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關鍵詞： 消化系統(tǒng)腫瘤/治療；自殺基因；基因療法
Subject headings digestive system neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy
在惡性腫瘤的各種基因治療中，自殺基因(suicide gene)/前藥(prodrug)系統(tǒng)備受關注. 目前已在多種腫瘤進行大量臨床前研究，有的已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗. 該療法對消化系腫瘤的治療作用，業(yè)已得到證明［1］. 不管哪一種自殺基因/前藥系統(tǒng)，均需有下列3個成分：①能編碼一種酶的自殺基因：該基因通常來源于病毒或真核細胞，其編碼的酶能將無毒的前藥轉變?yōu)榛钚远疚�，引起靶細胞死亡；在缺乏前藥的條件下，該種基因的表達對機體無害；該基因編碼的酶對基質(前藥)應具有高度催化效能(高Kcat)［2］. ②基因轉移載體(gene-transfer Vectors)：為了轉移自殺基因至靶細胞，一般采用基因工程改造的逆轉錄病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相關性病毒(adenovirus-associated viruses)作為載體［3］. 也有人采用陽離子脂質體作為載體，發(fā)現(xiàn)其對內皮細胞有高度親和力［4］. 基因轉移的關鍵是其靶向性(targeting)［5］. 如將甲胎蛋白(AFP)啟動子和清蛋白增強子(Alb)TRS連接自殺基因，則后者便僅于表達AFP的肝癌細胞中表達，而不影響正常肝細胞［6］. ③能被自殺基因編碼的酶作用的前藥(prodrug)：這種前藥在自殺基因不存在時，對機體無毒或僅有微小毒性，而在自殺基因編碼的酶特異性作用下，前藥轉化為活性藥物，后者的細胞毒性較無活性的前藥至少強100倍.
1 自殺基因/前藥系統(tǒng)
1.1 單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(HSV-tk/GCV)系統(tǒng) 表達單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-1 thymidine kinase, HSV-tk)的小鼠成纖維細胞，對戊環(huán)鳥苷(ganciclovir, GCV)的敏感性較野生型細胞強1000倍，在BALB/c小鼠，給予GCV，可使表達HSV-tk的肉瘤和Abelson白血病病毒性淋巴瘤完全退縮. 上述發(fā)現(xiàn)奠定了HSV-tk/GCV系統(tǒng)的基礎. GCV本身無毒性，在HSV-tk作用下，變成GCV單磷酸鹽(GCV-MP)，再經內源性細胞激酶作用，迅速轉化為其二磷酸-(GCV-DP)和三磷酸鹽(GCV-TP)，后者對增殖中的哺乳細胞具有高度毒性. 雖然哺乳動物細胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的轉化，但HSV-tk的作用比其強200倍. GCV-TP具有羥基，能插入DNA鏈中，引起堿基配對錯誤、DNA斷裂、姐姝染色單體交換和致死性基因失穩(wěn)定［7］；GCV-TP尚能抑制DNA聚合酶，進一步阻止DNA合成［8］. 在暴露于GCV后，表達HSV-tk的哺乳動物細胞內迅速聚集GCV磷酸鹽，而未表達HSV-tk的野生型細胞則無GCV磷酸鹽測得；將HSV-tk轉染的細胞與3H標記的GCV一起孵育，發(fā)現(xiàn)放射性標記物迅速而穩(wěn)定地摻入細胞DNA內. 應用IH核磁共振分光鏡檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織在HSV-tk/GCV治療后，含膽堿物質的顯性彌散系數(shù)減少50%，而迅速彌散性水成分的顯性彌散系數(shù)增加219%，細胞內粘滯度明顯增加，而大分子物質的流體動力學面積可能減少［9］；動力學分析顯示細胞內P53蛋白水平先增加，繼之cyclin β1蛋白水平升高，細胞周期中止于S/G2［10］. 上述事實說明HSV tk/GCV引起腫瘤細胞凋亡. HSV-tk/GCV系統(tǒng)不僅能殺滅表達HSV tk的細胞，且具有顯著的旁觀者效應(bystander effect, BSE).
無論是體外抑或體內實驗均觀察到，GCV劑量越大，培養(yǎng)中的HSV-tk+細胞被殺滅的比例和腫瘤退縮率也越高，荷HSV-tk+瘤的動物生存期也越長. 至于HSV-tk本身的表達水平，一般與對GCV的敏感性不具有相關性，但不完全如此. 此外，細胞對HSV-tk/GCV的敏感性尚取決于擔負著GCV二-和三磷酸化的細胞激酶的活性、細胞增殖速率以及將GCV-TP整合入DNA的DNA聚合酶活性［11］. 有人認為，GCV被HSV-tk+細胞攝取較慢，親和力較差，不是很理想的HSV-tk基質［12］. Balzarini et al［13］發(fā)現(xiàn)，Elaidic acid ester GCV(E-GCV)的代謝物在HSV-tk+細胞內停留時間較GCV代謝物長1倍以上，且E-GCV在血漿中較GCV穩(wěn)定，因此如用作HSV-tk系統(tǒng)的前藥，其作用至少比GCV強10倍；Tong et al［14］發(fā)現(xiàn)，如果用無環(huán)鳥苷(acyclovir, ACV)代替GCV作為前藥，并使用較GCV常用劑量高2.5～5.0倍的劑量，則引致的旁觀者效應明顯高于應用GCV作為前藥時.
