三、補(bǔ)體法
1．直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法 用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物---抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。
圖3-4 補(bǔ)體法
2．間接檢查組織內(nèi)抗原法 常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合同時加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原抗體—抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。
四、雙重免疫熒光標(biāo)記法
在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時檢查兩種抗原時，要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧�，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。
五、對照試驗
為了保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗時進(jìn)行以上對照試驗：
1．直接法 需設(shè)下述對照試驗
�。�1)標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光)。
（2)抑制試驗：可分為二步法和一步法。
①二步抑制法：標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，再加標(biāo)記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。
�、谝徊揭种品ǎ合葘晒饪贵w用未標(biāo)記抗體作適量混合，再加在標(biāo)本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。此法效果較二步法好，并且簡便。
（3)陽性對照：用已知陽性標(biāo)本作直接法免疫熒光染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。
如對照（1)和（2)無熒光或弱熒光，（3)和待檢查標(biāo)本呈強(qiáng)熒光即為特異性陽性熒光。
2．間接法
（1)自發(fā)熒光對照：同上（一)。
�。�2)熒光抗體對照：標(biāo)本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。
（3)抑制試驗：同上。
（4)陽性對照：同上。
如對照（1)、（2)、（3)均呈陰性，陽性對照和待檢標(biāo)本陽性則為特異性熒光。
3．補(bǔ)體法
�。�1)自發(fā)熒光對照
�。�2)熒光抗體對照
�。�3)抑制試驗
�。�4)補(bǔ)體對照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用標(biāo)本，再用抗補(bǔ)體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。
�。�5)抑制試驗：標(biāo)本加滅活的第一抗體，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標(biāo)記的抗補(bǔ)體血清與抗補(bǔ)體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。
�。�6)陽性對照：（1)～（5)結(jié)果陰性，（6)和待檢標(biāo)本陽性時，則為特異性熒光。
