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| 中藥復(fù)方962膠囊對(duì)老年大鼠海馬區(qū)神經(jīng)生長因子及其受體表達(dá)的影響 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 文章來源：醫(yī)學(xué)全在線 更新時(shí)間：2006-6-14 2:11:54 技能論壇 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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摘 要 目的：在老年性癡呆的發(fā)病中，年齡是最主要的危險(xiǎn)因素，隨年齡增長，發(fā)病率顯著增高，自然衰老大鼠模型是比較接近老年性癡呆病理改變的動(dòng)物模型。我們以往的實(shí)驗(yàn)證明：中藥復(fù)方962膠囊(含何首烏、石葛蒲等六味中藥)能顯著改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。本研究觀察中藥復(fù)方962膠囊對(duì)自然衰老大鼠模型海馬CAI—CA4區(qū)神經(jīng)生長因子(NGF)及其受體TrK A表達(dá)的影響，探討中藥復(fù)方962膠囊治療改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)理。方法：雌性Wistar大鼠老年為22月齡，青年為5月齡。陽性對(duì)照藥為腦復(fù)康(piracetam)0.56g/kg，中藥復(fù)方962膠套高劑量1.8g／kg，962膠囊低劑量0.9g／kg，每日灌胃給藥一次，連續(xù)灌胃2個(gè)月，進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)(水迷宮)和曠場分析后，每組隨機(jī)選取5只，灌注固定，冰凍切片，片厚40μm，每份標(biāo)本均ABC法行NGF和TrK A免疫組化染色。采用法國Noesis Vision公司VISILOG5.0圖象分析系統(tǒng)對(duì)組織切片進(jìn)行分析。顯微鏡放大倍數(shù)為10×10，在海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞層連續(xù)攝取3個(gè)視野，這三個(gè)視野包括了整個(gè)CAl區(qū)，記數(shù)3個(gè)視野內(nèi)總陽性細(xì)胞數(shù)量、 陽性細(xì)胞總面積(象素單位)及陽性細(xì)胞灰度積分值(灰度單位)。海馬CA2區(qū)連續(xù)攝取2個(gè)視野，海馬CA3區(qū)連續(xù)攝取2個(gè)視野，海馬CA4區(qū)攝取齒狀回包含的1個(gè)視野，包括了整個(gè)CA2、CA3、CA4區(qū)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(M±SD)，結(jié)果采用t檢驗(yàn)。結(jié)果：①老年大鼠海馬CAl、CA2、CA3、CA4區(qū)NGF表達(dá)較青年對(duì)照明顯減少，陽性細(xì)胞數(shù)量為青年對(duì)照的19.89％，11.46％，6.65％和26.32％；陽性細(xì)胞總面積為青年對(duì)照的13.97％，6.76％，5.19％和25.01％；陽性細(xì)胞灰度積分值為青年對(duì)照的41.05％，35.49％，16，74％和29.17％。海馬CAl、CA2、CA3、CA4區(qū)神經(jīng)生長因子受體Trk A表達(dá)較青年對(duì)照也明顯減少，陽性細(xì)胞數(shù)量為青年對(duì)照的12.42％，7.07％，9.26％和29.33％；陽性細(xì)胞總面積為青年對(duì)照的7.61％，4.92％，5.62％和23.79％；陽性細(xì)胞灰度積分值為青年對(duì)照的29，30％，18.70％，17.51％和34.19％。以CA2、CA3區(qū)的減少最嚴(yán)重。⑦中藥復(fù)方962膠囊和腦復(fù)康均能提高老年大鼠海馬CAl一CA4區(qū)NGF和Trk A陽性細(xì)胞數(shù)量、陽性細(xì)胞總面積和陽性細(xì)胞灰度積分值，962膠囊高劑量組基本恢復(fù)青年對(duì)照組水平。結(jié)論：老年大鼠神經(jīng)生長因子(NGF)及其受體Trk A在海馬區(qū)表達(dá)明顯減少，可能與其學(xué)習(xí)記憶能力下降有關(guān)；中藥復(fù)方962膠囊能夠明顯促進(jìn)老年大鼠海馬區(qū)NGF及受體TrK A表達(dá)，可能是改善其學(xué)習(xí)記憶功能的藥理學(xué)基礎(chǔ)。增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的表達(dá)對(duì)老年性疾呆的治療有重要意義。 前 言 老年性疾呆(Alzheimer’s disease。AD)是一種老年神經(jīng)退行性疾病，臨床以進(jìn)行性記憶障礙和后天獲得性知識(shí)喪失為特征，原因不明，尚元有效的治療方法。自然衰老大鼠模型是比較接近老年性癡呆病理改變的動(dòng)物模型。