1.2 帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)系統(tǒng) 與HSV-tk不同，帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(varicella zoster virus thymidine kinase， VZV-tk)對GCV親和性甚弱，而對前藥阿糖甲氧基嘌呤(6-methoxypurine arabinside, Ara-M)和溴乙烯基脫氧尿嘧啶(E)-5(2-bromovinyl)-2＇-deoxyuridine ,BVdU)具有親和力，能選擇性催化二者磷酸化，再在細胞內酶作用下，最后生成三磷酸鹽，分別為Ara-ATP和BVdU-TP［15］. 野生型細胞對高達1500μmol/L濃度的Ara-A和75μmol/L～250μmol/L濃度的BVdU均不敏感，而對表達VZV-tk的細胞，低至1μmol/L～100μmol/L濃度的Ara-M和0.06μmol/L～0.6μmol/L的BVdU即呈細胞毒性［16］.
1.3 胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系統(tǒng) 胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase, CD)系由大腸桿菌和某些霉菌表達的一種酶，不存在于哺乳動物細胞內，能催化胞嘧啶生成尿嘧啶. 抗霉菌藥5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5FC)經CD脫氨后，生成5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU)，再經細菌內酶作用，生成氟脲嘧啶三磷酸鹽(5-fluoro-5＇-trip hosphate)和氟脫氧尿嘧啶單磷酸鹽(5-fluoro-2＇-deoxyuridine-5＇-monophosphate, FdUMP). 后二者抑制胸苷酸合成酶(thynidylate synthase)，阻抑DNA，RNA和蛋白合成，引致細胞死亡. 一般選用大腸桿菌的CD基因作為自殺基因. 應用5FC作為前藥，有不少優(yōu)點，例如，人的細胞酶不能使5FC脫氨，因此在通常劑量下5FC幾無毒性；口服吸收良好(＞80%)；能透過血腦屏障等［1］. 表達CD的哺乳動物的細胞在暴露于5FC后. 細胞內迅速產生可測定水平的5FC，胸苷酸合成酶受抑，廣泛形成RNA皺縮物(RNA adduts). 由CD/5FC介導的細胞死亡發(fā)生較HSV-tk/GCV引起者為慢［17］，可能由于5FC被攝取和轉化較慢所致. 但CD/5FC引起的細胞殺死作用不一定弱于HSV-tk/GCV，主要由于前者往往有更強的旁觀者作用. 如同HSV-tk/GCV一樣，前藥5FC的細胞毒性作用也呈現(xiàn)劑量相關性，在某些敏感的細胞系如結腸癌，細胞毒性與CD表達呈正相關［18］，但在對5FU不敏感的肉瘤細胞，此種相關性不明顯，看來，細胞毒作用的強弱可能最終取決于特殊細胞系對5FU的內在敏感性. CD/5-FC系統(tǒng)也顯示旁觀者效應，與HSV/GCV時相似，但機制不同［19］.
1.4 細胞色素P450微粒體酶CYP2B1/環(huán)磷酰胺(CYP2B1/CPA)系統(tǒng) 自大鼠肝分離出的細胞色素P450微粒體酶CYP2B1，能催化化療藥環(huán)磷酰胺(CPA)和異環(huán)磷酰胺(IFF)，生成4羥環(huán)磷酰胺(4HC)，再迅速轉化為短壽命的烷基化物磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard)，引致細胞DNA損傷. 在體內，轉染CYP2B1基因的細胞對CPA的敏感性較野生型細胞高15倍～20倍. 該系統(tǒng)具有中等強度的旁觀者效應. 該系統(tǒng)對累及某些特殊部位如腦、腦膜的腫瘤可能具有特殊作用. CPA能自由地透過血腦屏障，但CPA轉化為4HC主要發(fā)生于肝內，而4HC不易透過血腦屏障. 如將CYP2B1基因轉導入腦瘤內，再給予CPA，則局部生成的4HC可對腦瘤發(fā)揮細胞毒作用. 在進行自身骨髓移植的腫瘤患者，可利用CYP2B1/CPA清除骨髓內瘤細胞. 4HC對正常造血細胞和腫瘤細胞均有毒性，如將表達CYP2B1的腺病毒載體轉染骨髓，由于造血細胞缺乏腺病毒表面受體，因此僅有腫瘤細胞被CYP2B1基因有效地轉染，從而被毒性4HC殺滅，而正常造血細胞不受危害［1］.
