醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)一  油浸鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察 革蘭氏染色

Use of oil immersion objective and observation of morphoiogy structures lf bacteria

一、油浸鏡的使用方法

(一)油浸鏡的使用方法

1、雙手托顯微鏡，輕拿輕放。

2、放好后，用綢布擦試顯微鏡，同時(shí)檢查顯微鏡有無(wú)問(wèn)題，有問(wèn)題立即向老師報(bào)告。

3、用低倍鏡調(diào)整光線，看染色標(biāo)本時(shí)，要求視野達(dá)到最亮的程度。

①將集光器升到最高位置，與載物臺(tái)相平。

②將虹彩完全開(kāi)放。

③天然光線用平面反射鏡，人工光源用凹反射鏡。使視野達(dá)到最亮的程度。

4、在標(biāo)本上滴一滴香柏油，不要多加。用眼睛從側(cè)面觀察，小心轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使油浸鏡頭緩慢下降，浸入油中，到幾乎或輕輕與玻片接觸為止。不能過(guò)急過(guò)重，以免碰壞鏡片。

5、一面從目鏡觀察，一面用粗調(diào)節(jié)器慢慢上升油浸鏡頭，當(dāng)見(jiàn)到模糊的物象時(shí)，立即停止。再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)到物像清晰為止。然后，一邊移動(dòng)片子，一邊觀察，尋找理想的視野，仔細(xì)觀察。

6、看完后，先將油浸鏡頭上提，然后取下標(biāo)本片，再用擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油。必要時(shí)，用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，然后再用另一小塊擦鏡紙拭去二甲苯。

7、最后，降下集光器，豎起反射鏡，下降鏡筒使物鏡成八字形抵于載物臺(tái)綢布上，雙手托持顯微鏡，放入顯微鏡箱中。

(二)注意事項(xiàng)

1、不得在直射陽(yáng)光下操作顯微鏡，以免強(qiáng)光損壞鏡片。

2、顯微鏡的細(xì)調(diào)節(jié)器是精密而脆弱的機(jī)件，只能做有限的旋轉(zhuǎn)，因此，不得向一個(gè)方向連續(xù)旋轉(zhuǎn)數(shù)周。當(dāng)旋轉(zhuǎn)時(shí)感到有阻力，則表明已達(dá)極限，不能再繼續(xù)向上方旋轉(zhuǎn)，必須立即退回，輕拿輕放，防止細(xì)調(diào)節(jié)器因震動(dòng)而損壞。

3、顯微鏡必須保存于干燥、無(wú)塵的方，以防鏡片發(fā)霉損壞。

二、細(xì)菌的基本形態(tài)、特殊構(gòu)造的觀察

細(xì)菌的基本形態(tài)（球菌、桿菌、螺形菌)和細(xì)菌的特殊構(gòu)造（莢膜、鞭毛與芽胞等)都可以在染色之后，用油浸鏡觀察

(一)細(xì)菌的基本形態(tài)觀察

注意觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列和染色性。

1、球菌和桿菌（葡萄球菌和大腸桿菌)

革蘭氏染色標(biāo)本，葡萄球菌染成紫色，大腸桿菌染成紅色。

2、弧菌（霍亂弧菌)

革蘭氏染色標(biāo)本，霍亂弧菌染成紅色。

(二)細(xì)菌的特殊構(gòu)造觀察

1、莢膜（肺炎球菌)

Hiss氏莢膜染色法，菌體染成紫色，莢膜染成淡紫色或無(wú)色。

2、鞭毛（變形桿菌)

戶田氏鞭毛染色法，菌體和鞭毛均染成紅色。

3、芽胞（破傷風(fēng)桿菌)

Moeller氏芽胞染色法，菌體染成蘭色，芽胞染成紅色。

三、革蘭氏染色法

革蘭氏染色法是最常用的細(xì)菌鑒別染色法。要求同學(xué)必須掌握此項(xiàng)基本技術(shù)操作，并理解革蘭氏染色法在鑒別細(xì)菌上的重要意義。

1884年由Gram氏建立，因之得名。關(guān)于其原理還不完全清楚，曾有幾種不同的解釋：

1、革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層很厚，脂類含量低，酒精不易透入。陰性菌的細(xì)胞壁較為疏松，肽聚糖很薄、外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫一碘復(fù)合物被酒精溶解提出而致脫色。

2、革蘭氏陽(yáng)性菌含有多量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫和碘結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易脫出。而陰性菌中此物質(zhì)含量甚少，故易于脫色。

3、革蘭氏陽(yáng)性菌等電點(diǎn)（pH2-3)比革蘭氏陰性菌（pH4-5)為低，在同樣pH的染色環(huán)境中，陽(yáng)性菌所帶的陰電荷比陰性菌多，故與帶陽(yáng)電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較為牢固，不易脫色。目前認(rèn)為，在以上各因素中，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的差異是最重要的因素。

材料：

葡萄球菌與大腸桿菌的混合菌液。

革蘭氏染色液，載物玻片等。

方法：

1、涂片：先將接種環(huán)（白金耳)用火焰滅菌，用滅菌的接種環(huán)取菌液一滴，在載物玻片上涂一個(gè)薄而均勻的涂膜，直徑約為1厘米。如用純培養(yǎng)菌做涂片時(shí)，應(yīng)先取一滴生理鹽水放于載物玻片上，再取少量純菌，混于鹽水中，然后再涂片。

