自1969年以來，我們高興的看到原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)已從分子生物學(xué)的一個(gè)分支發(fā)展成為生命科學(xué)的有效的研究方法。在原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)展過程中兩個(gè)關(guān)鍵性的突破是核酸探針制備的標(biāo)記物的改進(jìn)。核酸探針由克隆的核酸探針發(fā)展到無(wú)克隆的合成的寡核苷酸探針；從放射性同位素標(biāo)記到非放射性標(biāo)記。令人可喜的是，這一技術(shù)還處于不斷的改進(jìn)和更新的過程中。
一、PCR與原位雜交細(xì)胞化學(xué)結(jié)合法
自1988年以來On等科學(xué)家相繼在研究對(duì)導(dǎo)致人類免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，以期提高對(duì)患者的陽(yáng)性檢出率。在系列研究的基礎(chǔ)上，Bagasra及其同事在1990～1993年成功的報(bào)告了原位雜交及聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合法，簡(jiǎn)稱為原位雜交PCR（PCr in situ, PCRIS)。在本書二十二章 中曾介紹了PCR技術(shù)，它是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)，基本步驟包括高溫變性，低溫退火適溫延伸三個(gè)步驟的反復(fù)熱循環(huán)，其效率可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107～109倍。大大提高了DNA的檢測(cè)率。此法不足之外，在于其不能達(dá)到細(xì)胞或組織的定位。PCRIS技術(shù)的基本的原理是首先利用PCR技術(shù)將靶DNA片段擴(kuò)增，然后用原位雜交細(xì)胞或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通過標(biāo)記的核酸探針與擴(kuò)增了的DNA進(jìn)行雜交顯示和定位，其敏感性可達(dá)到顯示單個(gè)拷貝基因的信號(hào)的程度。Bagasra及其同事們利用這一方法，應(yīng)用32P和生物素標(biāo)記的核酸探針分別對(duì)導(dǎo)致人體免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA的單個(gè)拷貝基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后在外周血單核細(xì)胞內(nèi)顯示成功。就算此法對(duì)HIV-1感染患者外周血單核細(xì)胞檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯高于用單純?cè)浑s交技術(shù)的檢出率，說明其敏感度大于單純的原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。其主要實(shí)驗(yàn)步驟為將離心沉淀的細(xì)胞滴入覆有聚四氟乙烯（teflon coated)的設(shè)有三個(gè)凹孔的特制玻片（CellLine Associ－ates,Newfield, NJ ,Cat No 10～ 12,12～14mm的孔)的凹孔內(nèi)，加熱105℃90s，然后以2%多聚甲醛-磷酸緩沖液，pH7.4，固定1h，PBS漂洗3min×3。如用生物素標(biāo)記核酸探針，應(yīng)用0.3%的H2O2孵育37℃過夜，然后以蛋白酶K溶液（5μg/ml PBS)55℃孵育2h（孵育時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的種類而定)，將孵育的載片置于96℃熱板上2min，最終以蒸餾水漂洗，空氣干燥。在溶液中按PCR技術(shù)的需要加入20PM一對(duì)應(yīng)的引物（Primer)，15μg PCR混合液含10μmol/l dATP、dCTP、dGTP和dTTP、50mmol/l KCl,10mmol/L Tris(pH8.3),2.5mmol/L MgCl2和10μl Taq多聚酶（lu/μl,Gene Amp Cetuo)。把上述溶液加入左側(cè)二孔中，留一孔加入無(wú)引物的PCR混合液作為對(duì)照。將載片以22×66mm蓋片覆蓋，片周以無(wú)色指甲油封閉，放入自動(dòng)的熱循環(huán)儀（M.J.Re－seasCH,Boston MA)�？筛牧加娩X錫箔紙覆蓋于熱循環(huán)儀表面再放置載片。按94℃/45℃/72℃每個(gè)溫度1min，30個(gè)循環(huán)。這溫度也可根據(jù)引物的GC比例加以調(diào)整以求得理想的擴(kuò)增。也可根據(jù)下列公式計(jì)算引物的Tm值（Muller & Wold,1989)。
引物Tm=81.5 + 16.6(logM) + 0.41(%GC)–500/n
n=引物的長(zhǎng)度，mol/L=緩沖液中鹽的摩爾數(shù)，一般是0.047mol./L
按擴(kuò)增后，將切片放入100%乙醇3～5min，以銳利刀片移除蓋片，將載片放在90℃熱板上30s，應(yīng)用2×SSC漂洗，然后用生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交。載片在95℃熱板上5min，然后移入溫盒，48℃孵育4h或過夜。次日PBS漂洗，以抗生物素標(biāo)記FITC抗血清（100μg/ml PBS pH7.2)37℃孵育1h，PBS沖洗，以甘油/PBS溶液封片，熒光顯微鏡觀察。如生物素標(biāo)記核酸探針的顯示系統(tǒng)為過氧化物酶，則應(yīng)用DAB/H2O2溶液顯色，常規(guī)光鏡觀察。這一技術(shù)不僅提高了病毒HIV-1的偵檢率，而且可用以確定細(xì)胞內(nèi)攜帶的特殊基因，遺傳片段，病毒和腫瘤的侵犯（load)等，是一項(xiàng)頗具廣闊應(yīng)用前景的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
