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摘要：為探討雌激素對大鼠杏仁核(amygdala, Amy)與紋狀體 (striatum, Str)多巴胺(dopamine, DA)代謝的作用,本實驗采用離體電化學(xué)檢測技術(shù)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定正常雌鼠及經(jīng)雌激素處理的去卵巢(ovariectomy, oVX)雌鼠Amy和Str的DA及其代謝產(chǎn)物的組織含量。實驗結(jié)果顯示, OVX雌鼠經(jīng)雌激素處理后, 可引起Amy的DA及其代謝產(chǎn)物含量減少, 而Str的DA及其代謝產(chǎn)物含量不受其影響。OVX雌鼠Amy的DA更新率低于正常及雌激素處理的OVX鼠, amy組織的DA含量約是Str組織的1/6, 而更新率是Str的2倍左右。以上結(jié)果提示, 雌性大鼠血清雌激素濃度可影響其Amy組織的DA代謝及組織含量, 而Str的DA組織含量不因雌激素濃度的改變而變化。大量研究表明, 雌鼠紋狀體的多巴胺(dopamine, DA)釋放量、含量, 以及DA受體密度和親和力等有著動情周期依賴性變化,而雌激素作為雌鼠體內(nèi)的主要性激素是引起這種動情周期依賴效應(yīng)的主要原因。近年來, 許多學(xué)者認為中腦邊緣系統(tǒng)的DA通路在DA功能中的作用不容忽視。其中, 杏仁核(amygdala, amy)在神經(jīng)退行性疾病帕金森病(Parkinson′s disease, PD)發(fā)病過程中的嚴重受累[1], 使得人們更加重視對中腦邊緣系統(tǒng) DA能神經(jīng)通路的研究。 本室以前的工作表明, 電刺激腹側(cè)被蓋區(qū)誘發(fā)杏仁核的DA釋放具有性別差異, 雌鼠明顯高于雄鼠[2],而電刺激內(nèi)側(cè)前腦束誘發(fā)紋狀體(striatum, Str)的DA釋放未發(fā)現(xiàn)性別差異(待發(fā)表資料)。由此我們認為杏仁核在PD發(fā)病率顯示明顯性別差異[3]的現(xiàn)象中有著重要的作用。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,通過采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC), 在去卵巢(ovariectomy, OVX)大鼠及雌激素處理大鼠身上探討雌激素對Amy以及Str的DA含量的影響,以期能更好地解釋臨床常見的運動紊亂綜合癥如PD發(fā)病率的性別差異, 以及雌激素在Amy和Str組織中的作用。
1材料和方法
1.1實驗動物、 用藥及分組實驗選用體重為200~300 g的成年雌性Wistar大鼠, 置于室溫19±2℃, 24 h晝夜循環(huán)光照條件下生活, 自由飲水、進食。動物于實驗前適應(yīng)實驗室環(huán)境1周。實驗用藥苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate, EB)由上海第九制藥廠生產(chǎn), 用芝麻油稀釋, 終濃度為5、10 μg/0.1 ml。
實驗共分六組, 分別為(1)正常對照組; (2)OVX組; (3) 5 μg EB劑量組; (4)10 μg EB劑量組; (5)20 μg EB(即10 μg eB, 2次/d)劑量組; (6) 替代劑芝麻油(oil)組。正常對照組大鼠在實驗前至少10 d接受去卵巢假手術(shù), 其它各組大鼠需在實驗前至少10 d接受去卵巢手術(shù), 并根據(jù)不同實驗要求皮下注射EB或oil 3 d 。
1.2 卵巢摘除術(shù)方法將雌鼠麻醉后, 在腰背部中央剪開皮膚, 切口約2～3 cm, 令動物一側(cè)臥, 在最末肋骨下約1 cm, 沿脊柱旁切開肌肉, 打開腹腔,結(jié)扎并切除卵巢, 觀察切口處無出血后關(guān)腹; 再令動物側(cè)向另一側(cè), 以同樣的方法取出另一側(cè)卵巢。&nb sp;