2、干燥：放空氣中自然干燥，或于火焰上部略加烘烤，使液體干燥。

3、固定：將玻片從火焰中央部，反復(fù)通過(guò)三次。使涂片中細(xì)菌，固著于載物玻片上，并殺死大部分細(xì)菌。

4、取結(jié)晶紫液滴于涂膜上，染1分鐘，水洗。

5、用蘆戈碘媒染1分鐘，水洗。

6、用0.4％石碳酸復(fù)紅液脫色復(fù)染半分鐘，水洗。

7、印干后，用油鏡觀察。

實(shí)驗(yàn)二  常用培養(yǎng)基簡(jiǎn)介 細(xì)菌接種及分布  消毒與滅菌

培養(yǎng)基（culture medium)是由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基一般pH為7.2～7.6，少數(shù)的細(xì)菌按生長(zhǎng)要求調(diào)整pH偏酸或偏堿。

培養(yǎng)基按其營(yíng)養(yǎng)組成和用途不同，分為以下幾類：
　　按照來(lái)源來(lái)分類，可分為天然培養(yǎng)基、人工合成培養(yǎng)基和混合培養(yǎng)基。

天然培養(yǎng)基  通常是酵母菌、牛肉、魚(yú)等的提取物或它們所含蛋白質(zhì)的水解物。營(yíng)養(yǎng)成分全，造價(jià)低，所含成分不完全清楚。

牛肉浸汁培養(yǎng)基屬于此類。將除去肌腱和脂肪的新鮮牛肉500克切成小塊后攪碎，加入1000ml水，4℃冰箱過(guò)夜使?fàn)I養(yǎng)成分完全浸出，浸出液煮沸半小時(shí)去脂肪，過(guò)濾得清液，補(bǔ)足1000ml即為牛肉浸汁。

人工合成培養(yǎng)基  指各種成分都清楚的化學(xué)合成培養(yǎng)基。可用于研究微生物的營(yíng)養(yǎng)需求、物質(zhì)代謝。

混合培養(yǎng)基  就是天然和人工合成的成分都有。

根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)的不同分為液體、固體和半固體三大類。

液體培養(yǎng)基  一般混合振蕩培養(yǎng)，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分利用和菌體內(nèi)代謝廢物的排出。液體培養(yǎng)基可用于大量繁殖細(xì)菌，但必須種入純種細(xì)菌，不能作分離。

固體培養(yǎng)基  液體培養(yǎng)基中加入1.5～2%的瓊脂粉，即凝固成固體培養(yǎng)基。瓊脂在培養(yǎng)基中起賦形劑作用，不具營(yíng)養(yǎng)意義，可以反復(fù)凝融，便于使用。常用的兩種形式斜面和平板。斜面常用來(lái)菌種短期保藏和活化，平板可通過(guò)劃線分離到單個(gè)菌落，得到純培養(yǎng)，也可用作活菌計(jì)數(shù)。

半固體培養(yǎng)基  瓊脂粉含量在0.3%～0.5%時(shí)，則為半固體培養(yǎng)基。用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力和短期保存細(xì)菌。

按照營(yíng)養(yǎng)組成和用途分類：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基  基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分。它是配制特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，也可作為一般培養(yǎng)基用。如營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、蛋白胨水等。
　　營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基　若了解某種細(xì)菌的特殊營(yíng)養(yǎng)要求，可配制出適合這種細(xì)菌而不適合其他細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基�；�礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加合適的生長(zhǎng)因子或微量元素等，以促使某些特殊細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，例如鏈球菌、肺炎鏈球菌需在含血液或血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

選擇培養(yǎng)基　　在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，使之抑制某些細(xì)菌生長(zhǎng)，而有利于另一些細(xì)菌生長(zhǎng)，從而將后者從混雜的標(biāo)本中分離出來(lái)，這種培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基（selective medium)。例如培養(yǎng)腸道致病菌的SS瓊脂，其中的膽鹽能抑制革蘭陽(yáng)性菌，枸櫞酸鈉和煌綠能抑制大腸埃希菌，因而使致病的沙門(mén)菌和志賀菌容易分離到。若在培養(yǎng)基中加入抗生素，也可起到選擇作用。實(shí)際上有些選擇培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基之間的界限并不十分嚴(yán)格。
　　鑒別培養(yǎng)基　　用于培養(yǎng)和區(qū)分不同細(xì)菌種類的培養(yǎng)基稱為鑒別培養(yǎng)基（differential medium)。利用各種細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，一般不加抑菌劑，觀察細(xì)菌在其中生長(zhǎng)后對(duì)底物的作用如何，從而鑒別細(xì)菌。如常用的糖發(fā)酵管、雙糖鐵培養(yǎng)基、伊紅-美藍(lán)瓊脂等。
　　厭氧培養(yǎng)基　　專供厭氧菌的分離、培養(yǎng)和鑒別用的培養(yǎng)基，稱為厭氧培養(yǎng)基（anaerobic medium)。這種培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有特殊生長(zhǎng)因子，氧化還原電勢(shì)低，并加入美藍(lán)作為氧化還原指示劑。其中心、腦浸液和肝塊、肉渣含有不飽和脂肪酸，能吸收培養(yǎng)基中的氧；硫乙醇酸鹽和半胱氨酸是較強(qiáng)的還原劑；維生素K1、氯化血紅素可以促進(jìn)某些類桿菌的生長(zhǎng)。常用的有庖肉培養(yǎng)基（cooked meat medium )、硫乙醇酸鹽肉湯等，并在液體培養(yǎng)基表面加入凡士林或液體石蠟以隔絕空氣。
　　細(xì)菌接種法

細(xì)菌的接種方法因各種培養(yǎng)基不同而異，常用的方法有平板、斜面、液體和半固體接種。

【材料】

1．瓊脂斜面、瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基。

2．枯草桿菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物。

【方法】

（一)平板接種法

臨床上各種檢驗(yàn)標(biāo)本，如糞便、痰、膿液中�；煊卸喾N細(xì)菌。如欲檢查病人標(biāo)本中是否有某種病原菌時(shí)，須先將各種細(xì)菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達(dá)到分離的目的醫(yī)學(xué)考研網(wǎng)，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種法有多種，以下介紹平行劃線法(又稱連續(xù)劃線接種)及分區(qū)劃線法。

