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關(guān)鍵詞： 基質(zhì)金屬蛋白酶；骨改建
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的蛋白酶家族。自1962年Gross和Lapie re首次報道膠原酶(Collagenase)以來，作用于ECM其它成分的基質(zhì)金屬蛋白酶不斷報道。到目前為止已發(fā)現(xiàn)和純化的MMPs至少有20種,已證實MMPs在幾乎機體各種組織的發(fā)育和修復(fù)、腫瘤發(fā)生發(fā)展、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的作用，已愈來愈引起人們的重視。本文就MMPs在骨發(fā)育、代謝與再生等的改建過程中的最新研究進展進行綜述。
1 MMPs的一般特性
MMPs是一組含Zn2+的能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶，通常在中性條件下發(fā)揮活性，有 ca2+參與時活性最大。其活性受螯合劑抑制，但不受絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶 類抑制劑的影響。用cDNA預(yù)測氨基酸序列，表明一些哺乳動物MMPs各種類型酶之間，其結(jié)構(gòu)具有高度的恒定性。MMPs家族所有成員具有一些共同的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域是：前肽結(jié)構(gòu)域、信號肽、催化結(jié)構(gòu)域、凝乳酶樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域等。通過其中某個區(qū)的增減修飾而形成不同的MMPs。如明膠酶在催化區(qū)有一段纖維連接蛋白樣的插入，MMP-7缺少凝乳酶樣結(jié)構(gòu)域，而膜型MMPs含有跨膜結(jié)構(gòu)域等。MMPs均以酶原形式分泌，其活化需要進 行蛋白水解，前肽丟失，分子量減少。體外潛伏型MMPs可被有機汞制劑、促溶劑或蛋白酶激活。MMPs有一些共同的生化特點：①催化機制依賴于活化中心的鋅原子；②蛋白酶均以無活性的酶原形式分泌；③酶原可被蛋白酶激活因子或有機汞制劑激活；④激活過程伴隨分子量的減少；⑤不同細胞來源的MMPs有很高的同源性；⑥激活后的酶可裂解一種或多種細胞外基質(zhì)成分；⑦酶的活性可被MMPs的天然抑制劑TIMPs抑制；⑧多數(shù)MMPs基因轉(zhuǎn)錄受到內(nèi)源性生長因子和細胞因子調(diào)節(jié)，如IL-1和IL-6、TNF-α、TGF-α和IFN-γ以及BMP等。
2 MMPs的分類
MMPs根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性不同可分為5大類：①間質(zhì)膠原酶，包括MMP-1、-8、-13、-18，主要降解Ⅰ～Ⅲ型膠原及Ⅶ和Ⅹ型膠原，不能降解明膠、Ⅳ型和細胞外基質(zhì)的其它蛋白成 分。膠原酶以潛酶原方式合成。MMP-1(Mr=54×103)是成纖維細胞、巨噬細胞、上皮細胞等細胞來源的成纖維細胞型膠原酶。而MMP-8(Mr=75×103)是由中性白細胞 合成分泌的中性白細胞膠 原酶；②Ⅳ型膠原酶，也叫明膠酶，包括明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B (MMP-9)。明膠酶 具 有降解變性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原明膠的特異能力，也可切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型膠原。對纖維結(jié)合素、彈性蛋白也有一定作用。MMP-9(Mr=92×103)是糖化蛋白酶，主要來源于中性白細胞和巨噬細胞。