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摘要: 近幾年研究表明端粒酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，推測可能是一個廣泛的腫瘤標(biāo)志物。本文就端粒酶活性檢測的原理，端粒酶的提取方法，TRAP擴增技術(shù)，四種結(jié)果分析方法（同位素法、染色法、熒光法和ELISA法）以及如何進行質(zhì)量控制與半定量測定進行綜述。
端粒酶（Telomerase）是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA組分（hTR）于1995年被克隆，其中含有端粒重復(fù)序列的模板（5′-CUAACCCUAAC-3′）；蛋白質(zhì)組分具有RNA依賴的DNA多聚酶活性，結(jié)構(gòu)尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板區(qū)為模板復(fù)制合成端粒序列。在胚性細(xì)胞等增殖活躍的細(xì)胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟體細(xì)胞中端粒酶失活，同時還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都呈端粒酶陽性，而在癌旁組織和正常組織陽性率很低，推測端粒酶可能是一個廣泛的腫瘤標(biāo)志物[1]。因此近幾年端粒酶在各種腫瘤中的研究日益深入，同時促進了檢測方法的改進與完善。本文對其檢測方法綜述如下。
1 基本原理
端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復(fù)序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳可顯示6個堿基差異的梯帶。1994年Kim建立了基于PCR基礎(chǔ)上的端粒重復(fù)序列擴增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）。TRAP反應(yīng)原理見下圖。
首先合成一個18nt的TS做上游引物，端粒酶結(jié)合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每經(jīng)過一次轉(zhuǎn)位合成一個ggttag的6堿基重復(fù)序列，端粒酶滅活后，加入一個24nt的CX做下游引物，經(jīng)過多次變性-退火-延伸，擴增端粒酶延伸產(chǎn)物。
2 基本技術(shù)方法
2.1 標(biāo)本來源 手術(shù)摘除組織，針吸活檢組織，胸水，腹水，膀胱或胰管沖洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有爭議）等。
2.2 端粒酶的提取方法 早期采用超聲等物理破碎的方法在不同細(xì)胞中的提取效率差異較大，此后采用去污劑（如CHAPS）裂解的方法在少量細(xì)胞獲取了較穩(wěn)定的端粒酶提取液�，F(xiàn)詳述如下：40～100mg冷凍（-70％℃）組織或104～106沉淀細(xì)胞用冰預(yù)冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7.5), 1.5mM MgCl2, 10mM KCI, 1Mm DTT]洗1次，10000g4℃離心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mM tris-HCI(Ph7.5), 1mM MgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巰基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油]，自動勻漿器冰浴中勻漿，450rpm,25min, 16000g4℃離心20min，移取上清160μl，部分樣品用于蛋白定量，其余迅速冷凍，-70℃保存。端粒酶經(jīng)小于10次凍融可保持活性穩(wěn)定。部分學(xué)者對某些標(biāo)本用0.5％Tween-20代替0.5％CHAPS獲得更好的效果[2]。