1．分區(qū)劃線法：如接種物中細(xì)菌極多時(shí)(如固體菌種、糞便等)則必須采用分區(qū)劃線法才能得到好結(jié)果(圖3-2)。

(1) 燒灼接種環(huán)，冷卻后，取1環(huán)接種菌液。

(2) 打開(kāi)平板蓋，左手斜持平板(約45°角)，并靠近火焰，以免空氣中雜菌落入平板內(nèi)，右手握持已沾菌液的接種環(huán)在瓊脂平板一端連續(xù)平行劃線(約占平板面積的1/3)，為第1組線。劃線時(shí)，接種環(huán)與平板成30～40°，輕輕接觸平板，以腕力平行滑移接種環(huán)，注意避免將環(huán)嵌人瓊脂將其劃破。

(3) 轉(zhuǎn)動(dòng)平板約70°，接種環(huán)燒灼滅菌冷卻后，從原接種處通過(guò)2～3條線，劃于另一個(gè)1/4的面積為第2組線。劃畢，接種環(huán)又燒灼滅菌，冷卻后同法劃出第3、4組線。

(4) 接種完畢，蓋上皿蓋，于皿底做好標(biāo)記，將平板倒置(平板底面朝上)，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

2．平行劃線法：一般當(dāng)接種物中細(xì)菌不太多時(shí)(如膿汁標(biāo)本、液體培養(yǎng)物等)可以選用平行劃線法(圖3-3)。

圖3-2 分區(qū)劃線法（左)及菌落分布示意圖（右)

圖3-3 平板連續(xù)劃線法（左)及菌落分布示意圖（右)

【結(jié)果】

瓊脂平板表面散在分布兩種菌落，為圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊，其中有金黃色色素的為金黃色葡萄球菌的菌落；另一種為大腸桿菌菌落。

（二)瓊脂斜面接種法

多用于純種細(xì)菌的增菌和保存菌種。

1．用滅菌接種針取細(xì)菌培養(yǎng)物少許。

2．拔出培養(yǎng)管棉塞，管口經(jīng)火焰滅菌，將沾有細(xì)菌的接種針從培養(yǎng)基中央刺入，沿原穿刺線拔出。

3．再將接種針自下而上在瓊脂上平行劃線(圖3-4)。

4．接種后，管口在火焰上滅菌，塞回棉塞，接種環(huán)滅菌。

5．在試管壁近管口處做好標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。 

（三)肉湯接種法執(zhí)業(yè)獸醫(yī)

用于增菌。

1．滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許。

2．以無(wú)菌操作將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入肉湯管中，將環(huán)上細(xì)菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細(xì)菌，將細(xì)菌帶入培養(yǎng)基中(圖3-5)。

3．接種后管口滅菌，塞回棉塞，接種環(huán)滅菌，并做好標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

（四)半固體接種法(穿刺接種法)

用于觀察細(xì)菌有無(wú)動(dòng)力。

半固體接種是用接種針，無(wú)菌操作方法同前。將取有細(xì)菌的接種針從培養(yǎng)基的中央刺入，沿原穿刺線拔出，注意在刺入與拔出時(shí)不可晃動(dòng)接種針(圖3-6)。

強(qiáng)調(diào)：無(wú)菌操作。戴帽子、口罩，防止人吸入和污染培養(yǎng)基。

全班1個(gè)空氣微生物分布平板

每組1個(gè)血平板做咽拭子分布

1個(gè)普通平板一半接枯草，一半接大腸，紫外線照射30min比較殺菌效果

1個(gè)普通平板分區(qū)，棉拭子沾生理鹽水環(huán)境取樣涂抹（洗手前后必做)

6支肉湯試管，3支接大腸，3支接枯草，分為三組。一組直接培養(yǎng)，一組高壓滅菌，一組煮沸10分鐘，標(biāo)記好交上。

實(shí)驗(yàn)三 結(jié)果觀察、膿檢（1)、突變、儀器

結(jié)果觀察

細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況
　　在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況 大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖后呈現(xiàn)均勻混濁狀態(tài)；少數(shù)鏈狀的細(xì)菌則呈沉淀生長(zhǎng)；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌等專性需氧菌呈表面生長(zhǎng)，常形成菌膜。
　　在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況 將標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種在固體培養(yǎng)基的表面，因劃線的分散作用，使許多原混雜的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面上散開(kāi)，稱為分離培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)18～24 h培養(yǎng)后，單個(gè)細(xì)菌分裂繁殖成一堆肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落。挑取一個(gè)菌落，移種到另一培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)菌均為純種，稱為純培養(yǎng)。這是從臨床標(biāo)本中檢查鑒定細(xì)菌很重要的第一步。各種細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上形成的菌落，在大小、形狀、顏色、氣味、透明度、表面光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥、邊緣整齊與否，以及在血瓊脂平板上的溶血情況等均有不同表現(xiàn)，這些有助于識(shí)別和鑒定細(xì)菌。

瓊脂平板上，可計(jì)數(shù)菌落，推算標(biāo)本中的活菌數(shù)。這種菌落計(jì)數(shù)法常用于檢測(cè)自來(lái)水、飲料、污水和臨床標(biāo)本的活菌含量。

膿汁標(biāo)本的分離

化膿性標(biāo)本的檢驗(yàn)是一個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)。很多細(xì)菌感染都可以引起化膿，膿拭子分離培養(yǎng)、鑒定，到藥物敏感試驗(yàn)，是一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)。今天先做：