MMP-2(Mr=72×103)是非糖化蛋白酶，來源于許多結(jié)締組織細胞；③基質(zhì)溶解素，包括基質(zhì)溶解素-1 (MMP- 3)、基質(zhì)溶解素-2(MMP-10)和基質(zhì)溶解素-3(MMP-7)，有廣泛的底物特性，可降解纖粘蛋白、層粘蛋白、彈性蛋白和糖蛋白的蛋白核心以及Ⅳ和Ⅸ型膠原等，另外還可去除Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型原膠原N、C末端肽，起原膠原肽酶作用。基質(zhì)溶解素的細胞來源與MMP-1相似；④膜型MMPs，包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)以及近來分離命名的MT5-MMP。這種酶表達于細胞表面，除可直接降解基質(zhì)，還對MMP-2和MMP-13有激活作用；⑤其它類，包括MMP-4、-5、-6、-20。這些未歸類MMPs的作用較特殊，不能歸類于其它MMPs。MMP-4被稱為端肽酶，Mr為35×103，可從牙齦成纖維細胞培養(yǎng)液內(nèi)分離。其作用是促進MMP-1接近膠原分子切割部位以加速膠原降解。MMP-5又叫3/4膠原肽鏈內(nèi)切酶，Mr為54×103。具有膠原酶、明膠酶活性，可以繼續(xù)降解MMP-1降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原所產(chǎn)生的天然3/4膠原片段。MMP-6適合pH=5.3的酸性環(huán)境，故被稱為酸性金屬蛋白酶。其細胞來源尚不清楚，Mr為55×103，可以消化軟骨蛋白多糖。MMP-20在牙齒發(fā)育 過程中表達，能夠分解牙釉質(zhì)蛋白。
3 MMPs的激活
MMPs多數(shù)是以酶原形式分泌，其酶原體的胞外激活機制十分復(fù)雜且尚不完全清楚。膠原酶、明膠酶和基質(zhì)溶解素的激活機制各不相同，現(xiàn)分述如下：①膠原酶的激活：血纖維蛋白溶解酶激活膠原酶原，使其Mr從55×103降為44×103，但酶活性較低�；|(zhì)溶解素繼續(xù)在Glu80-phe81位點切割使Mr進一步降為43×103，從而完全激活膠原酶，這時酶活 性提高近10倍。②明膠酶的激活：Mr為72×103的成纖維細胞明膠酶可被成纖維細胞參與的過程所激活。Seltzer等認為Integrin受體參與的信號傳導(dǎo)途徑參與Mr為72×103的明膠酶的激活。而Mr為95×103的明膠酶原可被血纖維蛋白溶解酶激活。另外有研究發(fā) 現(xiàn)一些細胞因子也可激活明膠酶。③基質(zhì)溶解素的激活：基質(zhì)溶解素可被結(jié)締組織細胞通過依賴血纖維蛋白溶解酶原機制快速激活。此過程中血纖維蛋白溶解酶首先水解基質(zhì)溶解素前肽，所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物再進行自身催化切割而被激活。④MMPs之間的相互激活：研究表明部分MMPs之間可相互激活。例如MT1-MMP可激活MMP-2和MMP-13，而MMP-3、MMP-10在MMP-1的激活中起重要作用，同時也可激活MMP-2。
4 MMPs在骨改建中的作用
MMPs參與了全身組織的發(fā)育、改建以及疾病的病理過程。如胚胎發(fā)育、組織改建、創(chuàng)傷愈合、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)破壞、牙周炎、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等。隨著國內(nèi)外學(xué)者對MMPs的研究日益深入，MMPs在骨胚胎發(fā)育、改建及病理過程中所起的關(guān)鍵作用引起人們的重視。
骨是一種特殊的結(jié)締組織，由多種細胞和細胞間的骨基質(zhì)組成。細胞成分為：成骨細胞(Ost eoblast)、骨細胞(Osteocyte)、破骨細胞(Osteoclast)。骨基質(zhì)(bone matrix)主要成分為 ：膠原纖維(約占90%，主要屬于I型膠原)、蛋白多糖(Proteoglycan)和骨鹽(Bony salt)。骨改建是一個復(fù)雜的多步驟過程，多種細胞參與了此過程，其中破骨細胞和成骨細胞的作用最為關(guān)鍵。而成骨細胞和破骨細胞不僅依賴MMPs對骨基質(zhì)成分的直接降解，而且需要MMPs參與介導(dǎo)成骨細胞對成熟破骨細胞的活化以及破骨細胞的遷移和貼附等過程。