2.3 TRAP擴增 50μlTRAP體系包含20mM tris-HCI(pH8.3)，1.5mM MgCI，63mM, KCI, 0.005％Tween-20，1mM EGTA, 50μMdNTP，0.1μg tS，1μg T4基因32蛋白，0.1mg/ml牛血清白蛋白，1～2μlCHAPS細(xì)胞提取液（含6μg）蛋白，0.2～0.4μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP(10μCi/μl, 3000Ci/mmol)，這一反應(yīng)體系可同時滿足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，23℃10min合成端粒酶延伸產(chǎn)物后，94℃3s滅活端粒酶，加入0.1μg cX和2U Taq酶，94℃30s，50℃30s，72℃1.5min擴增27個循環(huán)，25μl產(chǎn)物進行15％PAGE 凝膠電泳。
2.4 引物設(shè)計 為了防止上、下游引物之間的結(jié)合，在CX引物上設(shè)計了3個不匹配堿基（見圖1*處），單鏈結(jié)合蛋白T4基因32蛋白可進一步避免引物之間的結(jié)合，TS和CX引物被廣為采用，在上述條件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片斷才有特異擴增，即得到從40bp開始的6bp差異的梯帶。Broccoli等以5′-GGCGCG(ACCCTA)3-3′代替CX引物，由于增加了G-C含量，可提高退火溫度，進一步避免引物間的結(jié)合，增加特異性[3]。Oncor公司設(shè)計RP引物代替CX引物，得到從50bp開始的6bp差異的梯帶[4]。
3 擴增片斷的檢測
3.1 同位素法 Kim建立的方法即為同位素法，其應(yīng)用最多。采用[α-32P]dGTP或dCTP摻入的報道很多，但部分學(xué)者用[γ-32P]dATP和T4激酶標(biāo)記TS引物的5′端，發(fā)現(xiàn)更易于檢出低水平的端粒酶，同時更易定量[3,5]。PAGE凝膠電泳后在X-光片上放射自顯影或用Phosphoimager儀掃描測定3h。同位素法的優(yōu)點是靈敏度高，100個永生化細(xì)胞27個循環(huán)即可檢出，缺點是存在放射性污染，且放射自顯影需8h至兩天以上時間，時間較長。
3.2 染色法 電泳后用SYBR green或EB染色，然后紫外燈下觀察或用CCD圖像系統(tǒng)測定[4,6,7]。EB在302nm紫外透射儀和桔紅色紫外濾光片下效果最好，可得與SYBR green相近的敏感性。染色法簡便，快速，靈敏度為100個永生化細(xì)胞30個循環(huán)，由于染色帶的信號強度不能精確反映其分子數(shù)（大片斷染色更強），因此染色法只能判定相對端粒酶活性，而不能測定端粒酶延伸產(chǎn)物的確切數(shù)量。
3.3 熒光法 加入10pmol熒光素標(biāo)記（如FAM，F(xiàn)ITC）的TS和/或CX引物擴增，經(jīng)8％的變性PAGE凝膠電泳，DNA測序儀自動讀取數(shù)值，片斷管理系統(tǒng)軟件自動計算掃描曲線的峰高和峰面積，從上樣到出結(jié)果僅需90min。熒光系統(tǒng)極敏感，為避免過量擴增產(chǎn)物可能給出不可靠結(jié)果，要使用0.5～1.0μg的低蛋白量，擴增27個循環(huán)，由于片斷管理系統(tǒng)能自動檢出很微弱的熒光，因此不能精確測定低水平端粒酶活性[8～11]。熒光法的另一應(yīng)用是于原位—TRAP分析，可以在細(xì)胞水平上檢出端粒酶活性，因此可以判定是哪些細(xì)胞、多少細(xì)胞具有端粒酶活性，而裂解提取法不能知其活性的細(xì)胞來源。原位分析在硅化玻片上進行，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。目前只用于新鮮標(biāo)本，用凍存病理標(biāo)本的實驗尚不成功，需改進方法防止凍融中胞內(nèi)端粒酶的分散及增加標(biāo)本的滲透性等[12]。
3.4 ELISA法 TS引物5′端標(biāo)以生物素，PCR擴增后，將產(chǎn)物變性，加入地高辛標(biāo)記的可與擴增產(chǎn)物的重復(fù)片斷特異結(jié)合的探針，雜交產(chǎn)物上的生物素與固定在微孔板上的卵白素相結(jié)合，而探針上的地高辛與過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體結(jié)合，然后加入底物，顯色后用酶標(biāo)儀測定。ELISA法是寶靈曼試劑盒使用的方法，由于沒有電泳，因此觀察不到6bp差異的梯帶。
4 質(zhì)量控制
4.1 排除假陽性 設(shè)置以下四種對照（1）85℃10min滅活端粒酶；（2）端粒酶對RN ase敏感，0.5μg/10μl提取液＋1μgRNase，37℃，20min；（3）不加提取液；（4）不加CX或TS引物。以上實驗可排除引物二聚體或PCR污染。