1.  取標(biāo)本。無(wú)菌操作，取引起病灶的目的菌，而不是污染菌。觀察病灶，膿稀薄還是粘稠，又沒(méi)有新鮮血液混入，顏色、氣味如何，作為第一手資料。

2.  做涂片，革蘭染色。染色結(jié)果與病灶性狀相結(jié)合，判斷出菌的大致范圍，分離培養(yǎng)選擇合適的培養(yǎng)基和方法。

3.  膿拭子在血平板上進(jìn)行劃線分離。

突變

Ames試驗(yàn)利用細(xì)菌突變的原理，使用一組突變菌株，通過(guò)檢測(cè)突變株回復(fù)突變率的高低檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)是否具有致突變性，致突變性與致癌性高度相關(guān)。菌株：鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型，不添加外援組氨酸則不可生長(zhǎng)。待檢化學(xué)物質(zhì)溶液浸泡濾紙片，貼到含有微量組氨酸的培養(yǎng)基上，紙片周圍形成組氨酸的濃度梯度。組氨酸濃度限量，只可支持菌的幾次分裂，無(wú)法形成肉眼可見(jiàn)菌落，只有發(fā)生組氨酸回復(fù)突變的菌才可在平板上形成菌落�；瘜W(xué)物質(zhì)若能引起突變，則有可能使缺陷型回復(fù)，紙片周圍會(huì)出現(xiàn)比其他位置密集的肉眼可見(jiàn)的單菌落。根據(jù)菌落多少進(jìn)行致突變性篩選。此法檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)多，所用時(shí)間少，是世界通用的致癌物檢測(cè)的第一梯隊(duì)實(shí)驗(yàn)。

滅菌儀器

熱力滅菌法分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類，在同一溫度下，后者的效力比前者大。這是因?yàn)椋孩贊駸嶂屑?xì)菌菌體蛋白較易凝固；②濕熱的穿透力比干熱大；③濕熱的蒸氣有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)放出的潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。
1. 干熱滅菌法 干熱的殺菌作用是通過(guò)脫水干燥和大分子變性。一般細(xì)菌繁殖體在干燥狀態(tài)下， 80～100℃經(jīng)h可被殺死；芽胞則需160～170℃經(jīng)2h才死亡。
　a. 焚燒　直接點(diǎn)燃或在焚燒爐內(nèi)焚燒。是一種徹底的滅菌方法，但僅適用于廢棄物品或動(dòng)物尸體等。
　b. 燒灼　直接用火焰滅菌，適用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的接種環(huán)、試管口等的滅菌。
　c. 干烤　利用干烤箱滅菌，一般加熱至160～170℃經(jīng)2 h。適用于高溫下不變質(zhì)、不損壞、不蒸發(fā)的物品，例如玻璃器皿、瓷器、玻質(zhì)注射器等的滅菌。
2. 高壓蒸氣滅菌法（濕熱)　是一種最有效的滅菌方法。滅菌的溫度取決于蒸氣的壓力。在一個(gè)大氣壓下，蒸氣的溫度是100℃。如果蒸氣被限制在密閉的容器中，隨著壓力升高，蒸氣的溫度也相應(yīng)升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸氣壓下，溫度達(dá)到121.3℃，維持15～20min，可殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。高壓蒸汽滅菌器（autoclave)就是根據(jù)這一原理制成的，常用于一般培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)敷料等耐高溫、耐濕物品的滅菌。

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實(shí)驗(yàn)四 膿檢（2)、菌落、血漿凝固酶、藥敏試驗(yàn)

上次的實(shí)驗(yàn)我們做了革蘭染色和平板接種劃線分離。菌落是細(xì)菌分類的鑒定指標(biāo)，不同菌有不同特點(diǎn)，上次已經(jīng)講過(guò)，這次仍然要用這些指標(biāo)分析你分離到的單菌落。大小（大菌落、小菌落、中等菌落)、形狀（圓形、不規(guī)則形)、顏色、氣味、透明度（不透明、半透明、透明)、表面光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥、凹凸情況、邊緣整齊與否，有沒(méi)有色素產(chǎn)生（脂溶性、水溶性)、以及在血瓊脂平板上的溶血情況（α－環(huán)、β－環(huán)、γ－環(huán))。

在血瓊脂平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖后，溶血現(xiàn)象分為3類：
①　α－環(huán)：菌落周圍有1~2mm寬的草綠色溶血環(huán)，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解�！　、� β－環(huán)：：菌落周圍形成一個(gè)2~4mm寬、界限分明、完全透明的無(wú)色溶血環(huán)。溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解。

③ γ－環(huán)：菌落周圍無(wú)溶血環(huán)。

引起化膿性感染的球菌，都是G^＋球菌，主要有5種。

a.  葡萄球菌  形成圓形、隆起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、不透明的菌落。直徑在2mm左右。致病性葡萄球菌常產(chǎn)金黃色脂溶性色素和形成β－溶血環(huán)。

b.  鏈球菌  形成圓形、灰白色、表面光滑、邊緣整齊、直徑0.5~0.75mm的細(xì)小菌落。甲鏈，致病力弱，α－溶血環(huán)；乙鏈，致病力強(qiáng)，β－溶血環(huán)；丙鏈，一般無(wú)致病性，γ－溶血環(huán)。