二、快速原位雜交細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)存在的難點(diǎn)之一是實(shí)驗(yàn)手續(xù)繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。國(guó)外Liesi等（1986)和國(guó)內(nèi)學(xué)者何彬等應(yīng)用光敏生物素-鏈親合素（Biotin-streptavidin)膠體金系統(tǒng)進(jìn)行原位雜交，得到了快速滿意的結(jié)果，全部實(shí)驗(yàn)可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。
作用把含某種多肽或蛋白的cDNA片段的質(zhì)粒，按照第十九章 在光照下標(biāo)記光敏生物素，然后經(jīng)DNA酶消化1h，得到大量100～500bp長(zhǎng)度的混合片段，變性后用于原位雜交。
如為培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞涂片，用95%乙醇、5%乙醇固定5min，PBS沖去固定液，加含探針的雜交液覆蓋（光敏生物素標(biāo)記探針濃度為2.5ng/μl)，在溫盒中50℃孵育1～2h，取出后直接加入膠體金標(biāo)記鏈親合素（1mg/ml)室溫孵育15min，然后在室溫或37℃下用大容量（200ml/每片)洗脫液（2×SSC，0.1%Triton X-100)分別沖洗5～10min，以銀顯影液放大金顆粒顯示原位雜交結(jié)果，可用1%伊紅復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢。醫(yī).學(xué) 全在.線,提供www.med126.com
如為冰凍切片（cryostat section 10～15μm)，應(yīng)經(jīng)新鮮配制4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS沖去固定液，吸干后滴加蛋白酶K（25μg/ml,Sigma)37℃15min，再用4%多聚甲醛室溫固定20min，PBS沖去多聚甲醛，晾干后按上述方法進(jìn)行原位雜交和雜交后沖洗。
三、原位啟動(dòng)標(biāo)記法
原位啟動(dòng)標(biāo)記法（Primed in situ labelling,PRINS)，又叫寡核苷酸啟動(dòng)法（Oligonucleotide－priming method)是Koch（1987)首先提出的，其基本原理是將未標(biāo)記的寡核苷酸探針與細(xì)胞或組織中的靶DNA或RNA進(jìn)行雜交，然后該寡核苷酸探針充當(dāng)引物的作用，在Kelow多聚合酶的催化作用下，將生物素（或地高辛、熒光素)標(biāo)記的核苷酸編入，以達(dá)到原位顯示的目的。PRINS技術(shù)具有3個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：首先由于探針在雜交時(shí)是未標(biāo)記的，僅在雜交之后才進(jìn)行標(biāo)記，因此背景染色很低。至少，從理論上講，背景染色幾乎是零。其次是有效地縮短了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，由于探針未經(jīng)標(biāo)記，無(wú)增加背景染色的顧慮。因此，可增加探針嘗試，縮短反應(yīng)時(shí)間。雜交反應(yīng)時(shí)間只需1h。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間的縮短可有效的保持細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的完整性。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能提高或增加信號(hào)的強(qiáng)度。Koch等曾成功的將此方法應(yīng)用于染色體制片、單層細(xì)胞涂片和組織切片。它們還將此法與流式細(xì)胞計(jì)相結(jié)合以達(dá)到檢測(cè)群體離散細(xì)胞的目的。
在染色體或單層細(xì)胞涂片，載片在70℃的溶液中變性（70%甲酰胺，2×SSC)2min，立即在系統(tǒng)酒精中脫水（70%，80%，90%，95%,100%，V/V)，用吹風(fēng)機(jī)吹干。預(yù)孵育在37℃～53℃20～30min，孵育時(shí)間加蓋玻片，孵育液含2～4pmol寡核苷酸探針，dATP，dCTP，dGTP各10mmol,5mmol生物素-11-dUTP在25μl×NT緩沖液中（1×NT緩沖液含50mmol/l Tris –HCl,pH7.2,10mmol/L MgSO4,100μM二硫蘇糖醇（dithio threitol),50μg/ml牛血清白蛋白)，在預(yù)孵育時(shí)加入1μl的Klenow多聚酶。應(yīng)用100ml 50mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl在65℃洗1min 以終止反應(yīng)，然后放入100ml×BN緩沖液（100mmol/l NaHCO3,Ph8.0,0.01% Nanidet P-40)40℃，進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)的顯示如熒光-親合素標(biāo)記，過氧化物酶-親合素標(biāo)記等。