1.5 細胞色素P450 CYP4B1/氨基蒽(CYP4B1/2AA)系統(tǒng) 免細胞色素P450 CYP4B1能選擇性作用于前藥氨基蒽(2-aminoanthracene, ZAA)或4-ipomeanol (4-IM)，使之轉化為活性物質烷化劑不飽和性或乙醛呋喃環(huán)氧化物(aldehyde furan epoxide［20］). 此種活化藥物在很低濃度即顯示高度DNA毒性. 體外實驗表明，只要有1%的細胞表達CYB4B1，即有顯著的旁觀者效應.
1.6 脫氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dCK/Ara-C)系統(tǒng) 臨床上發(fā)現(xiàn)，抗白血病的核苷酸類藥物如阿糖胞苷(Ara-C)、2-氯脫氧腺苷(2CdA)和fludarabine的效應與白血病細胞表達脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, dCK)的水平相關. 這些前藥在細胞內活化的關鍵步驟是被dCK磷酸化. Ara-C雖為造血系統(tǒng)惡性腫瘤的有效藥物，但對實體腫瘤作用有限. 人dCK能將Ara-C在細胞內磷酸化，使其細胞毒性增加. 有人用逆轉錄病毒或腺病毒，將dCK基因轉染至神經膠質瘤細胞，使這些瘤細胞對Ara-C敏感性明顯提高［21］.
1.7 烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶/6-硫黃嘌呤(gpt/6TX)系統(tǒng) 大腸桿菌的烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(guanosine-xanthine phosphoribosyl transferase, gpt)基因表達產物，既能增強被轉染細胞對硫黃嘌呤的敏感性，也能增強對mycophenolic acid、黃嘌呤和次嘌黃嘌呤的抗性，從而可對被轉染細胞進行正、負選擇. gpt能使6-硫黃嘌呤(6-thioxanthine, 6TX)和6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine, 6-TG)磷酸化，增加轉染gpt基因細胞對該兩種前藥的敏感性. 鼠神經膠質瘤細胞被逆轉錄病毒轉染gpt基因后，對6-TX的敏感性提高50倍～100倍.［22］. 給予無胸腺鼠顱內C6腫瘤內移植gpt-逆轉錄病毒載體產生細胞，隨后給予6TX，引起腫瘤縮小80%，生存期較對照組明顯延長［23］.
1.8 硝基還原酶/CB1954(NTR/CB1954)系統(tǒng) 大腸桿菌的硝基還原酶(nitroreductase, NTR)對基質5-(aziridin-1-yl)-2, 4-dinitrobenzamide (CB1954)具有高度催化活性，能迅速將其還原為一系列羥胺類烷化劑. 表達NTR的細胞對CB1954的敏感性較野生型細胞高500倍，且具有強大旁觀者效應［24，25］. NTR也能激活一些抗菌藥如硝基呋喃妥英(nitrofuratoin)和甲硝唑，使之具有細胞毒性，但不顯示旁觀者效應［25］.
1.9 嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脫氧核苷(PNP/6-MeP-dR)系統(tǒng) 大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)基因編碼的酶能激活相對無毒性的6-甲基嘌呤脫氧核苷(6-methyl purine-deoxyriboside, 6-MeP-dR)，生成高毒性的6-甲基嘌呤(6-methylpurine, 6-MeP). 用逆轉錄病毒載體將PNP基因轉達給小鼠黑素瘤和乳癌細胞，再暴露于6-MeP-dR，發(fā)現(xiàn)黑素瘤細胞被選擇性殺滅. 該系統(tǒng)具有強大旁觀者效應，只要有1%的細胞表達PNP，即可引起大多數(shù)非轉染細胞死亡.
1.10 胸腺嘧啶磷酸化酶/5＇-脫氧-5-氟尿嘧啶(TP/5＇-DFUR)系統(tǒng) 胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP)能催化胸腺嘧啶或脫氧尿嘧啶，生成1-磷酸脫氧核糖. 對于前藥5＇-脫氧-5氟尿嘧啶(5＇-deoxy-5-fluorouridine, 5＇-DFUR)或1-(tetrahydrofuryl-5-fluorouracil, Tegafur), TP使之轉化為5FU. 業(yè)已證明該系統(tǒng)可使人MCF-7乳癌細胞對5＇-DFUR的敏感性提高1000倍. 該系統(tǒng)也呈旁觀者效應.