c.  肺炎球菌  形成細(xì)小、灰白色、圓形略扁、半透明，有草綠色α－溶血環(huán)。與甲型溶血性鏈球菌很相似。

根據(jù)菌落形態(tài)和兩次革蘭染色結(jié)果可以初步確定為何菌。

致病性葡萄球菌的鑒定主要根據(jù)產(chǎn)生凝固酶和耐熱核酸酶試驗(yàn)。陽(yáng)性具有致病性。最常用血漿凝固酶試驗(yàn)。

凝固酶是能使人或兔血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)。致病株大多數(shù)能產(chǎn)生，故凝固酶是鑒別葡萄球菌有無(wú)致病性的重要指標(biāo)。
a. 試管法：測(cè)定游離凝固酶，被人或兔血漿中的協(xié)同因子激活為凝血酶樣物質(zhì)后，使液態(tài)的纖維蛋白原變成固態(tài)的纖維蛋白，從而血漿凝固。兔血漿1：4稀釋，加入葡萄球菌，1～4小時(shí)后，是否凝固判斷陽(yáng)性，陰性。準(zhǔn)確，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

b. 玻片法：測(cè)定結(jié)合凝固酶。實(shí)質(zhì)是在該菌株的表面有纖維蛋白原受體，當(dāng)菌混懸于人或兔血漿時(shí)，纖維蛋白原與菌受體交聯(lián)而使細(xì)菌凝聚。玻片兩端各滴一滴生理鹽水，用接種環(huán)取分離到的葡萄球菌在兩側(cè)的生理鹽水中研磨成混懸液。試驗(yàn)側(cè)加一滴1：4兔血漿，對(duì)照側(cè)加一滴生理鹽水�；蝿�(dòng)玻片觀察現(xiàn)象，如果對(duì)照組不凝而試驗(yàn)組出現(xiàn)顆粒狀凝集則說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性；如果兩側(cè)都不凝為陰性；兩次都凝則結(jié)果無(wú)意義。

   甲鏈和肺炎球菌菌落外觀很像，需要用試驗(yàn)區(qū)分，以膽汁溶菌試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵和奧普托辛試驗(yàn)最為常用。必要時(shí)可作小鼠毒力試驗(yàn)加以鑒別。在上述試驗(yàn)中，肺炎鏈球菌均應(yīng)陽(yáng)性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。

a.  膽汁溶菌試驗(yàn)  肺炎球菌有自溶酶，膽汁激活作用下細(xì)菌崩解。加膽汁或10%去氧膽酸鈉至菌液，置室溫或37℃，在5~10min出現(xiàn)細(xì)菌溶解、培養(yǎng)液變清者為肺炎鏈球菌。甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗(yàn)為陰性。

b.  菊糖發(fā)酵試驗(yàn)  分別接種菊糖發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，肺炎球菌分解菊糖產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由紫色變黃色，甲鏈培養(yǎng)基不變色。

c.  Optochin敏感試驗(yàn)　方法似藥敏。將待試菌涂布于血瓊脂平板表面；取直徑6mm無(wú)菌濾紙圓片在1:2000 optochin溶液中浸濕，置于平板涂菌處。37℃ 48h后觀察抑菌圈大小，肺炎鏈球菌的抑制圈直徑常在20mm以上，甲型溶血性鏈球菌（約98%)小于12mm。

根據(jù)膿汁兩次革蘭染色結(jié)果和鑒定試驗(yàn)，一般可判定為何種菌致病，診斷后進(jìn)行治療。鏈球菌耐藥菌株少，鑒定后直接根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選藥物即可；葡萄球菌要做標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏試驗(yàn)，常用紙片法，選擇效價(jià)高又便宜的藥。

藥敏試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏紙片，紙片上藥物定量，不同藥含量不同，給出抑菌環(huán)直徑大小與藥物敏感性的參考值。標(biāo)準(zhǔn)M-H培養(yǎng)基定量每個(gè)平板，控制厚度，。液體過(guò)夜培養(yǎng)后菌濃調(diào)整到一定范圍，棉簽蘸取涂滿平板，不少于三個(gè)方向涂布涂滿涂均勻。貼上藥敏紙片，每?jī)蓚�(gè)藥敏紙片間隔20mm，距邊緣10mm。藥敏紙片周圍形成濃度梯度，由藥敏紙片向周圍濃度逐漸降低。藥物效果越好，抑菌環(huán)直徑越大；效果越差，抑菌環(huán)直徑越小。

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實(shí)驗(yàn)五 藥敏結(jié)果、腸菌特性、生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)

上次的平板經(jīng)過(guò)16~18溫育培養(yǎng)，大家把自己的藥敏結(jié)果找到，量量抑菌環(huán)直徑大小，與標(biāo)準(zhǔn)值比較，找出其敏感藥物。綜合三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫(xiě)出完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，從分離鑒定到生化反應(yīng)、藥敏試驗(yàn)，完整的系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

今天是腸道致病菌的檢查。

取標(biāo)本一般取糞便，有些病號(hào)取其他樣本，中段尿、血液、膿液、腦脊液等。傷寒初期要取血，尿液和糞便2周以后才可以檢出，也可取小皮疹。

取糞便直接分離培養(yǎng)，取血液、骨髓接種肉湯增菌。尿液離心后取渣再分離培養(yǎng)。標(biāo)本接種于腸道鑒別或選擇培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基、伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基或中國(guó)藍(lán)培養(yǎng)基)上，37℃孵育18-24小時(shí)。挑取無(wú)色半透明可疑菌落，進(jìn)行初步鑒定，接種雙糖培養(yǎng)基。

雙糖培養(yǎng)基  下層含葡萄糖的半固體，上層含乳糖的固體，加上酸性復(fù)紅做指示劑。先穿刺接種再表面劃線，觀察動(dòng)力，葡萄糖、乳糖利用能力，是否產(chǎn)氣。（顏色變紅則可以利用糖，上下層之間出現(xiàn)氣柱則發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣，下層有擴(kuò)散生長(zhǎng)則有動(dòng)力。)

