肝纖維化和肝硬變基因治療的研究現(xiàn)狀

關(guān)鍵詞： 肝硬變；治療；基因療法 

　　肝硬變是慢性肝病晚期的組織學(xué)改變，表現(xiàn)為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞廣泛破壞和再生，纖維結(jié)締組織大量增生造成肝小葉和血管結(jié)構(gòu)的無序化，結(jié)果常引起肝功能失代償、食管靜脈曲張、腹水和肝癌等致死性并發(fā)癥．長期以來，對(duì)肝纖維化和肝硬變?nèi)狈τ行У闹委煼椒ǎ�近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，初步闡明了肝硬變發(fā)病機(jī)制，從而在基因水平上治療肝纖維化的研究取得重大進(jìn)展[1-3].現(xiàn)綜述如下．1肝硬變的發(fā)病機(jī)制引起人體肝硬變的原因很多、涉及的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[3-5]．在實(shí)驗(yàn)中通常應(yīng)用四氯化碳(CCl4)或二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝硬變模型研究相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，因?yàn)槠涮攸c(diǎn)與人肝纖維化和肝硬變的病理相似：肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞塌陷，形成了由纖維間隔分離開的再生結(jié)節(jié)，網(wǎng)硬纖維(reticulinfibers)呈放射狀分布于整個(gè)肝臟。如果不及時(shí)進(jìn)行治療，通常大鼠7wk內(nèi)死于廣泛性肝纖維化和肝功能失代償[1,6].雖然肝硬變的分子機(jī)制尚未完全弄清，但是已證實(shí)DMN誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪的降解，貯脂細(xì)胞(Ito細(xì)胞)的激活和增生，Kupffer細(xì)胞的浸潤和TGF-β的分泌．現(xiàn)認(rèn)為肝竇周間隙的星狀細(xì)胞(又叫做Ito細(xì)胞、貯存細(xì)胞)在肝纖維化過程中起主要作用，在肝損傷和傷，愈合的過程中，它經(jīng)歷了顯著的形態(tài)學(xué)和功能上的變化，后者又稱為“激活”，產(chǎn)生應(yīng)激纖維和大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)．尤其是在DMN誘導(dǎo)肝損傷過程中大量產(chǎn)生TGF-β1，后者是一種致纖維化的細(xì)胞因子，它主要是刺激肝星狀細(xì)胞合成ECM，此外TGF-β1還與另外一些細(xì)胞因子(血小板衍生生長因子PDGF)、小分子的多肽等一起在纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[5-7]．有關(guān)作用機(jī)制不僅涉及到TG-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞向肌纖維樣母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，后者促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生，減少了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解，而且TGF-β1、還能較強(qiáng)的抑制表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(包括肝細(xì)胞)的生長，特別是TGF-β1誘導(dǎo)肝細(xì)胞的程序性死亡(凋亡)．在TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠中，同樣證實(shí)高水平的TGF-β1，表達(dá)，使小鼠易發(fā)生肝纖維化．由此可以設(shè)想：凡具有影響星狀細(xì)胞的激活和抗TGF-β1生物學(xué)活性藥物，就有可能阻止肝纖維化進(jìn)程，同時(shí)有利于肝細(xì)胞的再生、阻止肝細(xì)胞凋亡和損傷，對(duì)肝纖維化具有治療和預(yù)防作用[1，6-8]．