第6章 細(xì)菌L型
細(xì)胞壁缺損或完全喪失的細(xì)菌稱為細(xì)菌L型（bacterial L form)。在高滲環(huán)境下，L型仍可存活，能在體內(nèi)長期存留，并可返祖為原菌而恢復(fù)致病性；有些L型本身也具有一定的致病力，在臨床上常常引起某些慢性和反復(fù)發(fā)作感染，成為醫(yī)院感染的特殊菌型�？股氐倪^度使用和濫用可導(dǎo)致細(xì)菌L型感染日益增多。因此，深入了解細(xì)菌L型的生物學(xué)特性、誘導(dǎo)機制和致病性，對診斷和防治L型感染具有重要意義。
細(xì)菌L型最早由Klieneberger于1935年從念珠狀鏈桿菌中的陳舊培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)。L型可自發(fā)產(chǎn)生，亦可在抗菌治療過程中或在患者的某些特殊生境內(nèi)產(chǎn)生，它可能是細(xì)菌抵抗不利環(huán)境的方式之一。細(xì)菌自發(fā)產(chǎn)生L型的機制尚不十分清楚，可能與細(xì)菌的自身代謝或所處生長環(huán)境等有關(guān)。絕大多數(shù)細(xì)菌L型可通過人工誘導(dǎo)獲得，人工誘發(fā)的頻率遠(yuǎn)比自發(fā)的高。
細(xì)菌L型可在體內(nèi)產(chǎn)生。從一些用過抗生素的慢性泌尿道感染患者體內(nèi)往往能分離出多形性的細(xì)菌L型。L型亦可在體外誘導(dǎo)形成。在L型培養(yǎng)基（高滲、含血清)中加入一定濃度的誘導(dǎo)劑，然后接種細(xì)菌，即可誘導(dǎo)出L型。人工誘導(dǎo)細(xì)菌L型產(chǎn)生的因素很多，根據(jù)作用機制主要分為三大類：
(一)干擾細(xì)胞壁合成的因素
主要包括一些能干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成過程中某一代謝途徑的抗生素，如β-內(nèi)酰胺類抗生素、糖肽類抗生素等。
作用于肽聚糖多肽鏈結(jié)構(gòu) 青霉素和頭孢菌素同屬β-內(nèi)酰胺類抗生素，其中的β-內(nèi)酰胺環(huán)與肽聚糖上肽鏈末端D-Ala-D-Ala結(jié)構(gòu)相似，二者可競爭性地與細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)相結(jié)合。PBP大多是肽聚糖合成所需要的酶，包括轉(zhuǎn)肽酶、羧肽酶與肽鏈內(nèi)切酶等。β-內(nèi)酰胺類抗生素與PBP結(jié)合，使之失去酶活性，從而阻斷肽聚糖上的多肽鏈之間相互交聯(lián)形成牢固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)菌則不能正常合成細(xì)胞壁而變成L型。
各種細(xì)菌誘導(dǎo)出L型所需的抗生素濃度不同。例如，當(dāng)培養(yǎng)基中青霉素濃度為1～50u/ml時，可影響細(xì)菌分裂時的縱隔形成，故細(xì)菌繼續(xù)延長不能斷裂，形成長絲；若青霉素量增至100u/ml時，則細(xì)胞壁中肽聚糖的合成大量受到抑制，新生的細(xì)菌因缺乏細(xì)胞壁而成為圓球體或巨形體。
某些氨基酸，如甘氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸能誘導(dǎo)鼠傷寒沙門菌、流感嗜血桿菌等形成L型，其中甘氨酸作用最佳。甘氨酸能替代丙氨酸等合成肽聚糖所必須的氨基酸，使肽聚糖不能交聯(lián)。若將甘氨酸與溶菌酶、青霉素或環(huán)絲氨酸同時加入，則有協(xié)同作用。
作用于肽聚糖多糖鏈結(jié)構(gòu) 細(xì)胞壁上的肽聚糖由多糖鏈與多肽鏈構(gòu)成。萬古霉素能與N-UDP-乙酰胞壁酸五肽末端的D-Ala-D-Ala結(jié)合，形成復(fù)合物，阻斷肽聚糖多糖鏈的延伸，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁缺陷。
作用細(xì)胞壁上其他結(jié)構(gòu)成分 異煙肼可影響結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中分枝菌酸的合成，使該菌變?yōu)長型。桿菌肽的作用主要阻礙細(xì)胞壁中的脂質(zhì)的脫磷酸化，使脂質(zhì)在肽聚糖的合成過程中不能進入再循環(huán)。
（二)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的因素
吞噬細(xì)胞溶酶體內(nèi)的溶菌酶可直接裂解肽聚糖多糖鏈中的β-1，4糖苷鍵，破壞聚糖骨架，引起細(xì)菌裂解形成L型。溶菌酶對G＋菌作用比G－菌顯著，原因是G－菌肽聚糖層外有脂質(zhì)外膜屏障，可阻擋溶菌酶與肽聚糖的接觸。若加入EDTA除去其表層，則溶菌酶作用加強。
膽汁或膽鹽是有效的誘導(dǎo)劑，不但能誘導(dǎo)細(xì)菌，甚至能誘導(dǎo)真菌形成L型。膽汁除對脂質(zhì)外膜有作用外，還能激活自溶酶裂解細(xì)胞壁，因此，膽汁對G＋菌和G－菌均有作用。膽汁高滲環(huán)境能保護L型長期存活，而L型又具回復(fù)的作用，這可能是傷寒等長期帶菌者反復(fù)排菌的原因。
噬菌體可釋放類似溶菌酶的溶胞壁素(muralysin)，故亦具誘導(dǎo)作用，如噬菌體可成功地誘導(dǎo)出鼠疫桿菌L型。
(三)免疫因素
