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關(guān)鍵詞： TrkA ChAT 基底前腦 阿爾茨海默病 雌激素
摘 要 酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TrkA）是神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）的功能性受體。膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase,ChAT）是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿合成的關(guān)鍵酶。大鼠發(fā)育過程中基底前腦TrkA、ChAT表達(dá)有一定的規(guī)律，老齡鼠和早老性癡呆病人基底前腦TrkA、ChAT表達(dá)明顯下調(diào)。TrkA、ChAT雌激素受體共存于基底前腦神經(jīng)元。雌性激素對于大鼠基底前腦TrkA、ChAT維持正常的水平發(fā)揮作用。雌性激素替代治療絕經(jīng)后的婦女有助于減少其患阿爾茨海默病的可能性。
關(guān)鍵詞：TrkA ChAT 基底前腦 阿爾茨海默病 雌激素
神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）是一種經(jīng)典的神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF在周圍神經(jīng)系統(tǒng)（peripheral nervous system,PNS）參與交感神經(jīng)元、神經(jīng)嵴起源的感覺神經(jīng)元的發(fā)育、存活，維持及損傷修復(fù)等作用已逐漸為人們所認(rèn)識。八十年以后，人們發(fā)現(xiàn)NGF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（certral nervous system,CNS）中基底前腦（basal forebrain）膽堿能神經(jīng)元有作用。而作用于該部膽堿能神經(jīng)元的NGF主要由靶區(qū)（海馬及新皮質(zhì)）產(chǎn)生，經(jīng)逆行運輸?shù)侥憠A能神經(jīng)元胞體，發(fā)揮其靶源性營養(yǎng)作用。大量的研究表明這類神經(jīng)元亞群在學(xué)習(xí)和記憶中具有特殊功能。
在培養(yǎng)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入NGF時，能誘導(dǎo)PC12突起的生長并使酶的活性提高，但當(dāng)注射NGF到PC12細(xì)胞體或胞核時，并不發(fā)生以上變化，從而說明NGF生理功能的啟動是由膜受體介導(dǎo)的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NGF效應(yīng)細(xì)胞膜上有兩種受體類型，根據(jù)其對NGF的親和性分為高親和力受體（high affinity receptor,HNGFR）和低親和力受體（low affinity receptor,LNGFR）。LNGFR是一種富含半胱氨酸的糖蛋白，其分子量為75kD,所以又稱p75。LNGFR胞質(zhì)部分沒有ATP結(jié)合位點，致使NGF與p75結(jié)合后不能活化內(nèi)源性激酶，故NGF與p75的結(jié)合不能直接發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，但能通過增加HNGFR與NGF的結(jié)合率，影響通過HNGFR進(jìn)行的信號傳遞。1991年Klein[1]等研究發(fā)現(xiàn)HNGFR是由酪氨酸激酶原癌基因（tyrosine kinase proto-oncogene,TrK）表達(dá)的一種跨膜糖蛋白，分子量為140kD�，F(xiàn)已知HNGFR至少有一個亞基由TrkA原癌基因編碼。TrkA由三部分組成：即辨別并結(jié)合NGF的細(xì)胞外部、跨膜部及含酪氨酸激酶的胞質(zhì)部。TrkA是NGF的功能性受體，當(dāng)其與NGF結(jié)合后，可激活酪氨酸激酶信號傳遞系統(tǒng)，從而啟動細(xì)胞活性，產(chǎn)生生物效應(yīng)。Boissiere[2]等用免疫組化方法檢測人基底前腦，發(fā)現(xiàn)99%膽堿能神經(jīng)元有TrkA表達(dá)；有人用原位雜交和免疫組化方法發(fā)現(xiàn)TrkA mRNA和蛋白質(zhì)廣泛地分布于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]。在基底前腦表達(dá)TrkA mRNA的膽堿能纖維廣泛地投射到海馬和新皮質(zhì)。
1 發(fā)育過程中基底前腦TrkA表達(dá)的變化
利用免疫組化方法證實在成年大鼠基底前腦的膽堿能神經(jīng)元有p75和TrkA的表達(dá)[4]，有人用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）探及到胚胎17天大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元無TrkA mRNA表達(dá)[5]，生后3天到2周才發(fā)現(xiàn)有TrkA mRNA的表達(dá)；Li[6]等用原位雜交和Northern印跡等方法定量分析TrkA mRNA、ChAT mRNA在大白鼠胚胎、生后、成年基底前腦內(nèi)側(cè)隔核（MS）的變化。發(fā)現(xiàn)胚胎17天時均無表達(dá)，生后0天少數(shù)幾個細(xì)胞表達(dá)TrkA mRNA、ChAT mRNA；生后4天至11天，兩者表達(dá)明顯增加，生后21天表達(dá)最強(qiáng)，高于成年鼠的水平。