由于ECM還可能和整合素(integrin)相互作用，從而影響有關(guān)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能，誘導(dǎo)基因表達(dá)、刺激細(xì)胞的增殖．此外，蝶氏(Disse)間隙的纖維化(如膠原纖維和纖雛結(jié)合素的聚積)可能阻斷了肝竇狀間隙和肝細(xì)胞之間的分子交換，同時(shí)捐害了肝細(xì)胞的功能，所以減輕Disse間隙的纖維化更有效的改善肝功能．即使在肝硬變晚期減輕的肝纖維化可能緩解肝臟的損害，所以有助于減輕肝功能失代償?shù)某潭萚9]。2基因治療的方案2．1阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的治療方案由于TGF-β是一種重要的細(xì)胞因子，它參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、降解和聚集的一系列過程，因而與纖雛增生有重要關(guān)系[7，10，11]．通過研究抗TGF-β作用將會(huì)有效地阻斷纖維化的過程，為此，Qietal首先重組了腺病毒載體AdCATβ-TR，目的是表達(dá)截?cái)嗟娜刷蛐蚑GF-β受體，阻斷丁TGF-β信號(hào)傳導(dǎo),他們應(yīng)用AdCATβ-TR(109pfu／Ml)從門靜脈一次性輸入的，再用DMN誘導(dǎo)肝臟纖雛化的模型．3d后，應(yīng)用Northern雜交檢測發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟中截短的人TGF-β受體表達(dá)水平大約是對(duì)照組(經(jīng)過生理鹽水和AdCALacZ治療)的20倍．通過免疫組化檢測顯示在AdCVTβ-TR治療的大鼠肝組織中，I型膠原、纖維結(jié)合素(fibronectin)，a-SMN,TGF-β等表達(dá)均受到抑制．通常血清透明質(zhì)酸的水產(chǎn)是反映患者肝纖維化進(jìn)展的指標(biāo)。經(jīng)過AdCATβ-TR治療的大鼠，血清透明質(zhì)酸水平低，而且血清ALT水平也降低了60倍．而對(duì)照組血清透明質(zhì)酸水平卻很高，而且在3wk內(nèi)均死于肝纖維化和肝功能衰竭．所以本實(shí)驗(yàn)的重要發(fā)現(xiàn)在于，在抗TGF-β信號(hào)傳遞過程中，終止了肝纖維化的進(jìn)程、同時(shí)伴隨著肝功能改善、體重?fù)p失緩解和存活時(shí)間延長。由此可見Qietal應(yīng)用腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移阻斷TGF-β的信號(hào)傳遞，阻斷了纖維化過程能保護(hù)肝功能，并具有治療效果，可見TGF-β的確在體內(nèi)纖維化過程中起著關(guān)鍵的作用[7]．因而可能是一種有效的、具有應(yīng)用前景的治療方案[1，8]．2.2應(yīng)用HGF基因治療方案由于肝細(xì)胞生長因子(HGF)在肝臟的發(fā)育和再生過程中起到不可缺少的作用，還具有抗肝細(xì)胞凋亡、激活廣泛細(xì)胞的有序分裂等活性，因此應(yīng)用HGF基因轉(zhuǎn)移治療肝硬變、刺激肝再生也可能是合理的選擇，為此Fujimotoetal應(yīng)用直接轉(zhuǎn)移基因HGF基因到骨骼肌細(xì)胞的方法對(duì)大鼠肝硬變實(shí)施新的基因治療[2，6，12，13]。他們建立了一種安全、簡單、重復(fù)性轉(zhuǎn)導(dǎo)HGF基因進(jìn)入體內(nèi)骨骼肌的步驟，在DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的wk4，應(yīng)用肌肉注射HGF-HVJ脂質(zhì)體進(jìn)行HGF轉(zhuǎn)基因治療后，大鼠血漿中人HGF和內(nèi)源性的鼠HGF大量上升，推測是人HGF基因轉(zhuǎn)移提高了大鼠的HGF的表達(dá)水平，C-Met基因編碼的HGF受體是酪氨酸激酶蛋白(HGFR)．其中的β鏈跨膜分布，含有胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶的功能區(qū)，在正常大鼠中，HGFR表達(dá)水平很低，在HGF-HVJ脂質(zhì)體治療的大鼠中，HGFR受體水平大量上升，并維持在較高水平．