主要包括吞噬細(xì)胞、抗體和補體。從未經(jīng)抗生素治療的患者組織或體液中可分離出L型，表明宿主免疫因素可誘導(dǎo)細(xì)菌變?yōu)長型。通常細(xì)菌侵入宿主，首先被吞噬細(xì)胞吞噬，但被吞噬的細(xì)菌不—定都被殺死。例如，在支氣管鏡檢查刷片中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)有大量抗酸菌L型圓球體、巨形體，表明結(jié)核分枝桿菌L型與細(xì)菌型一樣，可在細(xì)胞內(nèi)寄生，并通過巨噬細(xì)胞使感染擴散。
抗體與補體的協(xié)同作用亦能使細(xì)菌變?yōu)長型。例如，將傷寒沙門菌活菌懸液加入到特異性抗體和補體中，混勻后置37℃孵育，經(jīng)不同時間取菌液接種于L型平板上，結(jié)果于第15min取出的材料中分離出L型。單用抗體或補體處理則不能誘導(dǎo)出L型。
感染的細(xì)菌在宿主生理條件下也可變?yōu)長型。例如，尿液中的尿素能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，誘導(dǎo)細(xì)菌形成L型。腎髓質(zhì)高滲條件有利于L型的存活。因此，細(xì)菌L型可能與泌尿系感染反復(fù)發(fā)作和遷延不愈有關(guān)。
在受細(xì)菌感染的宿主中往往上述各種因素同時存在，例如，結(jié)核分枝桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后易變成細(xì)菌L型，誘導(dǎo)因素可能包括抗生素、抗體、補體和溶菌酶等，尤其是抗生素的長期使用，使得侵入宿主的細(xì)菌容易變成L型。一般認(rèn)為，從臨床分離的L型毒力較低，在宿主組織中可以持續(xù)很久。所以，低毒株的細(xì)菌比強毒株容易誘導(dǎo)，L型易從輕度感染與反復(fù)發(fā)作的感染中分離出。
細(xì)菌在含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初次接觸而形成的L型很不穩(wěn)定。若移種至不含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，易恢復(fù)為原來的細(xì)菌，這一過程稱為回復(fù)（reversion)。能迅速回復(fù)為原菌的L型稱為不穩(wěn)定L型（unstableL-form)。不穩(wěn)定L型在含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上反復(fù)傳代，L型的生物學(xué)特性可逐漸變得相對穩(wěn)定，不易回復(fù)，若在不含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上多次傳代也不回復(fù)，則成為穩(wěn)定L型（stableL-form)。
L型與原菌許多特性不同是屬于表型還是遺傳型變異尚未定論，主要原因是：①誘導(dǎo)劑起什么作用？一般人工誘導(dǎo)所用的誘導(dǎo)劑都是一些比較溫和的物質(zhì)，僅影響細(xì)菌代謝的某一環(huán)節(jié)，而不是一些劇烈的可導(dǎo)致細(xì)菌DNA發(fā)生改變的物質(zhì)；②用一種誘導(dǎo)劑所產(chǎn)生的L型有不穩(wěn)定L型與穩(wěn)定L型之分，這是細(xì)菌對誘導(dǎo)劑的適應(yīng)，由量變而到質(zhì)變的結(jié)果，還是突變與選擇的結(jié)果？例如，一株糞鏈球菌的穩(wěn)定L型可失去約4%～6%基因組，相當(dāng)于1000個基因片段。這些基因的丟失是形成L型的原因還是形成L型的后果，尚不清楚。
在研究細(xì)菌L型的誘導(dǎo)與回復(fù)機制中，發(fā)現(xiàn)100多株星形諾卡菌L型的回復(fù)菌并不完全等同于原菌。經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)，每—個回復(fù)菌至少有1個以上的特性與原菌不同，如細(xì)胞壁中分枝菌酸、多糖、脂肪酸等都有可能與原菌不同。此外，誘導(dǎo)方法的不同與誘導(dǎo)時間的長短亦可影響到細(xì)胞壁的成分，進而影響回復(fù)菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性，這說明細(xì)菌變?yōu)長型涉及DNA的改變，是屬于一種多功能的突變，而L型的回復(fù)是另一次突變。回復(fù)菌只在外表上與原菌相似，可產(chǎn)生細(xì)胞壁，仍可有個別特性與原菌不同，所以是一種回復(fù)突變(backwardmutation)。
大小和形態(tài) 各種細(xì)菌具有一定的外形，這主要取決于其最外層的細(xì)胞壁。細(xì)菌L型因細(xì)胞壁缺損，不能按正常方式進行繁殖，故呈現(xiàn)多形性。在顯微鏡下可觀察到三種類型：大小不等的球狀、膨大的桿狀和細(xì)長的絲狀。有的比原菌大，有的比原菌小。球狀L型依其直徑大小，可將＜0.5μm的稱為原生小體，1μm左右的稱圓球體，1.5～50μm的稱巨形體（圖6-1)。L型能通過孔徑0．45μm濾菌器，故又稱為濾過型細(xì)菌。
L型長絲體的長度可因培養(yǎng)時間長短而不同，初長出的L型菌落中絲狀體較長，隨著培養(yǎng)時間延長，長絲逐漸斷裂變短。各種細(xì)菌，不論是球菌或桿菌，變?yōu)長型后在生長過程中均可觀察到這些不同形態(tài)的出現(xiàn)。
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染色性 細(xì)菌變?yōu)長型后染色性多變。經(jīng)革蘭染色后，不論原菌是G＋菌或G－菌，一般變?yōu)長型后均呈陰性。但有時G＋菌變?yōu)長型后仍為陽性，或在一張涂片上可見G＋菌和G－菌混雜的現(xiàn)象，這主要取決于細(xì)胞壁缺失程度。