1.3 腦組織處理去卵巢雌鼠經(jīng)雌激素處理3 d后, 將大鼠斷頭, 參照Paxinos和Watson[4] 鼠腦立體定位圖譜, 在冰臺上迅速取出Amy和Str組織,將各組織準確稱重, 加入樣品預(yù)處理A液(即0.4 mol/L高氯酸溶液)后將組織勻漿, 經(jīng)12000 r/min離心20 min, 取上清液加入預(yù)處理B 液(mmol/L:檸檬酸鉀 20、 磷酸氫二鉀 300、乙二胺四乙酸二鈉 2), 再經(jīng)12000 r/min離心20 min后, 取上清液置于－80℃低溫冰箱貯存,待行色譜分析測定各樣品組織的DA、 DOPAC和HVA的含量。
1.4 高效液相色譜測定實驗應(yīng)用日本島津公司6 A系列高效液相色譜儀。流動相含(mmol/L): 檸檬酸63.5、 檸檬酸三鈉 61、 乙二胺四乙酸二鈉0.1、八烷基磺酸鈉0.65和10%甲醇, pH 4.3, 流速1.2 ml/min, 設(shè)定工作電壓0.8 V。取樣品20 μl進樣, 檢測各樣品DA、 DOPAC及HVA含量。實驗用主要試劑DA、 dOPAC和HVA均為美國Sigma公司產(chǎn)品。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理各組數(shù)據(jù)均用mean±SE表示, 用t檢驗、 方差分析檢測均數(shù)間的差異顯著性。
2結(jié)果
2.1 雌激素對Amy的DA及其代謝產(chǎn)物含量變化的影響
與OVX組大鼠相比, 給予OVX大鼠皮下注射EB 10 μg/d 可引起大鼠Amy的DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、 HVA的含量分別減少56.4%、50%和54.5%(P＜0.05), 注射EB 20 μg/d后發(fā)現(xiàn)DA、 DOPAC和HVA的含量分別減少58.2%、43.8%和27.3%。正常大鼠及生理劑量組大鼠與OVX 組大鼠相比, Amy的DA及其代謝產(chǎn)物含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2 雌激素對Str的DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響與OVX組大鼠相比, 給OVX大鼠應(yīng)用生理劑量5 μg/d、 以及10、 20 μg/d劑量的EB可使Str的 DA分別降低13.4%、 14.8%、 14.2%, 各劑量組的DA代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量亦有下降趨勢, 然而均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
2.3 Amy與Str的DA組織含量及更新率的比較
研究表明, 正常雌鼠Str的DA組織含量(0.504±0.06 ng/mg)是Amy(0.079±0.017 ng/mg)的6.4倍。當給予OVX雌鼠注射大劑量EB(10、 20 μg/d)時, 由于Amy的DA組織含量減少, Str組織的DA含量分別是Amy的10.1倍和10.6倍。
比較Amy和Str的DA更新率發(fā)現(xiàn), 正常大鼠Amy組織的DA更新率((DOPAC+HVA)/DA)明顯高于Str組織,其DA更新率(0.782±0.108)約是Str(0.308±0.031)的2倍(P＜0.05)。給予OVX雌鼠注射不同劑量的EB后發(fā)現(xiàn), 與OVX組雌鼠Amy更新率相比,各劑量雌激素處理組大鼠的Amy DA更新率均明顯快于OVX組(P＜0.05), 接近正常雌鼠組; 而各組Str組織的DA更新率波動于0.253±0.045～0.315±0.022之間,各組更新率間的比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。
3討論