4.1 破骨細胞活化過程中MMPs的介導(dǎo)作用
成熟破骨細胞的活化是骨吸收的前提，而成骨細胞通過分泌MMPs來完成對破骨細胞的活化過程。其中，MMPs中的膠原酶發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用。Holliday等［1］發(fā)現(xiàn)在膠原酶抑制劑存在條件下破骨細胞的骨吸收作用被明顯抑制，而在半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其它MMPs抑制劑存在條件下破骨細胞的骨吸收作用只能部分減弱。這表明鄰近破骨細胞的基質(zhì)細胞和成骨細胞通過釋放大量膠原酶分解膠原產(chǎn)生膠原質(zhì)片段從而激活破骨細胞的骨吸收作用�？梢娔z原酶不僅直接參與破骨細胞的骨吸收過程，而且是成骨細胞誘導(dǎo)破骨細胞骨吸收的中介因子之一。另外，PTH對骨吸收的誘導(dǎo)作用必須依賴膠原酶對I型膠原的裂解。Zhao等［2］的研究表明PTH直接作用于成骨細胞和基質(zhì)細胞促進間質(zhì)膠原酶轉(zhuǎn)錄和合成。從而間接促進破骨細胞的分化和骨吸收功能。Kusano等［3］認為IL-1、-6通過促進破骨細胞合成分泌M mPs來提高破骨細胞的骨吸收作用。
4.2 破骨細胞遷移和貼附過程中MMPs的作用
研究表明MMPs也參與了被活化的破骨細胞向礦化骨表面的移行和貼附過程。Sato等［4］在兔破骨細胞中檢測到高表達的MT1-MMP，而且MT1-MMP與相應(yīng)于板狀偽足和偽足小體( podosome)區(qū)域的基底膜反應(yīng)。推測MT1-MMP與破骨細胞的遷移和貼附有關(guān)。另外Sato等［4］將純化的破骨細胞分別培養(yǎng)于涂或未涂膠原的骨片上。在未涂膠原的骨片上MMPs抑制劑未能抑制骨陷窩的形成，而在涂有膠原的骨片上MMPs抑制劑有效的抑制了骨陷窩的形成。使用其它類的蛋白酶抑制劑沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。表明破骨細胞依賴于部分MMPs的活動以移行到骨吸收區(qū)域�？梢姡琈MPs不僅直接參與骨基質(zhì)降解，而且破骨細胞的遷移和貼附也依賴于部分MMPs的活動。當(dāng)破骨細胞移行骨吸收區(qū)域，骨表面的類骨質(zhì)需要成骨細胞和襯里細胞等細胞釋放膠原酶分解，以使破骨細胞貼附于礦化骨表面行使骨吸收功能。這一點在腫瘤細胞 對骨的侵襲時錨著于骨表面的過程中顯得尤為重要。Ohishi等［5］在體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)與乳腺癌細胞H-31共同培養(yǎng)的成骨細胞所分泌的MMP-1明顯增加。說明腫瘤細胞在誘導(dǎo)破骨細胞進行溶骨之前，必須動員成骨細胞合成分泌膠原酶以去除骨表面的類骨質(zhì)。而在腫瘤轉(zhuǎn)移時要突破的基底膜和細胞外基質(zhì)中所包含的膠原也同樣需要MMPs的降解。例如基底膜中的Ⅳ型膠原就需要明膠酶的特異分解。
4.3 破骨細胞溶解吸收骨基質(zhì)成分過程中MMPs作用
破骨細胞在貼附于礦化骨表面后分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，并在破骨細胞和骨表面之間形成密閉腔隙，將一些酶類分泌于其中來降解骨基質(zhì)中的其它成分。在這些酶中MMPs起關(guān)鍵作用�，F(xiàn)已證明有多種MMPs參與了骨基質(zhì)的吸收過程，包括MMP-1、-2、-3、-9、-10、-13［3］以及MT1-MMP［6］和MT2-MMP等。這些MMPs根據(jù)不同的底物特異性分解骨基質(zhì)中包括 膠原在內(nèi)大部分蛋白成分。這一過程由MMPs單獨完成或是與其它類蛋白酶共同完成。Sires等［7］研究表明MMPs在降解骨基質(zhì)時與其它類蛋白酶有協(xié)調(diào)作用。