我們以往的實(shí)驗(yàn)證明：我室自行組方并研制的新復(fù)方962膠囊(含何首烏、石葛蒲等六味中藥)能顯著改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)在調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長和存活方面起著重要作用，AD過程中神經(jīng)元的丟失至少部分是由于神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏。本文觀察自然衰老大鼠腦內(nèi)是否發(fā)生神經(jīng)生長因子(NGF)及其受體Trk A表達(dá)的變化，以及962膠囊對(duì)內(nèi)源性NGF及其受體Trk A表達(dá)的影響，探討962膠囊改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)理。 材料和方法
2 動(dòng)物： Wistar大鼠雌性，老年大鼠為22月齡(體重330±32g)，青年為5月齡(體重325±19g)。購于北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字01—3056。 3 試劑與主要儀器： ABC試劑盒、神經(jīng)生長因子(NGF)兔抗鼠抗體、酪氨酸蛋白激酶受 體A(Trk A，主要為NGF的受體)兔抗鼠抗體均購自北京中山試劑公司；恒溫冷凍切片機(jī)為英國山盾公司ASE—620型，光學(xué)顯微鏡為NikonTE300型，圖象分析系統(tǒng)為法國NoesisVision公司VISIUG5.0。 4 方法： 表1 大鼠分組給藥情況
注：962膠囊成人臨床用量：7.5g／60kg／日
(2)腦標(biāo)本的免疫組化染色：每組隨機(jī)選取5只，灌注固定，冰凍切片，片厚40μm，為冠狀切面前囪后—4.4mm。PBS洗5分鐘×3次，3％H202室溫孵育10分鐘，PBS洗5分鐘×3次；8—10％封閉用羊血清孵育20分鐘，吸出，加稀釋好的一抗4℃過夜(一抗稀釋度：NGFl：120，TrkAl：120)；PBS洗，加生物素化的兔二抗(1：200稀釋)室溫放置3小時(shí)3PBS洗，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗(1：250稀釋)孵育2小時(shí)；PBS洗，DAB顯色2分鐘，鏡下控制染色程度；Carriz淺復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照設(shè)立；分別以洗液和非免疫的正常鼠血清代替一抗進(jìn)行免疫組化染色，余步驟同前。陽性反應(yīng)為組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈棕黃色顆粒聚集。
(3)圖象分析處理：采用法國NoesisVision公司VISII。OG5.0圖象分析系統(tǒng)對(duì)組織切片進(jìn)行分析。顯微鏡放大倍數(shù)為10×10。在海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞層連續(xù)攝取3個(gè)視野，這三個(gè)視野包括了整個(gè)CAl區(qū)，記數(shù)3個(gè)視野內(nèi)總陽性細(xì)胞數(shù)量、陽性細(xì)胞總面積(象素單位)及陽性細(xì)胞灰度積分值(灰度單位)。海馬CA2區(qū)連續(xù)攝取2個(gè)視野，海馬幟3區(qū)連續(xù)攝取2個(gè)視野，海馬CA4區(qū)攝取齒狀回包含的1個(gè)視野，包括了整個(gè)CA2、CA3、CA4區(qū)。
(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：本研究均使用SPSS軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(M±SD)， 結(jié)果采用t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1 中藥復(fù)方962膠囊對(duì)老年大鼠海馬CAl一CA4區(qū)神經(jīng)生長因子(NGF)表達(dá)的影響
結(jié)果見表2。青年對(duì)照大鼠海馬CAl一CA4區(qū)NGF陽性神經(jīng)元分布較多，老年大鼠模型組海馬區(qū)NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量、陽性細(xì)胞面積及陽性細(xì)胞灰度積分值與正常青年對(duì)照組相比均顯著減少；圖象分析結(jié)果表明，老年大鼠陽性細(xì)胞數(shù)量在CAl一CA4區(qū)分別為青年對(duì)照的19.89％， 11.46％，6.65％和26.32％；陽性細(xì)胞總面積為青年對(duì)照的13.97％，6.76％，5.19％和25，01％陽性細(xì)胞灰度積分值為青年對(duì)照的41.05％，35.49％，16.74％和29.17％，其中老年大鼠海馬CA2、CA3區(qū)NGF的表達(dá)減少最嚴(yán)重。962膠囊與腦復(fù)康給藥組老年大鼠，海馬CAl一CA4區(qū)NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量、陽性細(xì)胞面積及陽性細(xì)胞灰度積分值有不同程度的增加。962膠囊大劑量組(1.8g，kg)老年大鼠海馬各區(qū)的NGF陽性神經(jīng)元基本恢復(fù)青年對(duì)照水平，阻性細(xì)胞數(shù)量是未用藥模型組的4.5，5.1，9.7和3.4倍；陽性細(xì)胞總面積為模型組的7.6，9.8，12.5和4.0倍；陽性細(xì)胞灰度積分值為模型組的1.9，2.5，6.8，3.7倍，962膠囊對(duì)老年大鼠海馬CA2、CA3區(qū)NGF的表達(dá)增加作用最明顯。 表2 962膠囊對(duì)老年大鼠海馬CAl一CA4區(qū)神經(jīng)生長因子(NGF)表達(dá)的影響
