PCR技術(shù)必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然后才進(jìn)行自動熱循環(huán)，最后進(jìn)行產(chǎn)物鑒定與分析。引物設(shè)計與合成目前只能在少數(shù)技術(shù)力量較強(qiáng)的研究院、所進(jìn)行，臨床應(yīng)用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環(huán)中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應(yīng)中各種成份加入量和溫度循環(huán)參數(shù)均不一致。現(xiàn)將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度循環(huán)參數(shù)
在PCR自動熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環(huán)，擴(kuò)增片段500bp。在這里，每一步的時間應(yīng)從反應(yīng)混合液達(dá)到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時應(yīng)充分給以重視和考慮，對每一儀器均應(yīng)進(jìn)行實(shí)測。
關(guān)于熱循環(huán)時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應(yīng)時間是按最適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C)%含量進(jìn)行推測，把握試驗(yàn)的起始點(diǎn)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果（G+C)%含量為50%時，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L),退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達(dá)35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴(kuò)增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡便的雙溫循環(huán)是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對于1kb以上的DNA片段，可根據(jù)片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內(nèi)保持良好的活性與穩(wěn)定性；15%～20%的甘油有助于擴(kuò)增2.5kb左右或較長DNA片段。醫(yī).學(xué) 全,在.線,提供www.med126.com
4．循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
擴(kuò)增結(jié)束后，樣品冷卻并置4℃保存。
二、引物引物設(shè)計
要擴(kuò)增模板DNA，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長度，兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴(kuò)增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要。
引物設(shè)計的必要條件是與引物互補(bǔ)的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應(yīng)互補(bǔ)的二條引物，除此之外，引物設(shè)計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機(jī)率的為1次。因此，引物長度一般最低不少于16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72℃)下不會形成穩(wěn)定的雜合體。有時可在5’端添加不與模板互補(bǔ)的序列，如限制性酶切位點(diǎn)或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測等各種目的。
有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（G+C)%含量引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G+C)%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴(kuò)增片段（G+C)%含量時宜接近于待擴(kuò)增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structures)。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補(bǔ)堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer)。所謂引物二聚體實(shí)質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進(jìn)行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品，有時甚至成為主要產(chǎn)物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點(diǎn)；同樣，引物與待擴(kuò)增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點(diǎn)結(jié)合，使特異擴(kuò)增減少，非特異擴(kuò)增增加。
5．引物3’端配對DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。
引物設(shè)計是否合理可用PCRDESN軟件和美國PRIMER軟件進(jìn)行計算機(jī)檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引于最好經(jīng)過色譜（層析)純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應(yīng)保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干后可保存1～2年。
