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Kim［1］于1994年借助PCR技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測方法——端粒重復(fù)片段擴增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。我們對Kim的方法加以改進，建立了簡便、非同位素的銀染檢測法，檢測了腦瘤、腸癌、食管癌中端粒酶的活性。
一、材料與方法
1.總蛋白提取：手術(shù)后取下的活組織，液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L β-巰基乙醇；0.5% CHAPS，體積分數(shù)為10%的甘油。(2)組織中提取總蛋白：取約30 mg組織用無菌眼科手術(shù)剪盡量剪碎，加入200 μl提取液，冰浴30 min后，4 ℃ 1 600 g離心20 min。吸取上清約150 μl待測。
2.TRAP反應(yīng)：(1)引物及稀釋：RNA模板逆轉(zhuǎn)錄引物TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′18mer，MW=5 524，濃度為0.541 g/L。PCR引物CX：5′-CCTTACCCTTACCCTTACCC
TAA3′24mer,MW=7 104,濃度為0.688 g/L。(2)PCR擴增：①將Kim［1］的方法改進為：50 μl PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 μmmol/L dNTP;0.1 μgT4 g32 蛋白;0.1 μg/L牛血清白蛋白;0.1 μg TS引物;2 U Taqase;0.5～1.0 mg總蛋白。②25℃ 20 min，加入0.1 μg CX引物。③94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s→50℃ s→72℃90 s 30個循壞，72℃延伸10 min。
3.電泳:12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，取10 μl PCR產(chǎn)物，加2 μl 6×Lodding buffer,150 V恒壓2 h。
4.銀染:(1)固定：膠在10%冰乙酸中，洗1次。(2)銀染：0.2%AgNO3 300 ml，加入0.5 ml甲醛，染色10 min，洗1次。(3)顯色：3%Na2CO3 300 ml,加甲醛0.5 ml，顯色至清晰。(4)終止：10%冰乙酸300 ml，終止顯色。
二、結(jié)果
用非核素TRAP-銀染端粒酶活性檢測法分析45例手術(shù)標本，腦腫瘤陽性率為70.58%(12/17)，腸癌陽性率為84.62%(11/13)，食管癌陽性率為90%(9/10)，食管癌旁組織陽性率為90%(4/5)，用2種方法對15例標本對比檢測，TRAP-ELISA法檢出9例陽性，TRAP-銀染法檢出9例陽性 ，結(jié)果一致。
三、討論
端粒酶活性檢測常用Kim［1］的TRAP法，在PCR過程中摻入同位素標記α-32P dGTP/dCTP，產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示相差6個核苷酸的DNA ladder條帶，以判斷端粒酶活性。該方法敏感，已被國際上多家實驗室采用，但由于應(yīng)用核素，造成檢測周期長(約7周)，污染環(huán)境，要求有特殊而專一的實驗室，使其 廣泛應(yīng)用受到限制。為此，我們對Kim［1］的方法進行改進，建立了不需加入核素，直接進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物電泳后硝酸銀染色，顯示DNA梯狀電泳帶的方法。同時應(yīng)用保靈曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法，對照檢測。兩種方法對比檢測結(jié)果一致。說明我們的方法同樣敏感、準確，且簡便易推廣。
端粒是真核細胞染色體末端的“帽子”，由多拷貝串聯(lián)的6核苷酸5′TTAGGG3′重復(fù)序列和特異蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成，具有維持染色體末端穩(wěn)定和遺傳信息不丟失的功能。按照DNA復(fù)制模型，DNA復(fù)制1次，母鏈5′端就有1段DNA無法拷貝到子鏈中去，將造成DNA鏈愈來愈短，遺傳信息丟失。真核生物線性DNA分子靠末端6核苷酸多拷貝序列(既端粒)和端粒酶的激活，保證遺傳信息復(fù)制時的完全性。細胞生命周期有限 ，染色體端粒隨細胞的分裂不斷丟失，當端粒長度減小到一定臨界值(2～4 kb)時，細胞即趨向衰老、死亡。端粒被認為是細胞有絲分裂的“生物鐘”［2］。有報道癌細胞和培養(yǎng)的永生化細胞有較短的端粒長度和較強的端粒酶活性，正常體細胞檢測不到端粒酶活性，而生殖細胞、胚胎細胞有端粒酶表達，可見端粒酶催化合成端粒的重復(fù)片段添加到端粒，對維持細胞端粒的動態(tài)平衡、保證細胞的分裂能力起重要作用［3，4］。我們檢測17例腦腫瘤中有13例腦膠質(zhì)瘤、10例端粒酶陽性，其中惡性程度低的星形細胞瘤Ⅱ級標本中端粒酶陽性率為40%(2/5)，而低分化的惡性星形細胞瘤Ⅲ和Ⅳ級端粒酶陽性率為100%(8/8)，經(jīng)χ2檢驗二者差異有顯著性(P＜0.05)。同樣，13例腸癌標本中，高分化腺癌Ⅰ級陽性率為60%(3/5)，低分化腺癌Ⅱ級陽性率為100%(8/8)，說明隨腫瘤惡性程度升高，其端粒酶活性表達率升高，對判斷腫瘤惡性程度及預(yù)后有重要意義。
參考文獻
［1］Kim NW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2011-2015.
�。�2］Harley CB.Telomere loss:mitotic clock or genetic time bomb Mutat Res,1996,256:271-282.
�。�3］Counter CM,Hirter HW,Bacchetli S.Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A， 1994,91:2900-2904.
�。�4］Klingelhutz AJ.Telomerase activation and cancer. J Mol Med, 1997,75:45-49.
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