檢查細(xì)菌是否存在細(xì)胞壁缺失須用細(xì)胞壁染色法，常用方法是：先用鞣酸處理細(xì)菌，鞣酸能結(jié)合在細(xì)胞壁上，然后用結(jié)晶紫染色。細(xì)胞壁完整則細(xì)胞壁染成紫色，細(xì)菌內(nèi)部無色；若細(xì)菌已失去細(xì)胞壁，則染料可滲入細(xì)胞內(nèi)，使整個細(xì)菌內(nèi)部都染成紫色。
細(xì)胞膜 細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與多糖組成。穩(wěn)定L型脫離誘導(dǎo)劑不易回復(fù)為原菌，在等滲環(huán)境下也不易破裂，說明細(xì)菌逐漸變?yōu)榉�(wěn)定L型后，細(xì)胞膜已代償性地發(fā)生了改變，變得牢固。推測細(xì)胞膜的變化主要是：①細(xì)胞膜中各種成分的比例發(fā)生了改變；②細(xì)胞膜的合成速度加快；③細(xì)胞膜中產(chǎn)生了新的成分。
在低滲環(huán)境中，細(xì)菌L型的脂肪酸可以代償性地增加，以加強膜的牢固性。L型對滲透壓的適應(yīng)性與細(xì)胞膜內(nèi)的脂肪酸成分有關(guān)，特別是飽和／不飽和脂肪酸的比例。飽和脂肪酸合成增多，飽和／不飽和脂肪酸比例升高，可使膜的彈性強度增強，以承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差別。比例越高，培養(yǎng)基中NaCl濃度需要愈低。
與細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白質(zhì)對膜的牢固程度也有重要意義。L型膜蛋白的改變可增加脂質(zhì)鏈的強度。
核質(zhì)與質(zhì)粒 L型的核質(zhì)與原菌不同。將細(xì)菌置于含青霉素培養(yǎng)基內(nèi)，在1～2h后，見核質(zhì)團聚成1～2個染色體顆粒。顆粒逐漸增殖，排列成花環(huán)狀，分布于細(xì)胞周圍。
質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，可編碼許多重要的生物學(xué)活性，包括抗藥性和毒力等。細(xì)菌形成L型后細(xì)胞壁缺失，隨著傳代次數(shù)增加，質(zhì)粒較易丟失。
鞭毛與菌毛 鞭毛位于菌體表面，是細(xì)菌的運動器官，有鞭毛的細(xì)菌可以在液體中自主運動。細(xì)菌變?yōu)長型后，鞭毛是否仍能保留，取決于細(xì)胞壁缺失的程度。
菌毛是許多G－菌和少數(shù)G＋菌菌體表面存在的絲狀物，與細(xì)菌的致病性有關(guān)。細(xì)菌變?yōu)榉�(wěn)定L型后可失去菌毛。
繁殖方式 細(xì)菌L型能以獨特的方式繁殖。一種是以不均等的二分裂進行繁殖，或分裂而不斷裂，呈鏈狀、桿狀、長絲體等；另一種是以巨型體釋放原生小體的方式繁殖，原生小體逐漸長大成為圓球體，圓球體再長大成為巨型體，巨型體內(nèi)形成許多致密的原生小體，巨型體成熟破裂釋放出具有完整基因信息的原生小體，新釋放的原生小體進入新的生活周期。
營養(yǎng)要求 細(xì)菌L型營養(yǎng)要求基本上與原菌相同，但因缺乏細(xì)胞壁而對滲透壓敏感，在普通培養(yǎng)基中不能生長，故分離培養(yǎng)時必須提供高滲環(huán)境，需要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（腦-心浸液、蛋白胨-酵母浸液或牛肉浸液)中加入一定量的滲透壓穩(wěn)定劑與血清。滲透壓穩(wěn)定劑可用3%～5%NaCl或15%蔗糖。一般需加滅活血清10%～20%(v／v)，以馬與人血清為佳。制備固體培養(yǎng)基加入的瓊脂量以0.8%～1%為宜。
培養(yǎng)特性 在液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌L型生長繁殖比原菌慢，其增殖時間的長短與細(xì)菌細(xì)胞壁缺損的程度有關(guān)。如變形桿菌每分裂一次只需l0～15min，不穩(wěn)定L型分裂一次約需60min，穩(wěn)定L型則需2h左右。L型由于細(xì)胞壁表面電荷改變，凝聚力大于排斥力，故在液體中常呈顆粒狀生長，粘附于管壁或沉于管底，液體常澄清或微微混濁。
細(xì)菌L型在固體培養(yǎng)基上生長時，可以軟瓊脂為支架，緩慢生長，形成嵌入培養(yǎng)基中的細(xì)小菌落。在低倍鏡下可見菌落中心呈致密的細(xì)顆粒，周邊繞著一圈透明的粗顆粒或絲狀物，呈“油煎蛋”狀。此外，尚有顆粒狀（G型)和絲狀(F型)菌落，前者全部由粗顆粒組成，無核心；后者中心致密，周邊或整個菌落由長絲構(gòu)成的。這三種菌落在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)變。
細(xì)菌L型培養(yǎng)時對氣體、溫度的要求一般與原菌相同。
由于細(xì)菌L型細(xì)胞壁的缺損程度、變異的穩(wěn)定程度、以及膜與壁化學(xué)成分的改變的不同，細(xì)菌變?yōu)長型后其代謝反應(yīng)改變較大。一般認(rèn)為L型的生化反應(yīng)是減弱而非增強。隨著L型的回復(fù)，生化反應(yīng)可以部分或全部回復(fù)。因此，細(xì)菌變?yōu)長型后沒有規(guī)律性的生化特性，必須回復(fù)后才能進行鑒定。
細(xì)菌變?yōu)長型后許多特性與原菌不同，臨床標(biāo)本中分離到L型很難從其特性來決定原菌的菌種。因此，必須將所分離的L型在培養(yǎng)基上接種使其回復(fù)，然后根據(jù)回復(fù)菌的特性鑒定。一般臨床分離的L型多屬不穩(wěn)定株，接種后迅速回復(fù)，但也遇到較穩(wěn)定或完全不能回復(fù)的穩(wěn)定株，則需用血清學(xué)方法或DNA分子雜交法加以鑒定。