1.11 羧基肽酶G2/CMDA系統(tǒng)(CPG2/CMDA) 假單胞菌屬(Pseudomonas)RS16產生的羧基肽酶G2(carboxy peptidase G2，CPG2)可使4-(［2-chloroethyl］［2-mesyloxyethyl］amino)benzyol-L-glutamic acid(CMDA)分解為苯甲酸衍生物，后者為強毒性烷化劑. CMDA不易進入細胞，不能被細胞內表達的CPG2活化，但如果應用基因工程方法讓CPG2在細胞膜表面表達，則CMDA便易被激活，從而顯示細胞毒性［26］.
1.12 羧酸酯酶/CPT-11(CE/CPT-11)系統(tǒng) 兔羧酸酯酶(carboxylesterase, CE)能使化療藥CPT-11(irinotecan, 7-ethyl-10-［4-(1-piperidino)-1-piperidino］ carbonyloxycamptothecin)轉化為其活性形式SN38(7-ethyl-10 hydroxycamptothecin)［27］. 人橫紋肌肉瘤細胞被免CE基因轉染后，對CPT-11的敏感性較之野生型細胞高8倍以上. 從CPT-11轉化為SN38的過程具有同工酶特異性，在人，主要由肝內CE-Ⅰ催化.
1.13 復合系統(tǒng) 聯(lián)合應用不同的自殺基因前藥系統(tǒng)可能比單一系統(tǒng)更有效［28，29］. 例如，聯(lián)合應用CD/5FC和HSV-tk/GCV系統(tǒng)，前者產生的5FU可抑制胸苷酸合成酶，減少胸腺嘧啶生成，相應減少在HSV-tk活性部位胸腺嘧啶和GCV的競爭，從面增強HSV-tk/GCV系統(tǒng)的效應. 給鼠9L神經膠質瘤同時轉染CD和HSV-tk兩種基因，可使殺滅腫瘤所需的5FC和GCV最低濃度下降50%以上.
2 作用機制
基因轉移載體將自殺基因轉染給腫瘤細胞，在自殺基因表達的特殊酶作用下，本身無毒或微毒的前藥在局部被激活，轉化為高度毒性藥物，從而將瘤細胞毒殺滅. 表達這種酶的瘤細胞越多，被殺滅的細胞越多. 此為直接細胞毒效應. 但實踐中發(fā)現(xiàn)，為了取得腫瘤退縮，并不需要每個腫瘤細胞均表達自殺基因，換言之，在自殺基因/前藥系統(tǒng)介導的腫瘤治療中，被殺滅的細胞數(shù)遠超過表達自殺基因的細胞數(shù). 這是由于在前藥存在下，基因改造的瘤細胞能引起未經基因改造細胞的細胞毒性和死亡. 這種現(xiàn)象即前已述及的旁觀者效應(bystander effect, BSE). 此種效應有力的增強了自殺基因/前藥系統(tǒng)的作用，但因細胞系和酶/前藥不同而差異很大，可以不存在，也可以很強大，以致腫瘤內只要有1%～5%的轉染細胞即可引起幾乎全部瘤細胞死亡. 前述的各系統(tǒng)中，許多均顯示這種效應. BSE產生的機制尚不完全清楚，主要有：
2.1 單純彌散作用 某些激活的前藥(如5FU)為可溶性分子，可自由地在細胞-細胞之間彌散，從而引發(fā)BSE. 在CD/5FU系統(tǒng)，暴露于5FU后，CD+細胞培養(yǎng)液中很快可測出5FU. 在細胞水平，BSE取決于5FC被基因改造細胞轉化為5FU的速率、5FU彌散至鄰近未基因改造細胞的速率，以及靶細胞對5FU的內在敏感性. 如果腫瘤細胞本身對5FU敏感，則從鄰近基因改造細胞彌散而來的5FU，即使?jié)舛群艿停渤尸F(xiàn)細胞毒作用.