單糖發(fā)酵管  液體培養(yǎng)基中只含有一種糖，溴甲酚紫作指示劑，大試管內(nèi)倒置小試管。接種后培養(yǎng)，可以利用糖的產(chǎn)酸，培養(yǎng)基顏色由紫色變黃色，若產(chǎn)氣小試管頂部推出一端氣柱。觀察產(chǎn)氣比雙糖培養(yǎng)基敏感的多。至少做五種糖：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇。

VP試驗(yàn)　　大腸埃希菌和產(chǎn)氣桿菌均能發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，兩者不能區(qū)別。但產(chǎn)氣桿菌能使丙酮酸脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙酰與含胍基化合物反應(yīng)生成紅色化合物，是為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。大腸埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP試驗(yàn)陰性，
　　甲基紅試驗(yàn)　　產(chǎn)氣桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者經(jīng)脫羧后生成中性的乙酰甲基甲醇，故培養(yǎng)液pH>5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，是為甲基紅試驗(yàn)陰性。大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，培養(yǎng)液pH ≤4.5，甲基紅指示劑呈紅色，則為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。
　　枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)　　當(dāng)某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣桿菌)利用銨鹽作為唯一氮源，并利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源時(shí)，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，并分解銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，是為該試驗(yàn)陽(yáng)性。大腸埃希菌不能利用枸櫞酸鹽為唯一碳源，故在該培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，是為枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性。
　　吲哚試驗(yàn)　　有些細(xì)菌如大腸埃希菌、變形桿菌、霍亂弧菌等能分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì))，經(jīng)與試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色，是為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。
　　尿素酶試驗(yàn)　　變形桿菌有尿素酶，能分解培養(yǎng)基中的尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基變堿，以酚紅為指示劑檢測(cè)為紅色，是為尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性。
　　細(xì)菌的生化反應(yīng)用于鑒別細(xì)菌，尤其對(duì)形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和培養(yǎng)特性相同或相似的細(xì)菌更為重要。吲哚（I)、甲基紅（M)、VP（V)、枸櫞酸鹽利用（C)四種試驗(yàn)常用于鑒定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗(yàn)。例如大腸埃希菌對(duì)這四種試驗(yàn)的結(jié)果是“――＋＋”，產(chǎn)氣桿菌則為“――＋＋”。

血清學(xué)試驗(yàn)  若初步鑒定為沙門(mén)氏菌，則可用沙門(mén)氏A-F群多價(jià)血清進(jìn)行凝集反應(yīng)確證。發(fā)生凝集，則是沙門(mén)氏菌。不發(fā)生凝集，60℃加熱30min后破壞掉Vi抗原再次做沙門(mén)氏A-F群多價(jià)血清凝集反應(yīng)，發(fā)生凝集是沙門(mén)氏菌；不發(fā)生凝集則是沙門(mén)氏菌A-F以外的菌；若凝集，則可以用特異性血清進(jìn)行分型。

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實(shí)驗(yàn)六 肥達(dá)反應(yīng)、炭疽、肉毒、白喉形態(tài)、菌落

肥達(dá)反應(yīng)是診斷傷寒、副傷寒的反應(yīng)。反應(yīng)要進(jìn)行一段時(shí)間才能看結(jié)果，所以我們先講怎么做，做上再接著講原理。

1.  取試管作標(biāo)記，每排7支，共4排。

2.  加生理鹽水0.5ml/管。

3.  加血清作系列稀釋，各排第一管加1:10的待檢血清0.5ml，倍比稀釋至第6管，第7管作對(duì)照。

4.  加抗原，每排加一種已知抗原菌液0.5ml/管，混勻，放50℃水浴1h，觀察結(jié)果。

5.  室溫過(guò)夜，觀察結(jié)果。

抗原菌液四排：TH（傷寒桿菌鞭毛型)、TO（傷寒桿菌菌體型)、AH（甲型副傷寒桿菌鞭毛型)、BH（乙型副傷寒桿菌鞭毛型)。

觀察結(jié)果，鞭毛抗原形成絮狀疏松沉淀，浮擱在管底，輕輕振動(dòng)就可以浮起，易散開(kāi)。菌體抗原結(jié)合時(shí)間長(zhǎng)，顆粒狀凝集緊貼管底，輕搖試管不易散開(kāi)。計(jì)算出現(xiàn)明顯凝集的試管的最高稀釋度即為效價(jià)，進(jìn)行結(jié)果分析。