細(xì)菌L型仍具有抗原性，使用穩(wěn)定L型免疫動物可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。L型因細(xì)胞壁的缺損，可造成某些細(xì)胞壁抗原成分的丟失或細(xì)胞膜抗原的暴露，因此，抗原性改變的程度取決于細(xì)胞壁缺損的程度。例如，傷寒沙門菌變成L型后，其菌體（O)、毒力（Vi)抗原減弱或消失，鞭毛（H)抗原性不變。不過，關(guān)于細(xì)菌型及其L型之間是否有抗原性的差異意見不一。
一般細(xì)菌L型對物理因素如溫度、射線等抵抗力比原菌弱，但對作用于細(xì)胞壁的抗生素如青霉素等，具有耐性。在高滲環(huán)境下可以存活較長時間。
某些細(xì)菌L型本身仍可保留一定的致病力。細(xì)菌的許多致病因子存在于細(xì)胞壁上，L型因細(xì)胞壁缺陷致病性必然減弱，但并非全部消失。如革蘭陰性菌變成L型后，外膜上仍可存留一定量的脂多糖（內(nèi)毒素)；又如，金黃色葡萄球菌L型仍能產(chǎn)生腸毒素A。有的細(xì)菌L型可能失去致病性，但可返祖成為原菌后恢復(fù)致病性。例如，變形桿菌L型可引起慢性腎盂腎炎，在急性發(fā)作時出現(xiàn)大量回復(fù)菌。
不同細(xì)菌L型所致的病理表現(xiàn)大體相似，但由于失去細(xì)胞壁，許多抗原成分和毒力因子減弱或消失，在體內(nèi)引起的病理變化與原菌不同，易導(dǎo)致臨床漏診、誤診。
外毒素 L型外毒素的編碼基因仍可檢測到，但外毒素分泌能力通常低于細(xì)菌型，致病力亦大大減弱，故臨床L型感染多數(shù)是慢性過程。但有的L型（如破傷風(fēng)梭菌L型)產(chǎn)生毒素能力反而增強。
內(nèi)毒素 細(xì)菌形成L型后，其內(nèi)毒素含量可明顯減少為原菌的1/3～1/2。L型在宿主體內(nèi)裂解后可釋放內(nèi)毒素，引起明顯的組織損傷。
直接與細(xì)胞作用 細(xì)菌L型能與細(xì)胞發(fā)生粘附引起致病。用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)單核細(xì)胞李氏菌L型能持續(xù)粘附在巨噬細(xì)胞表面達(dá)15d之久，而細(xì)菌型只能粘附7d。將葡萄球菌及其L型分別注射到大鼠腹腔后，在感染后至第15d，可從腹腔滲出液中分離出葡萄球菌，而L型菌可持續(xù)存在30d以上，在電鏡下可見腹腔滲出液中L型不但粘附在巨噬細(xì)胞表面，還侵入巨噬細(xì)胞內(nèi)生長。
免疫病理損傷作用 細(xì)菌L型抗原性的改變使其逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，在宿主體內(nèi)長期存在，引起持續(xù)性和反復(fù)發(fā)作的慢性疾病。同時，因細(xì)胞壁的缺損，使某些細(xì)胞膜成分(如LPS等)暴露，可刺激宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，引起免疫生理和病理變化，激活免疫細(xì)胞，刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)等。
免疫印跡分析結(jié)果顯示，L型細(xì)胞膜有較強的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生α-腫瘤壞死因子(TNF-α)的活性。將金黃色葡萄球菌L型與巨噬細(xì)胞共同孵育后，發(fā)現(xiàn)金葡菌L型能誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒活性。用抗鼠TNF-α抗體能中和約90%的細(xì)胞毒活性，提示大部分細(xì)胞毒活性是由TNF-α引起的。細(xì)菌L型刺激宿主產(chǎn)生TNF-α等細(xì)胞因子，既有增強防御功能的作用，但同時又參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷等免疫病理過程。
從膿汁、關(guān)節(jié)腔液、血液、腎盂腎炎尿液、胸腹水、膽汁、腦脊液，以及泌尿道、呼吸道分泌物等臨床標(biāo)本中均可分離出細(xì)菌L型，提示L型感染部位廣泛。細(xì)菌變?yōu)長型后致病性減弱，但由于它能在體內(nèi)長期存留，并能隨時回復(fù)為原菌，因此，L型具有以下致病特點：
（1)患者感染癥狀多為慢性遷延不愈、反復(fù)發(fā)作。
（2)病變多為以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤為主的慢性、局部病灶、間質(zhì)性炎癥病理學(xué)改變，與病毒、支原體等無細(xì)胞壁微生物感染相似。
（3)易發(fā)現(xiàn)的膿腫和菌血癥。
（4)在使用抗生素后體溫一度下降而再上升，不典型的發(fā)熱或無規(guī)律的弛張熱。
風(fēng)濕熱 臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)炎、全心炎為主。目前認(rèn)為風(fēng)濕熱與鏈球菌感染有關(guān)，但是，在風(fēng)濕熱患者體內(nèi)鏈球菌檢出率卻非常低，一般為0.3%～3%，而有學(xué)者報道患者血標(biāo)本中鏈球菌L型分離率竟高達(dá)83%。國內(nèi)學(xué)者通過體外實驗證明，鏈球菌在含芐星青霉素的L型培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后，可產(chǎn)生L型。以上提示許多慢性扁桃體炎反復(fù)發(fā)作時，雖用青霉素治療，仍未見好轉(zhuǎn)，可能是鏈球菌未被消除，反而轉(zhuǎn)變?yōu)長型潛伏下來。鏈球菌L型具有完整的細(xì)胞膜，與人體心肌的纖維膜、心瓣膜及關(guān)節(jié)組織的糖蛋白有共同抗原，可引起變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致風(fēng)濕熱。
