免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)常用試劑介紹

　　六、酶消化液

　　1．0.1%胰蛋白酶

　　試劑：胰蛋白酶 　　　　　0.1gm

　　0.1%氯化鈣（pH7.8)　　　100ml

　　配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前將胰蛋白酶消化液在水浴中予熱至37℃（載有標(biāo)本的玻片也在TBS中予熱至同樣樣溫度)。該消化液時(shí)間約為5～30min。

　　2．0.4%胃蛋白酶

　　試劑：胃蛋白酶 　　　　　400mg

　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml

　　配制方法：同胰蛋白酶。消化時(shí)間在37℃約為30min。

　　3．0.06% Pronase

　　試劑：Pronase　　　　　　　0.06g

　　0.05mol/L TB(pH7.5)　　 　100ml

　　配制方法：同前。

　　在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中，有時(shí)經(jīng)Formalin過(guò)度固定的標(biāo)本，常會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的醛基，遮蓋抗原，影響一抗與抗原的結(jié)合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異，總之，在保持組織形態(tài)不被破壞的前提下，宜盡量延長(zhǎng)消化時(shí)間。以上三種酶消化液中，以第一種最為常用。

　　七、其它

　　1．蔗糖溶液　　免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的蔗精，常用濃度為5%～30%。一般光鏡研究，僅用20%蔗糖處理已足矣，若制備電鏡標(biāo)本，在冰凍前最好經(jīng)上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等)處理，以確保其良好的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

　　（1)20%蔗糖液：

　　試劑：蔗糖 　　　　　　　　　　20g

　　0.1mol/L PB(pH7.5)　　　　 　　至100ml

　　配制方法：先以少許0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。

　　該液多用于純光鏡研究。標(biāo)本在剛放入濃度如此高的蔗糖液，常浮在上面，當(dāng)標(biāo)本沉到底部時(shí)即可。通常光鏡標(biāo)本浸泡在20%蔗糖液中過(guò)夜。都能達(dá)到要求。

　�。�2)20%蔗糖-5%甘油：

　　試劑：蔗糖　　　　　　 20g

　　甘油 　　　　　　　　　5ml

　　0.1mol/L PB　　　　　　至100ml(約95ml)

　　配制方法：先用少許PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混勻，最后補(bǔ)足PB至100ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　該液主要用于電鏡標(biāo)本的處理，常浸泡過(guò)夜（其它濃度的蔗糖中常分別為2h左右)。

　　蔗糖是一種廉價(jià)的防凍劑，兼有脫水的作用，它可減小標(biāo)本在冰凍切片時(shí)冰晶形成的數(shù)量和大小，應(yīng)用較為方便。若無(wú)試劑蔗糖（Sucrose)也可用普通蔗糖（Cane Sugar)。配制好的蔗糖溶液，放置時(shí)間超過(guò)一個(gè)月時(shí)，應(yīng)重新配制。

　　2．T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)　　免疫細(xì)胞化學(xué)中，Triton X-100常用濃度為1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100儲(chǔ)備液，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

　　30% Triton X-100的配制：

　　試劑：Triton X-100　　　　　　　　　　　　　　　　　28.2ml

　　0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4)　　　　　　72.8ml

　　配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS)混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混勻。用前取該儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

　　Triton X-100是一種非離子型表面活性劑（或稱清潔劑)，分子量為646.86（C34H62O11)。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗組織標(biāo)本，0.3%的Triton X-100則常用于稀釋血清，配制BSA等。

　　3．甲醇-H2O2液

　　試劑：純甲醇 　　　10ml

　　30% H2O2　　　　　 0.1ml

　　配制方法：吸取30%的H2O20.1ml，加入100ml純甲醇中，充分混勻即可，使H2O2終濃度為0.3%（也有的用0.03%、0.5%等)。

　　甲醇-H2O2處理組織標(biāo)本，具有封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性的作用，但其具體機(jī)制至今仍不詳。通常處理時(shí)間在室溫約為5～30min。注意，用H2O2處理標(biāo)本，對(duì)某些抗原的抗原性有影響，故建議在使用新的抗血清或抗原時(shí)，最好同時(shí)設(shè)立非處理對(duì)照組。

　　4．常用生理鹽液

常用生理鹽液的成分（g/1000ml)

　　配制方法：精確稱取各種藥品（如上表)，加入500ml重蒸水中，待完全溶解后，補(bǔ)足重蒸水至1000ml，充分混勻即可。

　　在免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，某些物質(zhì)不宜經(jīng)固定劑作用或經(jīng)固定劑作用后仍易丟失，而需浸泡在生理鹽液中。這些生理鹽液的成分與正常哺乳動(dòng)物血清的成分相似，能使組織離體后能處于盡量接近生理狀態(tài)時(shí)的環(huán)境。Glucose通常是在用前臨時(shí)加入。有的（如Kerbs液)在使用時(shí)通常需通入含CO2/O2為2.5～5%/97.5～95%的氣體。這些生理鹽液中的CO2和二碳酸鹽，主要起緩沖作用，Glucose主要是提供離體組織有限的代謝所需的能量。

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