生后30天呈下降趨勢，在成年鼠維持在一個相對穩(wěn)定比較高的水平。TrkA mRNA和ChAT mRNA的表達(dá)有相似的時空模式。最近有人用免疫組織化學(xué)方法觀察TrkA表達(dá)，無ChAT表達(dá)，生后5天可見ChAT表達(dá)，生后20天TrkA mRNA表達(dá)達(dá)高峰；生后30天下調(diào)，成年時維持相對較高水平，老年時TrkA mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。大鼠基底前腦Meynert基底核TrkA表達(dá)早于ChAT表達(dá)。從生后5天起，TrkA、ChAT表達(dá)有相似的時間模式。TrkA可能參與Meynert基底核膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育、分化、成熟。NGF mRNA、TrkA mRNA在發(fā)育過程中的變化對于基底前腦膽堿能神經(jīng)元的存活及突起形成可能起一定的調(diào)節(jié)作用。在腦發(fā)育不同階段基底前腦膽堿能神經(jīng)元TrkA基因表達(dá)具有階段性差異，Hsiang[7]等用原位雜交方法發(fā)現(xiàn)，在出生后1天大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元沒有測到TrkA基因，以后逐漸增加，4周時達(dá)最高水平，這種發(fā)育階段的變化與海馬及皮質(zhì)中NGF mRNA基因表達(dá)的變化有平行關(guān)系[8]，提示NGF對膽堿能神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)控作用，也反應(yīng)了這個過程中NGF受體對這種調(diào)控的參與。
2 老齡鼠和阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease,AD）病人基底前腦膽堿能神經(jīng)元TrkA、ChAT表達(dá)的變化
Cooper[9]等將125I-NGF注射入成年大鼠和老齡大鼠（26～30個月）海馬內(nèi)，發(fā)現(xiàn)老齡鼠內(nèi)側(cè)隔核能攝取和逆行轉(zhuǎn)動125I-NGF的ChAT免疫反應(yīng)神經(jīng)元數(shù)目減少31%，不能攝取和逆行轉(zhuǎn)運125I-NGF的膽堿能神經(jīng)元嚴(yán)重萎縮、胞體的平均面積減少60%，同時，TrkA mRNA表達(dá)下調(diào)43%，而p75沒有差異。表明老齡鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元維持受體介導(dǎo)靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的攝取和逆行轉(zhuǎn)運能力下降，導(dǎo)致NGF信號傳遞功能削弱。增加了老年動物膽堿能神經(jīng)元變性的易感性。最近我們用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)老齡鼠（Meynert）基底核（basal nucleus of Meynert,nBM）TrkA、ChAT-IR神經(jīng)元萎縮、數(shù)量分別減少31.9%、37.5%；胞體平均截面積分別減少39.4%、30.4%；平均灰度分別減少11.8%、9.9%。早老性癡呆是由于基底前腦膽堿能神經(jīng)元的變性死亡及相應(yīng)皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元退化所引起的老年神經(jīng)元退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)及記憶功能障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重的智力低下。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AD病因主要與乙酰膽堿能系統(tǒng)改變有關(guān)。Boissiere[10，11]等用原位雜交方法發(fā)現(xiàn)AD病人與老年人對照組比較，nBM膽堿能神經(jīng)元TrkA mRNA表達(dá)減少75%，差異有顯著性（P＜0.001）；腹側(cè)紋狀體（ventral atriatum）TrkA mRNA表達(dá)減少41%（P＜0.01）。豆?fàn)詈藲ぃ╬utamen）TrkA mRNA表達(dá)減少43%～53%（P＜0.01）。Mufson[12]等用原位雜交方法發(fā)現(xiàn)AD病人與老年人對照組比較，nBM膽堿能神經(jīng)元TrkA mRNA表達(dá)減少66%，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法也得出同樣的結(jié)論。進(jìn)一步用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)：AD病人nBM內(nèi)膽堿能神經(jīng)元TrkA蛋白質(zhì)表達(dá)與老年人對照組比較，AD病人nBM內(nèi)幸存的TrkA iR陽性神經(jīng)元數(shù)量減少60%，染色密度減少35%，細(xì)胞外形皺縮，樹突截斷變形，整個細(xì)胞呈腫脹的球形外觀（swollen globose appearance）[13]。
3 TrkA對于基底前腦膽堿能神經(jīng)元的作用