腦內(nèi)的DA代謝是一個復(fù)雜的過程, 包括DA的合成、 釋放、 代謝即降解和重攝取四個組成部分。我們的前期工作表明電刺激誘發(fā)的 Amy DA釋放具有雌激素依賴性,并隨著雌激素應(yīng)用劑量的增加而釋放增多[5]。本實驗通過采用HPLC技術(shù)檢測細胞內(nèi)外DA及其代謝產(chǎn)物的總含量的結(jié)果表明, amy的DA組織含量因雌激素使用劑量的加大而減少, 此實驗結(jié)果與我們以前的研究結(jié)果相符。因此, 我們先前關(guān)于雌激素對Amy dA釋放的影響和本工作關(guān)于雌激素對Amy DA組織含量影響的綜合性研究得出, 雌激素對Amy組織DA代謝有直接作用。有關(guān)于Str的研究認為,單從DA代謝的某一過程而言, 雌激素可以影響Str的DA代謝。例如， 有研究報道雌鼠Str組織的DA合成酶活性、 dA釋放及DA受體密度和親和力均表現(xiàn)出雌激素相關(guān)性[6]。然而我們的實驗表明雌激素對Str組織DA含量的影響不明顯。綜上所述我們認為, 雌激素對Str的DA代謝不無作用,但就本工作而言尚不能確定雌激素引起的Str的DA組織含量變化是由于影響哪一具體過程所致。此外, 雌激素對Amy與 Str組織DA代謝的不同影響作用也提示, amy與Str的DA代謝過程或機制可能不同。
amy與Str均為富含DA的核團。邊緣結(jié)構(gòu)Amy的DA能神經(jīng)纖維主要來自于腹側(cè)背蓋區(qū)和黑質(zhì), 其DA主要與情感、 運動以及認知機能有關(guān),并參與下丘腦對垂體內(nèi)分泌的控制與調(diào)節(jié)。Str是控制運動的一個重要調(diào)節(jié)中樞, 其DA主要來自于黑質(zhì)內(nèi)的DA能神經(jīng)元。因此, Amy與Str的DA來源及功能均有其不同的特點。1994年, garris等[7]通過在體研究Amy和Str發(fā)現(xiàn), Amy的細胞外DA代謝明顯不同于Str, Amy的細胞外DA清除率約是Str的1/10。我們的實驗從更新率的角度表明,正常雌鼠的Amy組織DA含量約是Str的1/6, 而Amy組織的DA更新率是Str的2倍左右。研究認為, DA 的重攝取是腦內(nèi)DA代謝的主要途徑[8],攝取速度決定DA的半衰期以及擴散距離[9]。我們認為Amy的DA更新率高于Str是因其清除率低于Str的緣故, Amy與Str組織DA代謝的差異可能與DA的組織清除率有關(guān)。
雌激素核內(nèi)受體或膜受體的存在是雌激素作用的必要條件。自1986年雌激素受體(estrogen receptor, ER)成功克隆以來,人們已普遍接受僅有一種ER的觀點。然而, 1996年另一種雌激素受體類型, 即雌激素受體β(estrogen receptor beta, ERβ)的發(fā)現(xiàn)[10]使雌激素作用機制的研究更為樂觀,但也增加了雌激素受體研究的復(fù)雜性。有關(guān)兩種受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織分布的研究發(fā)現(xiàn), 邊緣系統(tǒng)中存在大量ER, 主要是ERα[11], 而Str的ER數(shù)量較少,并且直到1992年才被發(fā)現(xiàn)[12]。然而, 1999年Kuppers等[13]研究發(fā)現(xiàn), ER各亞型(ERα和ERβ)的mRNA在胚胎小鼠的紋狀體含量較高,小鼠出生早期的含量仍保持在較高水平, 而成年后含量則較低, 并且ER的表達無性別差異。因此, 我們認為雌激素對黑質(zhì)-紋狀體和中腦邊緣DA能神經(jīng)系統(tǒng)的作用不同,其原因可能與雌激素受體的分布特征及數(shù)量有關(guān)。
總之, 雌激素對Amy與 Str DA能神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)機制不同, 由此我們認為, Amy與 Str的DA在DA能神經(jīng)元功能障礙性疾病如PD發(fā)病過程中的作用不同, PD發(fā)病的性別差異可能與雌激素影響Amy的DA代謝密切相關(guān), 而Str對于PD的發(fā)病則有著更重要的意義[14]。關(guān)于雌激素作用的受體及其與DA關(guān)系的機制有待于進一步探討。
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