肥達(dá)試驗(yàn)是用已知傷寒沙門(mén)菌菌體（O)抗原和鞭毛（H)抗原，以及引起副傷寒的甲型副傷寒、肖氏沙門(mén)菌希氏沙門(mén)菌H抗原的診斷菌液與受檢血清作試管或微孔板凝集試驗(yàn)，測(cè)定受檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)的試驗(yàn)。
　　肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果的解釋必須結(jié)合臨床表現(xiàn)、病程、病史，以及地區(qū)流行病學(xué)情況。
1. 正常值 人們因沙門(mén)菌隱性感染或預(yù)防接種，血清中可含有一定量的有關(guān)抗體，且其效價(jià)隨地區(qū)而有差異。一般是傷寒沙門(mén)菌O凝集效價(jià)≥1：80，H凝集效價(jià)≥1：160，引起副傷寒的沙門(mén)菌H凝集效價(jià)≥1：80時(shí)才有診斷價(jià)值。
2. 動(dòng)態(tài)觀察 有時(shí)單次效價(jià)增高不能定論，可在病程中逐周復(fù)查。若效價(jià)逐次遞增或恢復(fù)期效價(jià)比初次≥4倍者始有意義。
3. O與H抗體的診斷意義 患傷寒或副傷寒后，O與H在體內(nèi)的消長(zhǎng)情況不同。IgM類O抗體出現(xiàn)較早，持續(xù)約半年，消退后不易受非傷寒沙門(mén)菌等病原體的非特異刺激而重現(xiàn)。IgG類H抗體則出現(xiàn)較晚，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，消失后易受非特異性病原刺激而能短暫地重新出現(xiàn)。因此，O、H凝集效價(jià)均超過(guò)正常值，則腸熱癥的可能性大；如兩者均低，患病可能性��；若O不高H高，有可能是預(yù)防接種或非特異性回憶反應(yīng)；如O高H不高，則可能是感染早期或與傷寒沙門(mén)菌O抗原有交叉反應(yīng)的其他沙門(mén)菌（如腸炎沙門(mén)菌)感染。
4. 其他 有少數(shù)病例，在整個(gè)病程中，肥達(dá)試驗(yàn)始終在正常范圍內(nèi)。其原因可能由于早期使用抗生素治療，或患者免疫功能低下等所致。
　　炭疽芽孢桿菌  革蘭陽(yáng)性，兩端平截、粗大，鏈狀竹節(jié)樣排列，芽胞在有氧條件下形成，呈橢圓形，位于菌體中央，對(duì)鑒別有意義。菌落灰白色，粗糙，大，邊緣不整齊，在低倍鏡下觀察邊緣呈卷發(fā)狀。

肉毒梭菌  革蘭陽(yáng)性，粗短桿菌，次端生芽胞呈橢圓形,粗于菌體,位于次極端,使細(xì)胞呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀。

白喉棒狀桿菌  菌體細(xì)長(zhǎng)微彎，一端或兩端膨大呈棒狀。細(xì)菌常排列呈V、L等文字形。革蘭染色陽(yáng)性。用美藍(lán)短時(shí)間染色菌體著色不均勻，出現(xiàn)有深染的顆粒，稱為異染顆粒。顆粒的主要成分是核糖核酸和多磷酸鹽，在鑒定時(shí)有重要意義。

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實(shí)驗(yàn)七 分枝菌培養(yǎng)抗酸染色、雞胚接種其他微生物

齊－尼抗酸染色

制片和革蘭染色一樣，接種環(huán)沾卡介苗在玻片上劃直徑1cm左右的圓。

1.  制片：取牙垢→涂膜→自然干燥→火焰固定

2.  石炭酸復(fù)紅加熱蒸染5分，去濾紙片，水洗→3％鹽酸酒精脫色1～2分，水洗→美藍(lán)復(fù)染30秒～1分，水洗→吸干、鏡檢

注意：a. 加熱蒸染，涂片以后，蓋上濾紙片在涂膜部位，用夾子夾好，加上染液石炭酸復(fù)紅，酒精燈上加熱蒸染5分鐘。加熱過(guò)程中不要蒸干了，要補(bǔ)加染液，不要太燙時(shí)加，玻片會(huì)裂。控制好距離酒精燈火焰高度，及時(shí)添加染液。

  b. 脫色時(shí)間根據(jù)片子厚薄而定，看著沒(méi)有濃重紅色冒出即可。

結(jié)果：結(jié)核、麻風(fēng)桿菌類抗酸菌可以抵抗3％鹽酸酒精脫色，不能脫去紅色，美藍(lán)復(fù)染后仍為紅色，稱抗酸染色陽(yáng)性。其他菌和物質(zhì)脫色時(shí)脫成無(wú)色再用美藍(lán)復(fù)染成藍(lán)色，抗酸染色陰性。

懷疑是肺結(jié)核的可以直接做痰涂片�？顾崛旧�的痰涂片上，粘液成分和其他菌蛋白是藍(lán)色，只有結(jié)核桿菌是紅色。若看到藍(lán)色背景上的紅色細(xì)長(zhǎng)桿菌，則多是結(jié)核桿菌。為了提高陽(yáng)性檢出率，可以先用3%鹽酸、6%硫酸或4%NaOH 處理15min，降解粘性成分。

培養(yǎng)要把培養(yǎng)基pH調(diào)低，最適pH6.5-6.8，培養(yǎng)基要求營(yíng)養(yǎng)豐富，一般常用羅氏培養(yǎng)基，含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無(wú)機(jī)鹽和孔雀綠等。用大粗試管玻璃紙包扎緊了進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)緩慢，18小時(shí)分裂一次，2-4周可長(zhǎng)出干燥顆粒狀菌落，呈菜花狀或饅頭渣狀，表面粗糙，邊緣不整齊，不透明。

雞胚接種

病毒分離早期的常用方法，我國(guó)湯飛凡最早用雞胚接種衣原體。

雞受精卵經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后會(huì)形成雞胚。羊膜腔、卵黃囊、尿囊、絨毛尿囊膜都可以接種，不同病毒選用部位不同。

本次試驗(yàn)選用新城疫雞瘟病毒，進(jìn)行尿囊接種。檢卵器檢卵，標(biāo)出氣室（透光度強(qiáng)亮度大的部位)，雞胚（最暗的部位)。雞胚放蛋托上，碘酒在氣室消毒，酒精脫碘，錐子燒灼后在氣室中間或邊緣打孔，無(wú)菌注射器取病毒液0.1～0.2ml，垂直進(jìn)針，穿過(guò)氣室后注入。蠟油封上孔。下次用這次結(jié)果，注意無(wú)菌操作。

病毒培養(yǎng)常用三種方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng) 目前最常用的方法是細(xì)胞培養(yǎng)，選擇適當(dāng)?shù)脑�代培養(yǎng)細(xì)胞(敏感性高)及傳代細(xì)胞系(便于在實(shí)驗(yàn)室保存)作病毒分離培養(yǎng)。接種標(biāo)本后，細(xì)胞可出現(xiàn)病變或也可并不出現(xiàn)病變而需用血細(xì)胞吸附等方法檢測(cè)是否有病毒增殖，并進(jìn)一步還需用特殊的抗體鑒定病毒的種類。