結(jié)核病 WHO統(tǒng)計表明，近年來結(jié)核病發(fā)病率呈明顯上升趨勢，其原因之一是結(jié)核分枝桿菌易產(chǎn)生多重耐藥性和L型變異，導(dǎo)致結(jié)核病遷延不愈。結(jié)核分枝桿菌L型可用D-環(huán)絲氨酸、異煙肼、甘氨酸加溶菌酶等誘導(dǎo)成功，亦可自發(fā)產(chǎn)生。
結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)長型后，其形態(tài)、染色性均出現(xiàn)很大差異，尤其是抗酸性改變常給臨床診斷帶來困難。由于結(jié)核分枝桿菌微生物學(xué)檢查的特殊性，致使結(jié)核病的診斷較為困難。例如，研究發(fā)現(xiàn)痰涂片鏡檢52.2%陽性，分離培養(yǎng)陽性率僅7.7%，因為結(jié)核分枝桿菌L型在常規(guī)羅氏（Lowensrein-Jensen)培養(yǎng)基上不能生長，故易造成漏診。結(jié)核分枝桿菌可經(jīng)血行播散引起全身各器官感染，但從血液中分離結(jié)核分枝桿菌較困難。
研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞內(nèi)存在大量抗酸菌、L型圓球體、巨形體，說明結(jié)核分枝桿菌L型與細(xì)菌型一樣，可在細(xì)胞內(nèi)寄生，并通過巨噬細(xì)胞使感染擴散。此外，在血液、前列腺增生組織、男性不育者精液、咽感異常者咽部涂片組織中查到結(jié)核分枝桿菌L型，證明結(jié)核分枝桿菌L型可在不同器官內(nèi)增殖，與多種疾病有關(guān)。
結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分與致病性密切相關(guān)，故一般認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌L型致病性減弱，往往不會引起典型的結(jié)核結(jié)節(jié)，僅為非特異性炎癥。引發(fā)的肺結(jié)核臨床特征為：起病緩慢，中毒癥狀輕，不典型，病程長呈遷延，頑固性咳嗽或伴少痰，偶而有咯血，易被誤診為急、慢性支氣管炎或支氣管肺炎，而抗生素治療癥狀改善不明顯。
L型也是結(jié)核分枝桿菌抵抗外界環(huán)境和賴以生存的重要形式。結(jié)核分枝桿菌L型可在體內(nèi)長期存活和生長繁殖，導(dǎo)致結(jié)核病緩慢地進展。如果L型大量繁殖則引起L型敗血癥。結(jié)核分枝桿菌L型雖然毒力減弱，但可回復(fù)為細(xì)菌型而導(dǎo)致病變趨向活動，結(jié)核病惡化。因此，結(jié)核分枝桿菌L型也是重要的傳染源之一，故應(yīng)高度重視結(jié)核分枝桿菌L型的檢出。結(jié)核病患者檢出L型，說明結(jié)核分枝桿菌仍末完全消除，顯示了結(jié)核病復(fù)發(fā)的高度危險性，應(yīng)繼續(xù)實施抗結(jié)核治療，故應(yīng)將L型菌檢測作為結(jié)核活動與治療的標(biāo)準(zhǔn)之一加以重視。
與腫瘤發(fā)生的關(guān)系 細(xì)菌L型由于細(xì)胞壁缺陷，與病毒有相似的生物學(xué)特性和致病性，作為一種慢性致病因子可長期在體內(nèi)存活，通過致細(xì)胞突變而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生有其理論依據(jù)。目前認(rèn)為，L型感染誘發(fā)腫瘤的機制可能有：①在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，通過阻斷溶酶體的融合或抵抗酸性環(huán)境而長期定居于細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞增生或異型增生；②炎癥及細(xì)菌代謝產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的直接損害，如刺激吞噬細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基、活性氧及其它小分子量的斷裂因子，導(dǎo)致細(xì)胞DNA鏈的損傷、斷裂，或使DNA發(fā)生錯誤修復(fù)，從而引起細(xì)胞突變或惡性轉(zhuǎn)化；③細(xì)菌DNA與宿主細(xì)胞DNA整合導(dǎo)致細(xì)胞癌變。
目前已在人類葡萄胎、乳腺癌、鼻咽癌、惡性淋巴瘤和肺癌組織等多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)檢出細(xì)菌L型。用原位核酸雜交技術(shù)也證實宮頸癌細(xì)胞核內(nèi)有金黃色葡萄球菌L型DNA存在，金葡菌及其L型感染實驗小鼠，能誘導(dǎo)小鼠發(fā)生惡性腫瘤。從霍奇金病患者腫瘤組織中可分離出細(xì)菌L型，并證明細(xì)菌L型能引起急性霍奇金病。膽囊腺癌、慢性炎癥中L型感染與p21、p53過度表達(dá)有關(guān)，提示L型參與了ras、p53基因突變，并可能通過致基因突變而成為膽囊腺癌發(fā)生的危險因素之一。約有30%～50%的胃癌發(fā)病與幽門螺桿菌（Hp)感染有關(guān)，Hp與胃腺癌和淋巴瘤關(guān)系密切（參見第9章)。