例如膠原酶在降解Ⅹ型膠原時產(chǎn)生 mr=32×103的片段，而這個片段不能繼續(xù)被膠原酶以及其它類基質(zhì)金屬蛋白酶降解。但卻能被破骨細胞來源的組蛋白B快速分解。這一點也可從破骨細胞分泌不同蛋白酶存在一定順序的現(xiàn)象中得到證明。Everts等［8］研究表明：在破骨細胞貼附于礦化骨表面后創(chuàng)造一個低pH值的吸收環(huán)境，在這個酸性環(huán)境中半胱氨酸蛋白酶首先發(fā)揮作用，降解部分骨蛋白。當(dāng)pH值逐漸回升到中性時基質(zhì)金屬蛋白酶才開始行使其功能。
4.4 MMPs在骨的胚胎發(fā)育中的作用
骨的胚胎發(fā)育過程以骨的快速形成為特點，而在新骨骨基質(zhì)堆積前必須依賴成骨細胞、破骨細胞或其它細胞合成分泌MMPs，溶解吸收骨表面的軟、硬組織以及陳舊的骨內(nèi)基質(zhì)，為新骨開辟空間。在骨形成活躍處可檢測到有大量高活性的MMPs表達說明了這一點。Rice等［9］通過原位雜交觀測到胚胎發(fā)育16d的小鼠顱骨中破骨細胞分泌大量MMP-9，而且集中于骨形成活躍的區(qū)域。推測MMP-9在骨的早期發(fā)育中占有重要作用。Gack等［10］通過原位雜交在14d的小鼠胚胎的各種發(fā)育骨中檢測到MMP-1，特別是在長骨中。這些MMP-1主要由骨形成活躍區(qū)域的肥大軟骨細胞和成骨細胞分泌。推測MMP-1在胚胎發(fā)育階段早期骨形成中發(fā)揮重要作用。
4.5 MMPs的調(diào)節(jié)對骨改建的影響
在正常的骨改建過程中MMPs的基因表達、轉(zhuǎn)錄和活性受到多種因素調(diào)節(jié)而維持在正常水平。例如BMP-2、-4、-6在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平抑制MMP-13合成［11］。Delany［12］等發(fā)現(xiàn)由成骨細胞分泌的基質(zhì)溶解素-3在成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)短期作用下mRNA表達明顯下降，基因轉(zhuǎn)錄并不受影響。而在FGF-2長期作用下基質(zhì)溶解素-3的mRNA表達趨于穩(wěn)定，基因轉(zhuǎn)錄卻明顯增加。TGF-β1通過抑制MMPs產(chǎn)生促使細胞外基質(zhì)沉積。Mattot等［13］對小鼠胚胎發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，在長骨和肋骨的肥大軟骨細胞中或遷移到長骨骨形成區(qū)域的成骨細胞和內(nèi)皮細胞中有膠原酶的轉(zhuǎn)錄積聚，而TIMP-2的基因轉(zhuǎn)錄要提前于膠原酶。提示TIMP-2不僅局限在轉(zhuǎn)錄后，而且在轉(zhuǎn)錄水平對其有調(diào)控作用。而在病理骨改建中對MMPs的調(diào)控作用的失調(diào)導(dǎo)致MMPs的過量表達。Rubin［14］等通過建立廢用尺骨的動物模型研究膠原酶-1的表達，發(fā)現(xiàn)膠原酶-1在廢用尺骨骨細胞中的表達明顯高于正常尺骨。在對骨質(zhì)疏松的研究中發(fā)現(xiàn)：在骨質(zhì)疏松小鼠的脛骨中破骨細胞釋放的MMP-9較正常小鼠高約4倍。Bord［15］等發(fā)現(xiàn)在正常的新生肋骨中破骨細胞持續(xù)表達一定數(shù)量的TIMP-1，而在病理性骨和異位骨中破骨細胞不表達或表達很少的TIMP-1。這表明TIMP與MMPs之間的平衡影響骨的轉(zhuǎn)換和改建過程。
5 展望
骨的改建貫穿于人的整個生命過程，而包括基質(zhì)金屬蛋白酶在內(nèi)的各種蛋白酶在骨改建中的作用被逐漸揭示的同時也日益得到人們的重視。特別是在骨的發(fā)育、生理改建和病理改建過程中各種調(diào)控機制對基質(zhì)金屬蛋白酶的作用機理有待進一步的研究。這將大大推動臨床對于一些骨代謝失衡疾病如骨質(zhì)疏松、佝僂病以及骨腫瘤的治療。
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