2.2 代謝協(xié)作作用(metabolic cooperation) 在某些自殺基因系統(tǒng)，例如HSV-tk/GCV，活化的前藥GCV-TP為荷電分子，不能被動地穿越細胞膜，但在HSV-tk+細胞和野生型細胞共培養(yǎng)中，卻在后一種細胞內顯示有高濃度GCV-TP［30］. 現(xiàn)認為，這是HSV tk+細胞內GCV-TP經過細胞的裂隙連接(gap junction)轉移給野生型細胞的結果. 裂隙連接系由結合蛋白(connexons)組成的特殊細胞膜結構. 結合蛋白由connexins裝配而成，為一六聚體圓柱形蛋白，中心有孔道. 不同細胞之間的裂隙連接形成“代謝協(xié)作”管道，經過此管道，一些小電荷分子能在細胞間流動. GCV-TP分子甚小(＜1000)，能透過裂隙連接. 業(yè)已證實，在HSV-tk/GCV系統(tǒng)中，細胞-細胞接觸是細胞殺滅作用所必需；細胞間裂隙連接與BSE強弱密切相關，而裂隙連接的透過性又與connexins 43,37,32和26的表達水平有關. 缺乏BSE的細胞系在轉入connexins 43基因后，顯示BSE. 胰癌細胞呈現(xiàn)的BSE強于某些胃腸癌細胞，前者的connexins 43和connexins 26 mRNA表達水平，比后者分別高8倍～26倍和2倍～229倍［31］. 為了強化BSE，可通過藥理學方法疏通裂隙連接或增強其表達. 由HSV-tk+和野生型腫瘤細胞混合物構建的鼠間質細胞瘤，如果同時接受GCV和維生素A酸(retinoid acid)，其腫瘤消退作用加快，這種作用即使在HSV-tk+細胞與野生型細胞的比例低至1∶40時仍存在. 已知維生素A酸能增加connexins 43的表達，促進小分子色素在細胞之間轉移，而其本身對腫瘤大小并無影響，由此推測，維生素A酸之所以能強化HSV-tk/GCV的作用，系由于其能加強裂隙連接的透過性，強化BSE所致［32］. 其他能增強HSV-tk/GCV BSE殺傷作用的物質尚有黃酮類apigenin、膽固醇合成抑制劑lovastatin. 已知細胞酪氨酸激酶能使connexins磷酸化，減弱裂隙連接的透過性，而lovastatin能抑制該酶活性，從而增強裂隙連接的通透性：apigenin可能會增加裂隙連接的表達. 相反，cAMP活化劑forskolin和鈣通道阻滯劑硝苯吡啶能減弱BSE.
2.3 免疫介導作用 給動物在兩個不同部位分別移植HSV-tk+腫瘤和野生型腫瘤，再給予GCV，發(fā)現(xiàn)野生型腫瘤也退縮，這種現(xiàn)象稱為“距離性旁觀者效應”(“bystander effect at a distance”)，提示體內出現(xiàn)抗腫瘤性免疫反應［33］. 下列事實提示這種免疫反應的存在：①給小鼠植入含有HSV-tk+和野生型細胞的腫瘤，再接受亞致死量照射，發(fā)現(xiàn)BSE減弱；②在免疫缺陷性荷瘤BALB/c小鼠，HSV-tk/GCV的BSE弱于免疫功能正常的荷瘤鼠；③接受HSV-tk/GCV治療的荷瘤動物，對同源腫瘤的再接種呈現(xiàn)特異性抗體反應［34］；④前列腺癌鼠模型接受HSV-tk/GCV治療期間，如果去除自然殺傷細胞(NK)，則原發(fā)腫瘤的抑制作用減少20%，肺轉移癌的生長不能被抑制［35］；⑤HSV-tk/GCV介導的腫瘤壞死伴有明顯炎細胞浸潤，CD4+和CD+8T細胞集聚、瘤內白介素-12(IL-12)水平增高，這與環(huán)磷酰胺引起的壞死不同，后者缺乏炎癥反應［34］. 自殺基因/前藥促發(fā)的免疫反應的原理尚不清楚，可能由于腫瘤細胞壞死后，抗原成分更多地暴露，或在對壞死細胞的炎癥反應中，抗原提呈細胞得到補充或激活，從而引發(fā)延遲型腫瘤免疫反應，如同體內產生活的抗腫瘤疫苗. 有人認為CD基因表達的CD蛋白本身具有超級免疫原性，可刺激淋巴細胞產生交叉免疫反應. 進一步研究表明，免疫反應的出現(xiàn)與細胞因子的表達有關. HSV-tk+細胞暴露于GCV后，體內α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)、IL-6、γ干擾素(IFN-γ)和粒細胞菌落刺激因子(GM-CSF)水平均提高；HSV-tk+細胞表面共刺激性分子(costimulating molecules)ICAM和B7的表達增加. 有人發(fā)現(xiàn)，如果免疫缺陷性HSV-tk載體同時表達TNF-α，則HSV-tk/GCV抗腫瘤效應明顯提高.
2.4 其他作用 有人認為，死亡的HSV-tk+細胞可釋放含GCV-TP凋亡囊泡，野生型腫瘤細胞吞噬這些囊泡后會死亡. 但這些囊泡出現(xiàn)較遲，不能解釋早期發(fā)生的BSE. 有人認為HSV-tk/GCV可引起血管內皮細胞基因改造，通過對腫瘤血管的破壞而引發(fā)BSE［36］. 已知轉染HSV-tk基因的大鼠腦瘤，在暴露于GCV后，瘤內血管明顯減少.
