�。ǘ�)四種脫氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs)
在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會(huì)抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)核苷酸錯(cuò)誤摻入，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低，勢(shì)必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)誘導(dǎo)聚合酶的錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過(guò)早終止反應(yīng)。
決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長(zhǎng)度和組成，例如，在100μl反應(yīng)體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
購(gòu)自廠商的dNTP溶液一般均未調(diào)pH，應(yīng)用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調(diào)至7.0，以保證反應(yīng)的pH值不低于7.1。市購(gòu)的游離核苷酸凍干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度計(jì)定量。醫(yī)學(xué).全在線www.med126.com
�。ㄈ�)引物的量
引物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在0.1～1μmol/L之間。濃度過(guò)高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過(guò)低，不足以完成30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會(huì)降低PCR的產(chǎn)率。
�。ㄋ�)Taq DNA聚合酶的量
典型PCR反應(yīng)混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。
由于生產(chǎn)廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同，不同廠商供應(yīng)的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定義是：1個(gè)酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內(nèi)使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測(cè)定時(shí)間為10min，折算成30min摻入量。
分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3,25℃),50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl2,1mmol/L β-ME（巰基乙醇)，dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標(biāo)記及α-32P標(biāo)記混合)，12.μg變性鯡魚(yú)精子DNA，最終體積50μl。
（五)模板
單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來(lái)自單一細(xì)胞的DNA，但為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用ng級(jí)的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白。
DNA的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時(shí))，如用超聲處理或用切點(diǎn)罕見(jiàn)的限制酶（如Sal1和Not1)先行消化，則擴(kuò)增效果更好。閉環(huán)靶序列DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA，因此，用質(zhì)粒作反應(yīng)模板時(shí)最好先將其線狀化。
模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實(shí)驗(yàn)人員所控制，實(shí)驗(yàn)可按已知靶序列量逆減的方式（1ng,0.1ng,0.001ng等)，設(shè)置一組對(duì)照反應(yīng)，以檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求。
�。�)石蠟油
PCR擴(kuò)增時(shí)建議在混合物上面鋪一層石蠟油，減少PCR過(guò)程中尤其是變性時(shí)液體蒸發(fā)所造成的產(chǎn)物的丟失。研究表明，應(yīng)用石蠟油可使擴(kuò)增產(chǎn)量增加5倍，可能與石蠟油維持熱恒定和整個(gè)反應(yīng)體系中鹽濃度有關(guān)。