HGF的生物活性是通過HGFR的酪氨酸殘基磷酸化實(shí)現(xiàn)的。給大鼠連續(xù)的注射HGF-HVJ脂質(zhì)體以后，其肝臟中產(chǎn)生很強(qiáng)的HGFR酪氨酸磷酸化．上述結(jié)果表明：人HGF的基因轉(zhuǎn)移治療誘導(dǎo)了人HGF和內(nèi)源性大鼠HGF的高水平表達(dá)，也在很大程度上激活了肝硬變大鼠肝臟中HGF受體．值得重視的是在治療組，給每只大鼠轉(zhuǎn)染40μg的HGFDNA，可以完全緩解肝硬變，使大鼠免于死亡．在肝硬變的大鼠肝臟中，HGF刺激肝細(xì)胞有絲分裂，后者在肝臟再生的過程中起到重要作用．經(jīng)過HGF基因治療后，TGF-β1的表達(dá)受到強(qiáng)烈地抑制，其結(jié)果肝臟中肝星狀細(xì)胞向肌纖維樣母細(xì)胞轉(zhuǎn)化受阻，此外，膠原酶的活性增強(qiáng)，因而能觀察到肝硬變的Gilsson’s鞘和假小葉中纖維結(jié)蹄組織的增生也被抑制．組織學(xué)觀察表明門靜脈周圍和肝小葉中心的廣泛纖維化過程幾乎完全終止，肝小葉和血管的結(jié)構(gòu)得到了很好的重建，門脈高壓也得到顯著改善，可見基因治療的結(jié)果阻斷了纖維化進(jìn)程，刺激了肝再生，重建了肝內(nèi)結(jié)構(gòu)，所有這些都是評(píng)價(jià)肝硬變治療的關(guān)鍵指標(biāo)．應(yīng)用TUNEL原位免疫組化測定發(fā)現(xiàn)在門脈周圍和肝小葉中心部位的纖維化減少，肝腺泡的變形減輕．應(yīng)用影象分析技術(shù)定量檢測，發(fā)現(xiàn)肝臟纖維化減少70％．更重要的是HGF基因治療阻斷了DMN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的凋亡．值得注意的是所有對(duì)照組大鼠在DMN處理后的45d內(nèi)，均死于進(jìn)行性肝硬變．經(jīng)證實(shí)HGF基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了DMN誘導(dǎo)的TGF-β1的表達(dá)，所以，HGF基因治療療效的一部分是通過抑制TGFβ1來改善肝纖維化的病變．不過目前還不清楚HGF通過何種確切機(jī)制來抑制TGF-β1的表達(dá)和功能．在肝硬變的組織中，由肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化的肌纖雛樣細(xì)胞能特性表達(dá)a平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)，后者與TGF-β1，的表達(dá)有高度相關(guān)性．尤其是經(jīng)過HGF基因治療后，表達(dá)a-SMA的陽性細(xì)胞也大量地減少．Fijimoto研究了HGF對(duì)體外培養(yǎng)的非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)在體外條件下HGF能抑制TGF-β1Mrna和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生．為此，有必要進(jìn)一步闡明HGF抑制TGF-β1的分子機(jī)制。據(jù)報(bào)道在腎細(xì)胞中，HGF呈上游調(diào)節(jié)，引起EDA區(qū)域產(chǎn)生大量的細(xì)胞纖維結(jié)合素，而在損傷的肝臟中，EDA纖維結(jié)合素的出現(xiàn)與纖維化有關(guān)，所以HGF影響星狀細(xì)胞、以及調(diào)節(jié)TGF-β和基質(zhì)蛋白的降解等有關(guān)的機(jī)制有待進(jìn)一步弄清[14-16]。3不同基因治療方案的優(yōu)越性在理論上有效的抗纖維化治療需要符合以下幾個(gè)重要的條件：①有可靠而明確的生物學(xué)機(jī)制．②必須有藥效學(xué)上的優(yōu)勢．即活性成分在肝臟中能達(dá)到較高的濃度，對(duì)肝外組織影響少，如果作用的靶位是星狀肝細(xì)胞就更好．③治療的藥物應(yīng)當(dāng)在作用的靶環(huán)境中維持較長的時(shí)間，或許在損傷的部位無限期的存在[1]．