4.2 排除假陰性 （1）以陽性細(xì)胞沉淀（106細(xì)胞）的裂解提取液為陽性對照進行TRAP分析可以排除由于試劑質(zhì)量不好造成的假陰性。（2）組織提取液中Taq酶抑制物的存在會造成假陰性，為此Wright等加入一個150bp的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的獲得方法如下：設(shè)計TS加長引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC-3′和CX加長引物：5′-(CCCTTA)3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-3′，分別在TS和CX引物的3′端增加15個堿基，可與編碼鼠肌蛋白的97～132位氨基酸的堿基匹配，擴增后得到150bp產(chǎn)物，柱純化后備用。每個TRAP反應(yīng)加入15ag內(nèi)標(biāo)為模 板，TS和CX引物既可擴增端粒酶延伸產(chǎn)物，又可擴增150bp的內(nèi)標(biāo)，當(dāng)無150bp擴增帶出現(xiàn)時說明存在Taq酶抑制劑，這對內(nèi)標(biāo)為眾多學(xué)者所采用。也有其它學(xué)者采用200bp或36bp的內(nèi)標(biāo)[4,8,14]。（3）稀釋提取液可降低酶抑制物濃度，擴增帶從無到有說明含酶抑制物。為了減少甚至排除某些標(biāo)本中存在的抑制物的影響，許多學(xué)者在得到端粒酶延伸產(chǎn)物后進行酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）抽提，酒精沉淀純化[14,15]。
5 端粒酶活性的半定量檢測
由于端粒酶活性在少數(shù)正常組織細(xì)胞中有微弱的表達(dá)，而且與細(xì)胞的增殖活躍程度、腫瘤的惡變程度及預(yù)后等有關(guān)，因此半定量測定端粒酶活性在臨床應(yīng)用上意義重大。簡便的方法是通過10倍稀釋提取液以有無6bp差異的梯帶產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)。在任何稀釋度下無產(chǎn)物為（-）；不稀釋下有產(chǎn)物為（+）；10倍稀釋下有產(chǎn)物為（++）；100倍稀釋下有產(chǎn)物為（+++），還可再進行1000倍稀釋[16～18]。Wright等將內(nèi)標(biāo)引入后使端粒酶活性的半定量檢測成為可能，將6bp差異的梯帶強度總和和除以內(nèi)標(biāo)的強度進行標(biāo)準(zhǔn)化后，在10～11000個細(xì)胞間具有很好的線性關(guān)系，而無內(nèi)標(biāo)時在大于300個細(xì)胞即進入平臺。許多學(xué)者采用這種方法描述相對端粒酶活性[18,19]。Oncor試劑盒（1996年第2版）提供了更為準(zhǔn)確的方法，用Phosphoimager儀掃描測定凝膠信號，TPG（Total product Generated，總生成產(chǎn)物）單位＝（(x-x0)/c）/（(r-r0)/c）×100(TSR8為0.1amol)，其中x代表無熱滅活處理標(biāo)本管中梯帶信號總和；x0代表熱滅活管信號；r代表TSR8質(zhì)控管梯帶信號總和，TSR8是人工合成的寡核苷酸鏈，由于TS連接AG(GGTTAG)7構(gòu)成；r0代表無標(biāo)本的裂解液對照管信號；c和cR分別代表無熱滅活處理標(biāo)本管和TSR8質(zhì)控管中內(nèi)對照的信號，每個TPG單位相當(dāng)于1×10-3amol或600個TS引物分子30℃，10min延伸至少4個端粒重復(fù)序列的數(shù)量，在1～300TPG（相當(dāng)于約30～10000個陽性對照細(xì)胞中所含端粒酶活性）范圍內(nèi)成線性。
5 小結(jié)
kim建立了TRAP方法為端粒酶活性的檢測提供了一個有力的手段，此后許多學(xué)者又進行了改進，尤其是內(nèi)標(biāo)的引入使得借助某些分析儀可以進行較精確的半定量測定。四種結(jié)果分析方法中，同位素法靈敏度高，但存在放射性污染，臨床推廣有一定難度；熒光法雖需進口的貴重儀器，但其敏感、快速、自動化程度最高，且易于半定量；染色法和ELISA法簡便、快速，結(jié)合稀釋法可以進行簡單的半定量，后三種方法均有應(yīng)用前景。
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