3 消化系腫瘤的治療
迄今，已在許多腫瘤試驗了自殺基因療法的治療作用，這些腫瘤包括黑素瘤、神經膠質瘤、間皮瘤、肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、腹膜癌、宮頸癌等，但多半為體內、外臨床前研究，真正進入臨床Ⅰ/Ⅱ期研究的僅見于惡性胸膜間皮瘤(美國)、成膠質細胞瘤和轉移性黑素瘤(法國)等少數(shù)腫瘤. 在消化系腫瘤中，研究較多的是關于HSV-tk/GCV和CD/5FC對肝癌、結腸癌、胰癌和胃癌的治療作用.
3.1 肝癌 1993年Caruso et al［37］首先報告向大鼠實驗性轉移性肝癌組織內，注入含有表達HSV-tk重組逆轉錄病毒的包裝細胞，再給予GCV，引起腫瘤明顯退縮，瘤細胞數(shù)平均減至對照組的1/60. 應用重組腺病毒作為HSK-tk基因的載體，也得出類似結果. Kwong et al［38］給鼠肝植入乳腺癌細胞，制造實驗性肝癌，2wk后，瘤內注入表達HSV-tk的復制缺陷性腺病毒載體，結果顯示腫瘤明顯退縮，生存期明顯長于對照組(P＜0.01). HSV-tk/GCV可能特別適于治療肝腫瘤，這是因為：①迅速分裂的腫瘤細胞生長于非增生性、相對正常的肝組織中，而用于基因轉移的逆轉錄病毒載體對增殖旺盛的細胞最有親和力. 體外實驗表明，HSV-tk基因轉染的肝腫瘤細胞對GCV的敏感性是野生型細胞的500倍～1000倍［39］；②由于70%的肝細胞癌表達甲胎蛋白(AFP)，而正常肝細胞不表達此種蛋白，因此如應用AFP基因作為啟動子，可提高基因轉錄載體的靶向性，增加目的基因轉染肝癌細胞的效果［6，39-41］；③，由于肝腫瘤的血液供應主要來自肝動脈，因此如果從肝動脈輸注基因轉移載體和前藥，可能進一步增加基因轉移的靶向性，減少副作用［39］. Gerolami et al［42］在二乙基硝胺肝癌鼠模型，比較了經門脈、肝動脈和瘤內直接注射等3種途徑輸注重組腺病毒載體的效果，發(fā)現(xiàn)以肝動脈輸注產生的腫瘤抑制效應最顯著. HSV-tk/GCV對肝腫瘤的抑制作用尚見于肝外輸注自殺基因時，此很可能系“距離性旁觀者效應”發(fā)揮了作用. 向鼠腹腔內注入HSV-tk+和HSV-tk-結腸癌細胞，10d后，再向肝內注入HSV-tk-結腸癌細胞，所有動物均接受GCV. 結果顯示，不僅腹腔內HSV-tk+腫瘤和HSV-tk-腫瘤相比，明顯退縮，而且肝內HSV-tk-腫瘤在腹腔HSV-tk+腫瘤鼠也小于腹腔HSV-tk-腫瘤鼠. 腹腔HSV-tk+腫瘤鼠的肝內腫瘤內有大量單核細胞浸潤，伴纖維化，僅偶見存活的腫瘤細胞.
3.2 結直腸癌 CD/5FC系統(tǒng)看來更適合于治療結直腸癌. 體外實驗表明培養(yǎng)的結腸癌細胞中只要1/3表達胞嘧啶脫氨酶(CD)，即足以使前藥5FC轉化為足夠濃度的5FC，而使全部癌細胞的生長受到抑制；皮下移植的結腸癌組織中只要2%的癌細胞表達CD，在給予5FC后，腫瘤生長即完全停止. 如果將載有CD基因的腺病毒載體，直接注射入裸鼠皮下移植性結腸腫瘤內，再給予5FC，引起腫瘤縮小3/4～4/5. Rowley et al［17］報告表達CD的結直腸癌細胞對5FC的敏感性，比不表達CD的腺癌細胞高200倍以上，在7d內，90%以上癌細胞被殺死. 有人比較了經基因改造的結直腸癌細胞對前藥5FC或GCV的敏感性，發(fā)現(xiàn)GCV對HSV-tk+細胞的50%抑制濃度(IC50)為對野生型細胞的1/140，而5FC對CD+細胞的IC50僅為對野生型細胞的1/960；移植瘤內如果HSV-tk+細胞少于10%，則不顯示抗腫瘤效應，而CD+細胞僅需4%，實驗動物腫瘤生長便受到抑制.