敗血癥 遷延性細(xì)菌L型敗血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：連續(xù)2次或多次從血液或骨髓液檢出細(xì)菌L型，回復(fù)后為同一細(xì)菌，且有以下癥狀之一者：①間斷性發(fā)熱在一月以上者；②入院前經(jīng)抗生素治療2周以上，發(fā)熱后能控制或發(fā)熱經(jīng)治療一度下降而后再度上升者；③患者低熱或無熱，有全身中毒癥狀或心、腎及淋巴結(jié)受損病程在一月以上。臨床表現(xiàn)以各種類型發(fā)熱為主。
引起L型敗血癥的原因有：小劑量青霉素使用史；炎性病灶未徹底清除或病灶隱蔽不易發(fā)現(xiàn)，如急性扁桃體炎發(fā)熱一退就停藥，急性尿路感染等病狀一緩解就停藥，使已侵入血液的細(xì)菌未能完全殺滅；患者存在免疫力低下的基礎(chǔ)病，如腫瘤、糖尿病等，正常免疫功能不足以殺死細(xì)菌，使之變?yōu)長型滯留體內(nèi)。
膽囊感染 L型細(xì)菌可能是某些傳染病(如鼠疫、結(jié)核病和霍亂等)病原體的一種保存形式。很早人們就發(fā)現(xiàn)人體膽囊可長期攜帶傷寒沙門菌而成為慢性帶菌者，成為潛在的危險傳染源，但對其形成機制不甚明了。從常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查陰性的慢性膽囊炎患者的膽囊組織、膽汁及膽石中可分離出細(xì)菌L型，檢出率高達(dá)86%～100%，膽囊中檢出的細(xì)菌L型絕大多數(shù)是穩(wěn)定L型。由于L型細(xì)胞壁缺陷，易粘集成堆，并可能與脫落的粘膜上皮細(xì)胞共同構(gòu)成膽結(jié)石的核心，引起慢性膽囊炎與膽囊結(jié)石。體外試驗已經(jīng)證實，膽汁可以誘導(dǎo)傷寒沙門菌、霍亂弧菌等形成L型，且L型可長期存活。霍亂弧菌L型仍具產(chǎn)腸毒素基因，并可產(chǎn)毒致病，這從生物學(xué)特性上闡明了霍亂和傷寒等病原菌膽囊慢性帶菌的形成機制。
醫(yī)院感染開始可為普通細(xì)菌感染，經(jīng)抗生素治療后形成L型，成為L型感染，但因細(xì)菌L型培養(yǎng)未能廣泛開展而較少發(fā)現(xiàn)。造成細(xì)菌L型醫(yī)院感染的主要因素有：①宿主免疫力降低。L型引起的醫(yī)院感染多發(fā)生于慢性病、免疫力低下的患者�；颊咴诜歉腥拘约膊』蛟l(fā)病的基礎(chǔ)上繼發(fā)L型感染，病情較重，尤其是金黃色葡萄球菌與鼠傷寒沙門菌感染往往病情危重；②長期大量應(yīng)用廣譜抗生素。抗生素的廣泛和大劑量使用和濫用，使耐藥性菌株和細(xì)菌L型日益增多�，F(xiàn)有種種跡象表明，細(xì)菌L型已構(gòu)成醫(yī)院感染的重要病原因素之一；③感染性疾病沒有及時治療；④慢性遷延性疾病。
引起醫(yī)院感染的細(xì)菌L型中，革蘭陰性菌和陽性菌L型感染檢出率大致相同，其中，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為主。
在醫(yī)院醫(yī)療設(shè)施表面、陳舊的苯扎溴銨（新潔爾滅)消毒液和敷料、棉球、產(chǎn)包等滅菌物品，以及醫(yī)護人員手部，細(xì)菌L菌的檢出率可高達(dá)37.6%。檢出的L型菌株主要以銅綠假單胞菌、球菌為主。臨床一些常用消毒劑（如碘伏、苯扎溴銨)能誘導(dǎo)醫(yī)院感染常見細(xì)菌（如銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等)形成L型。
由于細(xì)菌L型不易為常規(guī)培養(yǎng)方法所發(fā)現(xiàn)，特別是L型細(xì)菌的耐藥性與其細(xì)菌型不同，治療困難。因此，如果不重視預(yù)防L型感染，這將是構(gòu)成醫(yī)院感染的潛在禍害。
細(xì)菌L型因細(xì)胞壁全部或部分缺失，失去或減少了與細(xì)胞壁相關(guān)的抗原成分，似乎可以躲避相應(yīng)的特異性抗體的攻擊作用，有利于在宿主體內(nèi)的存活。但實際上，正常宿主對細(xì)菌L型有很強的殺傷和清除能力。
有些L型能刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，如口服霍亂弧菌L型可產(chǎn)生分泌型抗體與血清抗體，前者主要是一些分泌性IgA，具有中和毒素、抗粘附與抗凝集的作用。
L型也能激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。由L型激活的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞均能參與抗菌免疫，且細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力與L型細(xì)菌的定植有關(guān)。例如，傷寒沙門菌L型和傷寒沙門菌減毒活疫苗一樣，能在宿主肝細(xì)胞內(nèi)定植，使宿主產(chǎn)生免疫力，而且傷寒沙門菌L型刺激宿主產(chǎn)生的免疫力比傷寒沙門菌減毒活疫苗產(chǎn)生的免疫力持久，因為傷寒沙門菌L型細(xì)菌在肝細(xì)胞內(nèi)存活時間較減毒活疫苗長。
有些L型能同時誘發(fā)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。如大腸埃希菌L型能增加宿主對同種親代菌株的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答能力。