2. 雞胚接種 在流感病毒的分離培養(yǎng)中，最敏感而特異的方法是雞胚接種，并用血凝和血凝抑制試驗(yàn)以鑒定病毒。此外，細(xì)胞培養(yǎng)也可應(yīng)用。分離流感病毒在發(fā)現(xiàn)新變異株中具有重要價(jià)值。

3.  動(dòng)物試驗(yàn) 接種動(dòng)物分離病毒的方法目前已很少應(yīng)用，但對(duì)狂犬病病毒及乙型腦炎病毒的分離與鑒定中還需應(yīng)用動(dòng)物接種，并結(jié)合用特異抗體作中和試驗(yàn)或作免疫熒光染色以鑒定病毒種類。

觀察標(biāo)本

   白色念珠菌  真菌，大、紫色、球菌

   鉤端螺旋體  銀染，黃色背景下深棕黑色細(xì)線狀，一端或兩端有鉤

   結(jié)核桿菌痰涂片  紅色細(xì)長(zhǎng)桿菌

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※<實(shí)驗(yàn)八>

實(shí)驗(yàn)八 雞胚收剖、血凝、鼠腦接種、真菌培養(yǎng)

雞胚收剖

上次做了雞胚接種，這次做雞胚收剖。把雞胚放蛋托上，先消毒蛋殼氣室處，用剪子或鑷子敲開(kāi)個(gè)口，剪掉氣室，揭去第一層卵膜，剪開(kāi)絨毛尿囊膜，用吸管收集尿囊液。

血凝試驗(yàn)

某些病毒具有血凝素，可以使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞凝集，可以通過(guò)血凝試驗(yàn)確定有無(wú)具有血凝素的病毒存在，其效價(jià)高低。

1.  血凝板上第1個(gè)孔加0.4ml生理鹽水，其余9孔加0.25ml生理鹽水。

2.  收剖雞胚取尿囊液0.1ml加入第1孔，倍比稀釋至第9孔，第10孔作對(duì)照。

3.  加1％新鮮雞血球液，每孔0.25ml，混勻后，室溫靜置1h觀察結(jié)果。

結(jié)果判定  第10孔對(duì)照血球自然沉降到孔底，成光滑圓點(diǎn)狀，整個(gè)系統(tǒng)可用。以對(duì)照孔依次向前看，根據(jù)凝集現(xiàn)象記錄結(jié)果。血凝效價(jià)以最先出現(xiàn)的＋＋為準(zhǔn)。計(jì)算效價(jià)出現(xiàn)的稀釋度。

血凝試驗(yàn)只能檢查是否有具有血凝素的病毒存在，要確定是哪一種病毒，還要做血凝抑制試驗(yàn)。

血凝抑制試驗(yàn)

樣本液先加入特異性抗體作用一段時(shí)間，如果是相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合則封閉住血凝素位點(diǎn)，加入血球有血凝抑制現(xiàn)象。對(duì)照組設(shè)三組：病毒對(duì)照，抗體對(duì)照，緩沖液對(duì)照。三個(gè)對(duì)照組均正常結(jié)果才有意義。

鼠腦接種

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種途徑很多，腦、腹腔、皮膚、皮下均可。本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)鼠腦接種。

抓老鼠，消毒眼耳連線中點(diǎn)，注射器取病毒液（染液代替)向其扎入，有鏤空感時(shí)即進(jìn)入顱骨，注射即可。

注入接種完就拉頸處死，進(jìn)行鼠腦收剖。

枕后部皮膚橫剪開(kāi)，再縱剪，腦袋皮膚剝開(kāi)，剪開(kāi)顱骨，看看你的病毒液注射到哪個(gè)部位了，注射到的地方會(huì)被染藍(lán)。

真菌培養(yǎng)

真菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，菌落形態(tài)有兩種。

1.  酵母型菌落　是單細(xì)胞真菌的菌落形式，菌落光滑濕潤(rùn)，柔軟而致密。形態(tài)與一般細(xì)菌菌落相似，如隱球菌。有部分單細(xì)胞真菌在出芽繁殖后，芽管延長(zhǎng)不與母細(xì)胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長(zhǎng)，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為酵母樣菌落，如假絲酵母菌。

2.  絲狀菌落　是多細(xì)胞真菌的菌落形式，由許多疏松的菌絲體構(gòu)成。菌落成棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌落正背兩面呈現(xiàn)不同的顏色。絲狀菌落的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和顏色常作為鑒定真菌的參考。真菌有從中心向四周等距離生長(zhǎng)形成圓形菌落的傾向，所以臨床體癬、股癬、疊瓦癬等皮損表現(xiàn)為環(huán)形或多環(huán)形。

真菌培養(yǎng)常用大培養(yǎng)柯氏瓶點(diǎn)種接種。

若要區(qū)分酵母型和酵母樣菌落，可作小培養(yǎng)。載玻片上用蠟粘上鋼圈，加入一半培養(yǎng)基，，點(diǎn)種后蓋上無(wú)菌蓋玻片，培養(yǎng)后鏡檢觀察。

觀察。

大分生孢子  體積較大，由多個(gè)細(xì)胞組成，常呈梭狀、棍棒狀或梨狀，中間有分隔。其大小、細(xì)胞數(shù)和顏色是鑒定的重要依據(jù)。

小分生孢子  較小，1個(gè)孢子只有1個(gè)細(xì)胞，如小米粒狀。不是鑒定依據(jù)。