Qietal報(bào)道的方法保證了將目的基因直接運(yùn)送到肝臟，并獲得高水平的表達(dá)，重要的是在DMN引起肝臟損傷之前，表達(dá)截短的TGF-β受體的AdCATβ-TR就給大鼠預(yù)先進(jìn)行注射，腺病毒載體能至少保持目的基因高效表達(dá)1wk～2wk，在DMN處理后的3wk中，產(chǎn)生高水平Ⅱ型TFG-β受體．應(yīng)用腺病毒載體具有一定優(yōu)勢：①腺病毒對(duì)肝細(xì)胞有較高的親和性，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)肝星狀細(xì)胞，所以腺病毒載體介導(dǎo)的外源基因易于進(jìn)入肝星狀細(xì)胞以及鄰居區(qū)域的其他細(xì)胞(如肝細(xì)胞)．②應(yīng)用腺病毒載體可減少對(duì)被治療的機(jī)體產(chǎn)生全身性毒性，因?yàn)榻?jīng)過注射腺病毒后主要集中分布于肝臟．雖然不利的因素就是維持基因表達(dá)的時(shí)間較短，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有新的載體可維持靶基因長期的表達(dá)，或重復(fù)注射Liposome介導(dǎo)的基因表達(dá)也能達(dá)到此目的[1，8]．Fujimotoetal應(yīng)用含有DNA和HVJ包膜蛋白的脂質(zhì)體，而將它們直接注射到骨骼肌，這樣表達(dá)的HGF能進(jìn)入血液循環(huán)，到達(dá)肝臟發(fā)揮作用，由于這種方法簡便、安全、又沒有毒性，所以可以用于活的動(dòng)物模型中．進(jìn)而通過重復(fù)轉(zhuǎn)染HGF基因可以使血漿中HGF持續(xù)維持在較高的水平．實(shí)驗(yàn)證實(shí)重復(fù)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染不會(huì)引起顯著的炎癥反應(yīng)和小鼠細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)的激活[1，2，6]．4應(yīng)用前景目前，應(yīng)用轉(zhuǎn)移外源基因進(jìn)入肝臟的方法和載體系統(tǒng)還受到一定的限制．例如：腺病毒載體由于自身蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的免疫原性而產(chǎn)生細(xì)胞毒性、逆轉(zhuǎn)病毒載體雖可用于轉(zhuǎn)移基因到部分切除(而產(chǎn)生再生的)肝臟，但轉(zhuǎn)染的效率相對(duì)較低．由于HVJ-脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移比直接注射裸DNA的效率更高，這一方法可能較合適應(yīng)用于人體肝硬變的治療．上述研究表明抗肝硬變的基因治療能夠阻斷肝纖維化的發(fā)展、刺激肝細(xì)胞的增殖和恢復(fù)肝組織結(jié)構(gòu)的完整性，研究進(jìn)展令人鼓舞．不過另一個(gè)值得考慮的重要問題是：抗纖維化的藥物有效性的判斷是基于實(shí)驗(yàn)性肝損傷的基礎(chǔ)上，而且在肝損傷的最早期就進(jìn)行治療，這對(duì)了解藥物的生物學(xué)活性及機(jī)制是有用的，但是：臨床上大多數(shù)患者通常是已經(jīng)有肝纖維化才前來就醫(yī)，這些患者肝臟正在發(fā)生進(jìn)行性炎癥和肝纖雛化，應(yīng)用上述治療能否有效，是值得深入研究的問題．在我國肝纖維化和肝硬變的發(fā)病串較高，其中引起肝硬變的主要原因可能是慢性病毒性肝炎．抗肝纖維化治療，一要抑制膠原生成、促進(jìn)肝細(xì)胞增生；二是要促進(jìn)已形成的膠原纖維降解和吸收．才能有效阻斷肝硬變的發(fā)生．其中特別是有效地抑制肝星狀細(xì)胞的激活是重要的一環(huán)[17]．在我國應(yīng)用中醫(yī)中藥進(jìn)行抗肝纖維化治療，取得一定的效果．由于應(yīng)用常規(guī)的療法不能治愈肝纖維化和肝硬變，所以依靠基因分子生物學(xué)的進(jìn)步，相信在不久的將來，應(yīng)用HGF或(和)抗TGF-β的基因治療最終將成為臨床抗肝纖維化和肝硬變的治療方案

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