正常人血清能夠抑制、殺滅某些G＋菌和G－菌的L型，但不能殺滅其細(xì)菌型，提示完整的細(xì)胞壁是細(xì)菌的一個保護性屏障。細(xì)菌變?yōu)長型后失去細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜暴露于血清或組織液中，更易與某些特異性抗體、補體相遇而起溶解殺傷作用。
細(xì)胞膜抗原成分也參與細(xì)菌L型的免疫反應(yīng)。由于細(xì)胞壁的缺損，使某些細(xì)胞膜成分如LPS、某些膜蛋白等暴露，有些L型還可合成新的蛋白成分，這些都可刺激宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，如激活巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，間接激活免疫活性細(xì)胞，達(dá)到清除細(xì)菌的作用。
造成臨床細(xì)菌L型感染的原因可能是：宿主某些部位如腎臟髓質(zhì)因鹽類濃度很高，使補體不能活化，致使抗體-補體系統(tǒng)的殺菌作用不能有效發(fā)揮，細(xì)菌L型得以長期存活；宿主因先天遺傳因素致使免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，某些免疫成分和功能缺陷；后天某些微生物感染、應(yīng)激、腫瘤等因素抑制了免疫功能。這些因素均能削弱宿主的防御機能，有利于細(xì)菌L型在體內(nèi)的形成和長期存活，造成慢性或遷延性感染。
影響細(xì)胞壁合成的抗生素 細(xì)菌L型因失去細(xì)胞壁，對作用于細(xì)胞壁生物合成的β-內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素和頭孢菌素)和萬古霉素一般均表現(xiàn)為耐藥。但是，細(xì)菌L型對青霉素的耐藥性也不是絕對的，有時可見臨床分離的L型對青霉素敏感，這可能因為這些細(xì)菌L型仍有部分細(xì)胞壁殘留，但也有人認(rèn)為青霉素能抑制細(xì)胞內(nèi)核糖核酸的形成，造成暫時性的營養(yǎng)缺陷。從許多病例分離出的細(xì)菌L型對作用于細(xì)胞壁的頭孢菌素仍敏感，原因是頭孢菌素除影響細(xì)胞壁的合成外，對細(xì)胞膜也有一定作用。也有人認(rèn)為頭孢菌素對L型產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶比較穩(wěn)定，不易遭受破壞。所以，臨床上選擇用藥還應(yīng)依據(jù)所分離的L型的藥敏試驗結(jié)果。
作用于細(xì)胞壁外的抗生素 敏感性取決于細(xì)胞膜對藥物的通透性是否改變。一般地，對作用于細(xì)胞膜的抗生素（如多粘菌素)，作用于核酸的抗生素(如利福平等)，以及抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素(如氯霉素、林可霉素、氨基糖苷類等)的敏感性不變反而上升，上升的原因可能是L型缺少細(xì)胞壁的屏障作用，抗菌藥物更易進入菌體內(nèi)。
比較特別的是，對氨基糖苷類中的各種抗生素的作用很不一致。對同屬氨基糖苷類的各種抗生素，L型對慶大霉素與卡那霉素的敏感性一般與原菌相同，但對鏈霉素的敏感性則不一定相同，敏感醫(yī)學(xué)全.在線m.gydjdsj.org.cn性升高或降低。大腸埃希菌對鏈霉素耐藥，經(jīng)青霉素誘導(dǎo)成L型后對鏈霉素的耐藥性消失。金黃色葡萄球菌L型與傷寒沙門菌L型對鏈霉素與慶大霉素的敏感性與原菌相比均有所下降，鼠傷寒沙門菌細(xì)菌型對鏈霉素耐藥，變?yōu)長型后耐藥性無明顯改變。因此，應(yīng)直接根據(jù)所分離的細(xì)菌及其L型藥敏結(jié)果決定用藥。
細(xì)菌耐藥基因存在于染色體或染色體外的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上。由于細(xì)胞壁缺損而使染色體外的游離的R質(zhì)粒容易丟失，從而提高對抗生素的敏感性。研究表明，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性在不穩(wěn)定L型和返祖菌中并無很大的改變，而穩(wěn)定L型則喪失了由質(zhì)粒DNA所表達(dá)的耐藥特性。
金黃色葡萄球菌BM3202株有染色體耐藥基因（如對利福平耐藥)和耐藥質(zhì)拉PlP524（耐妥布霉素等)，其穩(wěn)定L型對妥布霉素的耐藥性消失，而對利福平的耐藥性在各菌型（原菌、返祖菌、穩(wěn)定L型)中均無變化，表明該菌變成L型后，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性丟失而染色體介導(dǎo)的耐藥性不變。因此，臨床醫(yī)生對疑有L型感染病人的治療要嚴(yán)加重視。
細(xì)菌L型雖然可在體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生，但在不少病例中L型是在用藥治療過程中分離到的，這可能與使用影響細(xì)胞壁合成的抗生素有關(guān)。據(jù)報道，以A族溶血性鏈球菌活菌懸液靜脈注射小鼠，3d后給小鼠肌注芐星青霉素，24h后細(xì)菌型從各臟器內(nèi)消失，而L型開始出現(xiàn)，提示臨床應(yīng)用抗生素治療細(xì)菌感染性疾病，雖能使癥狀好轉(zhuǎn)，但不一定能殺死全部病原菌，其中一部分可轉(zhuǎn)變?yōu)長型，隱伏于宿主的某一部位。當(dāng)停用抗生素后，一旦條件合適，L型又可回復(fù)成原菌，造成疾病的反復(fù)發(fā)作或遷延不愈。另外，臨床病例中L型的出現(xiàn)及其對抗生素敏感性與返祖菌的差異，說明用藥類型的不合理、用藥劑量的不足可能是造成L型產(chǎn)生的原因之一。