n＝5，x±s， 與老年模型組比較， * P＜0．05， ** P＜0．01， *** P＜0．001，
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2 中藥復(fù)方962膠囊對(duì)老年大鼠海馬CAl—CA4區(qū)神經(jīng)生長因子受體Trk A表達(dá)的影響
結(jié)果見表3。老年大鼠模型組海馬CAl一CA4區(qū)神經(jīng)生長因子受體TrkA陽性神經(jīng)元顯著少于青年對(duì)照組，陽性細(xì)胞數(shù)量分別為青年對(duì)照的12.43％，7.07％，9.26％和29，33％5陽性細(xì)胞總面積為青年對(duì)照的7.61％，4，92％，5.62％和23.79％；陽性細(xì)胞灰度積分值為青年對(duì)照的29.30％，18.70％，17，51％和34，19％。962膠囊與腦復(fù)康有增加的作用。962膠囊大劑量組(1.8g／kg)促進(jìn)老年大鼠海馬各區(qū)Trk A表達(dá)的作用最顯示，陽性細(xì)胞數(shù)量是末用藥模型照的4.1，9.6，8.2和2.6倍；陽性細(xì)胞總面積為模型組的6.1，12.8，14，3，3.5倍；附性細(xì)胞灰度積分值為模型組的2.2，4，9，5.4，1.1倍，962膠套對(duì)老年大鼠海馬CA2、CA3區(qū)T山A表達(dá)的增加作用最明顯。 表3 962 膠囊對(duì)老年大鼠海馬CAl—CA4區(qū)Trk A表達(dá)的影響
結(jié)論與討論
海馬區(qū)根據(jù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同分為CA1、CA2、CA3、CA4四個(gè)區(qū)域，它們都與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，但在功能上略有不同。CA2、CA3區(qū)是學(xué)習(xí)記憶的中心區(qū)，而CAl、CA4區(qū)是學(xué)習(xí)記憶的周邊區(qū)。我們的研究發(fā)現(xiàn)：老年大鼠海馬CAl、CA2、CA3、CA4區(qū)NGF表達(dá)均較青年對(duì)照明顯減少，但老年大鼠海馬CA2、幟3區(qū)NGF的表達(dá)減少更嚴(yán)重，與學(xué)習(xí)記憶的功能分區(qū)相一致是造成老年大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的主要原因。 側(cè)腦室內(nèi)注射NGF可減少切斷隔海馬徑路或穹窿傘引起的膽堿能神經(jīng)元退變，老齡大鼠注射NGF可提高膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶的水平，改善認(rèn)知及記憶功能，因此NGF治療AD有理論根據(jù)。文獻(xiàn)報(bào)道腦室內(nèi)灌注NGF(1—3個(gè)月)治療AD病人3例，出現(xiàn)語言插曲記憶改善，額、顳皮層煙堿結(jié)合增加，腦血流增加，說明NGF的治療意義。然而，外源性NGF價(jià)格昂貴，分子量大不易通過血腦屏障，具有嚴(yán)重的副作用(包括體重減輕、疼痛和精神錯(cuò)亂)，并不是理想的治療方法。因此增加內(nèi)源性NGF的合成和釋放，成為研究AD治療的重要內(nèi)容。 962膠囊是我室自行研制開發(fā)的中藥新藥，目前，已完成臨床前藥效及毒理研究。我們以往的實(shí)驗(yàn)證明：962膠囊能顯著改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬CAl—CA4區(qū)錐體細(xì)胞層，962膠囊能明顯促進(jìn)自然衰老大鼠神經(jīng)生長因子(NGF)及其受體(Trk A)表達(dá)，說明其可能含有或?qū)е麦w內(nèi)產(chǎn)生能通過血腦屏障的某些小分子物質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)源性NGF及其受體合成和釋放。962膠囊對(duì)學(xué)習(xí)記憶的中心區(qū)一海馬CA2、CA3區(qū)NGF和Trk A表達(dá)的增加作用最強(qiáng)，這一藥理基礎(chǔ)是其改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的重要機(jī)制，對(duì)于保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)元，防治AD等神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。 |
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