維化作用［2-4］。本研究以小鼠皮膚成纖維母細(xì)胞(NIH3T3)為靶細(xì)胞，從細(xì)胞及細(xì)胞因子水平研究苦參素對成纖維細(xì)胞增殖、生長及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響，以期從細(xì)胞及細(xì)胞因子水平闡述苦參素抗肝纖維化作用機制，為臨床用于肝纖維化的防治提供更多的理論基礎(chǔ)。
材料與儀器 靶細(xì)胞：NIH3T3細(xì)胞株(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)。苦參素注射液(2 mL:200 mg，批號980215，上海第一生化藥業(yè)公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶、甲基噻唑基四唑(MTT，華舜生物試劑公司)，二甲基亞砜(DMSO)，蘇木精染液，伊紅染液；TGF-β1免疫組織化學(xué)染色試劑盒，DAB顯色試劑盒。B5060EX二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司產(chǎn)品)，37XAZ倒置生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)，Olympus光學(xué)顯微鏡，DG-3022型酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子管廠)，YS-875A凈化工作臺。
方法
1 MTT法檢測不同濃度的苦參素對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響 用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，用含10%的小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋為單個細(xì)胞懸液(5×107個·L-1)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，同時每孔加入經(jīng)培養(yǎng)液倍比稀釋的苦參素100 μL，至苦參素終濃度分別為31.3，62.5，125，250，500，1000 mg·L-1，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔；并設(shè)對照孔3個，不加苦參素，而加入等量的培養(yǎng)液；另設(shè)空白對照孔3個，不加細(xì)胞，其他條件與前相同。同時，在相同條件下用同樣方法再接種另2塊96孔培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1，PBS)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上，選擇490 nm波長，以空白對照孔調(diào)零，檢測各孔光吸收值，將所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
2 苦參素對成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)及TGF-β1的影響 制細(xì)胞爬片：將生長良好的NIH3T3細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個·L-1，接種于含蓋玻片的2塊培養(yǎng)皿中，其中一塊加入苦參素使終濃度為500 mg·L-1，另一塊加入等量的培養(yǎng)液，放入CO2孵箱培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞基本長成單層，取出蓋玻片，95%乙醇固定。HE染色；TGF-β1免疫細(xì)胞化學(xué)染色：將經(jīng)苦參素處理和未處理的細(xì)胞爬片各一塊，滴加適當(dāng)稀釋的一抗(小鼠TGF-β1單抗)，37 ℃孵育1.5 h，0.01 mol·L-1的PBS洗2 min，2次；滴加山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育15 min，0.01 mol·L-1的PBS洗2 min，2次；滴加試劑APA-兔抗山羊IgG,37 ℃，20 min, 0.01 mol·L-1PBS洗5 min，4次。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒，取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察，照相保留結(jié)果。
3 統(tǒng)計學(xué)方法 t檢驗，P＜0.05為有顯著意義。
結(jié)果
1 苦參素對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的苦參素作用于NIH3T3細(xì)胞48 h后，平均每孔的吸光度如表1所示，當(dāng)苦參素濃度達(dá)到62.5 mg·L-1時，NIH3T3細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制(P＜0.05)，并呈劑量依賴性。
表1 MTT法檢測苦參素對NI H3T3細(xì)胞增殖
的影響(n=9,±s)
組別 濃度/mg·L-1 吸收度(OD)
對照 0 0.447±0.013
1 31.3 0.431±0.020a
2 62.5 0.338±0.014b
3 125 0.272±0.016c
4 250 0.221±0.019ce
5 500 0.199±0.021c
6 1000 0.179±0.020ce
各組與對照組比較經(jīng)t檢驗：aP＞0.05,bP＜0.05,cP＜0.01;4,6與2組間比較經(jīng)t檢驗：eP＜0.05。
2 苦參素對NIH3T3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 對照組細(xì)胞胞體較大，胞漿豐富，胞突多，呈多角型，胞核大，處于核分裂期細(xì)胞多�？鄥⑺靥幚斫MNIH3T3細(xì)胞胞體較小，胞突少，多呈梭型或圓形，胞核較小，處于核分裂期細(xì)胞較少。如圖1所示：
3 苦參素對成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響 經(jīng)TGF-β1免疫細(xì)胞化學(xué)法染色，在顯微鏡下可以觀察到，苦參素處理組成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒弱、量少，呈弱陽性；而正常對照組成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)呈強陽性，這說明苦參素能抑制成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示：
討論 肝纖維化發(fā)生的主要機制是肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度增多和異常沉積，這一過程是不斷變化的，重要的是肝臟多種細(xì)胞(如貯脂細(xì)胞)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，而后者又反過來影響細(xì)胞的發(fā)生、分化、增殖、粘附和表型的表達(dá)，這種相互作用又是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的。近年研究表明，貯脂細(xì)胞是肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源細(xì)胞［5］，在肝損傷時，貯脂細(xì)胞能合成除V型膠原外的幾乎所有的ECM成分，肝細(xì)胞壞死的刺激能激活貯脂細(xì)胞并使之增殖，貯脂細(xì)胞增殖后表型發(fā)生改變，顯著的表型變化使之轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維母細(xì)胞(myofibroblasts)和成纖維細(xì)胞，后者是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，對肝纖維化的形成起主要作用［6］。
近年研究也表明TGF-β1是促進(jìn)肝纖維化形成的一重要細(xì)胞因子，肝纖維化時，門脈周圍細(xì)胞、導(dǎo)管周圍細(xì)胞、肝小葉中央靜脈周圍細(xì)胞與肝包膜間質(zhì)細(xì)胞等部位TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄明顯增加［7］。TGF-β1的突出作用是促進(jìn)膠原與基質(zhì)的形成，同時抑制其降解。它還能促進(jìn)貯脂細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖；還可增加纖連蛋白(FN)及蛋白多糖(PG)的合成，并促進(jìn)FN和膠原在細(xì)胞外基質(zhì)中的沉積；此外TGF-β1還通過抑制膠原酶和蛋白酶的產(chǎn)生，以及促進(jìn)組織抑制因子(如金屬蛋白酶，α2巨球蛋白等前纖維蛋白溶酶抑制物)的分泌，來減少膠原的降解［8］。有研究表明肝纖維化時，肝臟間質(zhì)細(xì)胞如貯脂細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞(昔名枯否氏細(xì)胞)等通過自分泌或旁分泌TGF-β，調(diào)節(jié)貯脂細(xì)胞及肝細(xì)胞等合成細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化形成［9，10］。
本實驗以肝纖維化研究常用的模型細(xì)胞NIH3T3(小鼠皮膚成纖維母細(xì)胞)為靶細(xì)胞，研究苦參素對成纖維細(xì)胞增殖、形態(tài)學(xué)及TGF-β1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參素能抑制NIH3T3成纖維母細(xì)胞的增殖，并且呈劑量依賴性，同時受抑制的NIH3T3細(xì)胞胞體較小，處于核分裂期細(xì)胞較少；NIH3T3細(xì)胞表達(dá)TGF-β1減少。提示苦參素可通過抑制肝纖維化時細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)的增殖、生長及TGF-β1的表達(dá)，而起到抗肝纖維化作用。它也有可能阻止肝纖維化時貯脂細(xì)胞的活化和增殖，這仍需進(jìn)一步的研究證實，以闡明苦參素抗肝纖維化的機制。
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