結直腸癌對CD/5FC更為敏感的原因可能為：①腫瘤本身對5FC具有內在敏感性；②CD/5FC系統(tǒng)的旁觀者效應(BSE)較顯著. 在此系統(tǒng)中，BSE不取決于細胞-細胞間接觸，而取決于5FC的細胞間自由彌散. 現(xiàn)認為結直腸癌對HSV-tk/GCV的敏感性與癌細胞的類型有關. Link et al［43］發(fā)現(xiàn)在由HSV-tk+和HSV-tk-結直腸癌細胞構建的種植瘤，如果HSV-tk+細胞在全部癌細胞中占9%，在給予GCV后，發(fā)生腫瘤退縮；但某些類型HSV-tk+結直腸癌細胞對GCV呈現(xiàn)抗性，進一步研究發(fā)現(xiàn)這些細胞內HSV/tk基因部分或完全性脫落，免疫組化研究顯示細胞內HSV/tk蛋白缺乏［44］. McMaster et al［45］發(fā)現(xiàn)三種結腸癌細胞株中有二種在HSV-tk/GCV作用期間無明顯BSE發(fā)生. 分子雜交技術雖然在這些細胞測到裂隙連接蛋白connexin43，但免疫組化研究顯示，這種蛋白存在于細胞漿內，而不是在細胞表面；相反，呈現(xiàn)強有力BSE的結直腸癌細胞表面有connexin43表達. 由于細胞表面connexin43表達是HSV-tk/GCV治療時BSE發(fā)生的必要條件，因此某些類型結直腸癌細胞對HSV-tk/GCV缺乏敏感性［31］，可能主要與BSE不足有關，這對基因治療方法和適合病例的選擇具有實際意義.
3.3 胰癌 1994年DiMaio et al用重組逆轉錄病毒載體，將HSV-tk基因轉染胰癌細胞. 給免疫缺陷鼠皮下注射以各種比例混合的HSV-tk+和野生型胰癌細胞，全部動物均發(fā)生胰癌. 給予GCV后，腫瘤明顯消退，即使僅含10% HSV-tk+細胞的腫瘤也顯示瘤體積明顯縮小. 應用CEA基因作為啟動子，可提高病毒載體將目的基因轉入產CEA性胰癌細胞的耙向性. Ohashi et al［46］發(fā)現(xiàn)，用表達HSV-tk基因的腺病毒載體轉染胰癌細胞時，如采用一般的啟動子，則癌細胞對GCV的敏感性與CEA產生無關，如果采用CEA啟動子，則GCV殺傷作用在產CEA細胞明顯增強. 在胰癌的自殺基因/前藥治療中，BSE甚為顯著. Green et al［24］應用硝基還原酶ND/CB1954系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)胰癌細胞轉染ND基因后，對CB1954的敏感性提高500倍，在與野生型細胞混合培養(yǎng)中，只要10%的胰癌細胞表達ND，即足以引起強大BSE. 對于腹腔轉移性胰癌，腹腔內輸注表達自殺基因的病毒載體，往往可有效地誘發(fā)BSE. Rosenfeld et al［47］給BALB/c裸鼠腹腔內注入胰癌細胞誘發(fā)腫瘤形成，再注入表達HSV-tk基因的腺病毒載體，在注射GCV后，腫瘤明顯退縮，伴有強大BSE出現(xiàn). Aoki et al［48］作過類似實驗， 但采用脂質體作為載體，將HSV-tk基因注入腹腔，對照組24只鼠全部出現(xiàn)胰腫瘤伴腹腔播散，而治療組14只鼠中8只未見腫瘤生長.
3.4 胃癌 Yoshida et al［49］將包裝有HSV-tk基因的逆轉錄病毒轉染胃癌細胞，發(fā)現(xiàn)這種細胞對GCV呈現(xiàn)劑量和時間依賴性反應，在體外實驗中低至0.1μg/mL的GCV即可將胃癌細胞殺滅；在13只皮下接種HSV-tk+胃癌細胞的裸鼠中，12只的腫瘤在給予GCV后顯著退縮. 與結直腸癌相似，胃癌對HSV-tk/GCV的敏感性也以產CEA細胞最高. Tanaka et al［50］應用含CEA啟動子的重組逆轉錄病毒轉染HSV-tk基因，發(fā)現(xiàn)腹腔注射這種重組逆轉錄病毒后，30%產CEA性胃癌細胞選擇性表達HSV-tk基因，給予GCV后，腫瘤生長較未給予GCV的對照組減少20%. 類似地，如果以CEA基因作為啟動子，腺病毒載體也可將CD基因選擇性轉染于CEA陽性胃癌細胞. 有人認為，腹腔內注射以CEA基因作為啟動子的腺病毒介導的CD/5FU，可能是治療播散性胃癌的新途徑.