臨床病例中分離的細(xì)菌型或L型往往不是單獨出現(xiàn)，而是同時出現(xiàn)，細(xì)菌L型的藥敏與原菌也不完全相同，不同代數(shù)的L型對抗生素的敏感性不同，因此，對于一些反復(fù)發(fā)作并有L型出現(xiàn)的疾病，在治療選用抗生素時，不僅要考慮到細(xì)菌型的藥敏，也應(yīng)考慮到L型的藥敏，可根據(jù)藥敏報告及時調(diào)整抗生素的種類，或采取聯(lián)合用藥方案，能明顯提高療效。臨床實踐表明，除結(jié)合藥敏結(jié)果選用一些抑制蛋白質(zhì)合成藥物外，只要臨床治療有效應(yīng)該繼續(xù)使用作用于細(xì)胞壁的抗生素，不必更換。聯(lián)合應(yīng)用作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞壁外的抗生素以達(dá)到徹底消滅病原，可避免病程的遷延和變?yōu)槁浴?/p>
臨床上常遇到有明顯感染跡象而常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)陰性的病例，漏診的原因很多，在細(xì)菌方面除厭氧菌外，國內(nèi)外大量資料證明與L型關(guān)系甚大。宿主體內(nèi)存在多種因素，特別是抗生素的應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌處于不同程度的缺壁狀態(tài)，使常規(guī)培養(yǎng)失敗。對住院患者各類標(biāo)本進行常規(guī)與高滲同步培養(yǎng)，結(jié)果有相當(dāng)?shù)牟±蛛x出L型菌株，而普通培養(yǎng)均為陰性。據(jù)臨床檢驗報道，含血、骨髓、膿汁、痰、穿刺液、膽汁等進行常規(guī)與高滲同步培養(yǎng)，結(jié)果常規(guī)培養(yǎng)陽性率明顯低于L型培養(yǎng)的陽性率，增加L型培養(yǎng)可提高陽性率2～3倍。
細(xì)菌L型的鑒定 主要依靠以下5個方面：①形態(tài)與染色性：細(xì)胞壁染色或電鏡觀察顯示無細(xì)胞壁，形態(tài)呈多形性；②生長特征：在普通培養(yǎng)基中不生長，而在高滲培養(yǎng)基中生長，呈“油煎蛋”樣的菌落；③抵抗力：耐青霉素等作用于細(xì)胞壁的抗生素；④濾過性：能通過0.45μm孔徑的除菌濾膜；⑤返祖性：去除青霉素等抑制細(xì)胞壁的誘導(dǎo)因子后，不穩(wěn)定L型能返祖成原菌。凡符合以上特征之二以上者可鑒定為L型菌。待其返祖后，可按常規(guī)的細(xì)菌學(xué)方法將其鑒定到菌種的水平。
臨床L型檢查及藥敏試驗 正確地采集標(biāo)本及運送標(biāo)本是細(xì)菌學(xué)檢驗質(zhì)量的保證。原則上取材要新鮮，以無菌手續(xù)采取，置于無菌容器，立即送檢。對污染標(biāo)本如糞便、非導(dǎo)尿的尿液、陰道分泌物等，要通過0.45μm濾膜過濾，取濾液立即接種培養(yǎng)。對血、骨髓、穿刺液等標(biāo)本先接種至高滲或等滲肉湯增菌，有微微混濁、沉淀醫(yī)學(xué).全在線m.gydjdsj.org.cn生長或管壁顆粒生長時，再同時轉(zhuǎn)種至血平板和L型平板，并行涂片染色鏡檢；對于尿、膿液可直接接種至血平板和L型平板。經(jīng)涂片、革蘭染色與細(xì)胞壁染色，根據(jù)菌落、形態(tài)體征，是否缺壁，必要時通過濾器，經(jīng)回復(fù)后確定菌種。
檢驗結(jié)果可報告為：
（1)血平板不長，L型平板生長者，結(jié)合形態(tài)報告L型。
（2)血平板與L型平板同時生長，L型平板見有L型菌落或涂片見有明顯的多形性，有缺壁現(xiàn)象，可報告細(xì)菌型與L型同時存在。
（3)L型在血平板上有時也能生長，但菌落非常細(xì)小，呈針尖狀，肉眼不易看清，僅血平板表現(xiàn)光澤改變，似有霧狀物密布。涂片染色，形態(tài)呈明顯缺壁多形，不應(yīng)認(rèn)為是污染，若L型平板上同時長出典型L型菌落，仍應(yīng)報告為L型，并使其回復(fù)以作鑒定。若有可疑時，可通過0.45μm的濾膜過濾后，接種L型平板或經(jīng)電鏡檢查，證實是否為L型。
（4)血培養(yǎng)一般一周未見生長報告為陰性。
分離出細(xì)菌L型后，需要做藥敏試驗。從L型平板取大量L型接種至血平板時，L型可回復(fù)為原菌，此時藥敏結(jié)果不能真實反映L型藥敏。因此，應(yīng)同時在血平板與L型平板上作藥敏試驗。
穩(wěn)定L型的鑒定法 臨床分離的L型大多不穩(wěn)定，可在培養(yǎng)基上接種回復(fù)而進行鑒定。如穩(wěn)定L型不易回復(fù)或不能回復(fù)，可通過下述方法加以鑒定：
（1)免疫標(biāo)記技術(shù)：一般常用免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)，根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)來鑒定，并可直接從患者標(biāo)本或組織切片中鑒定有無L型抗原存在。
（2)分子生物學(xué)檢查法：細(xì)菌變?yōu)長型后雖然特性可以發(fā)生許多改變，甚至失去原有抗原性，對于一些穩(wěn)定L型的鑒定需要進一步從DNA或蛋白質(zhì)水平及代謝類型進行研究。主要方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法、G＋Cmol%測定與DNA-DNA雜交法。
（林 晨 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院)
