一、雜交前準(zhǔn)備
�。ㄒ�)DEPC水是經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌蒸餾水。
DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate)，可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應(yīng)經(jīng)DEPC處理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待處理水（蒸餾水等)中，經(jīng)猛烈振搖后，于室溫靜止數(shù)小時(shí)，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2和乙醇)。有些試劑可直接加入DEPC，終濃度一般為0.1%～0.4%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀釋。此外，接觸標(biāo)本以及標(biāo)本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。
注意：①DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行，并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。
�。ǘ�)載玻片的處理
組織原位雜交，常在載玻片上進(jìn)行，故載玻片的洗滌至關(guān)重要，必須保持清潔，并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下：
�。�1)先經(jīng)洗衣粉浸泡過(guò)夜，次日自來(lái)水沖洗后，泡酸數(shù)小時(shí)以上，取出后再用流水沖洗，雙蒸水沖洗2～3次，置160℃以上烤箱中燒烤4h以上，或經(jīng)15磅高壓滅菌20min。經(jīng)以上處理可清除載片上的核酸酶。
�。�2)HCl處理法
�。ㄈ�)硅化
【方法１】（1)將一扎新的蓋玻片散開(kāi)，在通風(fēng)條件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。
�。�2)用去離子水沉漂洗玻片，豎放在架子上自然干燥。
�。�3)硅化蓋玻片：通風(fēng)條件下，將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸幾下，豎入在架子上干燥。
�。�4)收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤(pán)（或培養(yǎng)皿)中，用去離子水漂洗數(shù)次，徹底清洗。
�。�5)用鋁箔將裝有蓋玻片的培養(yǎng)皿包好，于180℃烘烤4h過(guò)夜。取出待冷至室溫后，即可進(jìn)行后續(xù)處理。
附：2%DMDC
配制：按比例兩者充分混勻，靜止待氣泡消失即可使用。
用途：硅化玻片（載片、蓋片均可)。
【方法2】將經(jīng)過(guò)洗凈的玻璃蓋片分散開(kāi)放在一金屬網(wǎng)中，并將該網(wǎng)放入一接有真空泵的干燥器中。同時(shí)，在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC)的小燒杯。蓋好干燥器（確保密閉)，抽真空約5min，然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網(wǎng)架，用錫箔紙包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好過(guò)夜。冷卻后備用�！♂t(yī)學(xué).全.在線.網(wǎng).站.提供
本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃燒干。
【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣)法
【方法4】
（1)49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣（DMDC)配液；
（2)倒入每個(gè)擬硅化的試管或離心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗；
�。�3)玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿應(yīng)于60℃烘烤過(guò)夜。
注意：DMDC有毒且高度揮發(fā)，應(yīng)于通風(fēng)環(huán)境操作并戴口罩、手套，避免接觸皮膚或吸入。