4 問題和前景
4.1 安全性 由于本身無毒性的前藥，僅在表達自殺基因的瘤細胞內才被轉化為活性物質，引起后者局部高濃度，因此，在理論上，本療法不會引起全身性副作用. 動物實驗證明這種療法是安全的. 臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗同樣顯示本療法不會引起嚴重的副作用. Klatzmann et al用鼠細胞包裝表達HSV-tk基因的逆轉錄病毒，然后將這種鼠細胞注入黑素瘤瘤體內，每次108～3×109細胞，共1次～3次，然后給予GCV 5mg/kg，2次/d，共14d. 共治療8例患者. 治療后3d～9d于注射局部發(fā)生炎癥反應，多數(shù)持續(xù)幾天后消失；伴中等度發(fā)熱，持續(xù)24h后自退. 無其他嚴重副反應. Klatzmann et al［51］在1998年又報告治療12例復發(fā)性膠質細胞瘤的結果. 在手術切除腫瘤后，于腔壁多部位注入含有HSV-tk+逆轉錄病毒的鼠Mll細胞8.7×106/cm2，7d后再輸注GCV 5mg/kg，2次/d共14d. 未見明顯副作用，無一例因此項治療而引發(fā)癥狀加劇或死亡. Sterman et al［52］報告胸腔內注射含HSV-tk基因的腺病毒載體，每次1012pfu，共治療12例胸膜間皮瘤患者. 多數(shù)患者在6h～12h內輕度發(fā)熱，48h～72h后消退，1例出現(xiàn)急性胸膜炎癥狀. 無明顯血液學異常. 胸腔插管周圍常發(fā)生皮疹，但不治而愈.
病毒載體可否在體內重新獲得復制能力，而引發(fā)播散性病毒感染自殺基因能否轉染非靶細胞，而引起各臟器損害目前的資料均持否定的看法. Klatzmann et al［51］曾在治療的1例患者中測到HSV-tk基因，但為一過性，未引起不良后果. 值得注意的是自殺基因療法治療肝癌，對肝功能有無影響尚有不同看法. Qian et al［53］發(fā)現(xiàn)在二乙基硝胺(DENA)誘發(fā)的鼠肝癌，HSV-tk/GCV治療后，在腫瘤退縮的同時，血清轉氨酶明顯升高，肝組織呈彌漫性損害. 但這可能由于DENA誘發(fā)的細胞增生，不僅見于肝癌結節(jié)，也發(fā)生于非癌性肝實質，以致非腫瘤性細胞也被HSV-tk基因轉染，而對GCV呈現(xiàn)敏感性. van de Eb et al［54］報告正常的非有絲分裂肝細胞能被表達HSV-tk的腺病毒載體轉染，以致在HSV-tk/GCV 治療后可發(fā)生嚴重肝功能異常. 但其他學者則認為該療法對肝無明顯副作用，肝癌組織內發(fā)生的旁觀者效應不會波及腫瘤外肝組織.
4.2 展望 自殺基因/前藥療法可使前藥在表達自殺基因的腫瘤內，轉為高效毒性物質，通過直接細胞毒性或旁觀者效應發(fā)揮抗腫瘤作用. 如果基因靶向表達能夠實現(xiàn)，則不僅正常組織免受損傷，而且可清除無法手術切除的癌灶或轉移灶. 但迄今為止，該療法主要尚處于臨床前試驗階段，僅有少數(shù)進入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗，療效也難稱滿意. 提高療效的關鍵看來是真正做到靶向表達. 雖然某些腫瘤特異性啟動子驅動的自殺基因可轉染特殊瘤細胞內，但這種特異性是相對的，也可轉染正常細胞；而且，病毒載體在腫瘤組織內不可能均勻分布，更不可能轉染每個腫瘤細胞. 為了提高靶向性，有人主張采用復制型而不采用免疫缺陷性病毒載體，認為前者可在腫瘤內形成次級循環(huán)感染(secondary round of infection)［1］，提高轉染效果；也有人主張采用不同的病毒載體，以轉染不同類型的腫瘤組織或同一類型腫瘤的不同細胞. 由于病毒載體引入機體后，可誘發(fā)抗病毒抗體，而影響病毒載體的轉染效果，因此采用不同的病毒載體尚有可能進行反復治療.
努力提高旁觀者效應(BSE)，對增強自殺基因/前藥療效有重要意義. 自殺基因/前藥系統(tǒng)不同，BSE的機制也可不同，例如HSV-tk/GCV系統(tǒng)的BSE有賴于細胞裂隙連接的表達，而某些腫瘤不表達或甚少表達裂隙連接，顯然不適于HSV-tk/GCV療法，因此，篩選適合某一療法的腫瘤甚為重要；也可應用藥物促進裂隙連接的表達. 前藥的選擇也很重要，應發(fā)展新的半壽期長的高效前藥，并探討最適劑量和給藥方式. 此外，聯(lián)合應用不同的自殺基因/前藥系統(tǒng)，將自殺基因和細胞因子基因聯(lián)合轉染入腫瘤，或聯(lián)合應用常規(guī)抗癌療法或免疫促進因子，以形成疊加殺傷效應，等，均是目前正在研究的課題. 相信在不遠的將來，自殺基因療法一定會有新的突破.
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