Fagan[14]等將小鼠基底前腦、紋狀體膽堿能神經(jīng)元編碼TrkA受體的基因失活（TrkA-/-）發(fā)現(xiàn)生后7天小鼠基底前腦、紋狀體膽堿能神經(jīng)元ChAT-IR陽性產(chǎn)物胞體的平均截面積減少10%～20%；生后20～25天小鼠ChAT-IR陽性神經(jīng)元數(shù)目20%～36%，胞體萎縮變小，ChAT免疫反應(yīng)性降低，胞體和膽堿能神經(jīng)纖維氈標(biāo)記密度減少，表明正在發(fā)育的（TrkA-/-）小鼠膽堿能神經(jīng)元ChAT表達(dá)減少，阻礙發(fā)育成熟。結(jié)果表明正在發(fā)育（TrkA-/-）小鼠膽堿能神經(jīng)元ChAT的表達(dá)減少，細(xì)胞死亡增加。（TrkA-/-）小鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失與生后1～4周時，靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失導(dǎo)致細(xì)胞死亡是一致的[15]。缺乏TrkA受體，NGF不能與特異性的受體結(jié)合，不能進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，正在發(fā)育的基底前腦膽堿能神經(jīng)元不能充分地發(fā)育成熟。
4 TrkA與ChAT、雌激素受體（estrogen receptor,ER）共存
Sobreviela[16]等用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)：內(nèi)側(cè)隔核和斜角帶核內(nèi)95%以上TrkA免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元內(nèi)既含有ChAT也含有p75 nGFR；Meynert基底核內(nèi)80%以上TrkA免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元內(nèi)含有ChAT，95%以上的TrkA免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元內(nèi)含有p75。Gibbs[17]等用免疫組化方法證明50%～80%的膽堿能ChAT免疫反應(yīng)神經(jīng)元內(nèi)含有ER，雌性大鼠較雄性大鼠多10.5%。紋狀體內(nèi)雙標(biāo)細(xì)胞占74.2%，斜角帶核水平支內(nèi)為63.4%。Toran[18，19]等用放射自顯影和原位雜交、免疫組化方法發(fā)現(xiàn)基底前腦膽堿能神經(jīng)元含有雌性激素的高親和性連接位點，即雌激素受體，屬核受體，為一核轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果提示它們的配體（神經(jīng)營養(yǎng)因子、雌性激素）可能作用于同一神經(jīng)元，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特異的基因或者基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)。從而調(diào)控mRNA的細(xì)胞內(nèi)組成，影響蛋白質(zhì)生成的量及其性質(zhì)，最終影響神經(jīng)元的存活、分化、再生和可塑性。
5 雌性激素對于基底前腦膽堿能神經(jīng)元TrkA mRNA和ChAT mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)
Pamela[20]等人將成年大白鼠卵巢切除后10天，HDB和nBM內(nèi)TrkA mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)56%和34%，而ChAT mRNA分別下調(diào)38%～65%，與Gibbs[21]等人研究結(jié)果相似。雌性激素替代治療3天后，TrkA mRNA、ChAT mRNA表達(dá)恢復(fù)到未切卵巢的動物的水平，而VDB中的TrkA mRNA、ChAT mRNA表達(dá)沒有明顯的差異。Gibbs[22]等觀察鼠齡分別為13個月、19個月和25個月的雄性、雌性大鼠，發(fā)現(xiàn)年齡對于MS、nBM內(nèi)ChAT、p75免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的細(xì)胞大小、纖維染色密度的影響沒有顯著性差異，13～25個月齡鼠中，25個月齡鼠TrkA mRNA明顯地減少。將13個月齡鼠卵巢切除6個月后，MS、nBM內(nèi)TrkA mRNA、ChAT mRNA明顯地減少，短期內(nèi)雌性激素替代治療后，MS、nBM內(nèi)TrkA mRNA、ChAT mRNA明顯地減少，短期內(nèi)雌性激素替代治療后，MS、nBM內(nèi)TrkA mRNA、ChAT mRNA部分恢復(fù)。結(jié)果提示卵巢分泌的雌激素對于大白鼠基底前腦MS、nBM內(nèi)TrkA mRNA、ChAT mRNA維持正常水平發(fā)揮重要作用。卵巢切除后，MS和nBM內(nèi)TrkA mRNA表達(dá)減少，對于內(nèi)源性的神經(jīng)生長因子效應(yīng)降低，基底前腦對于衰老和疾病的易感性增加，膽堿能神經(jīng)元的功能下降。因此，長期的卵巢功能喪失，對基底前腦膽堿能神經(jīng)元將產(chǎn)生不利影響。雌性激素替代治療絕經(jīng)后的婦女有助于減少其患AD病的可能。
6 雌性激素和NGF協(xié)同作用，可望應(yīng)用于臨床
雌性激素能夠上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子和它們的受體的表達(dá)，而NGF能夠增加ChAT mRNA的數(shù)量，增強(qiáng)ChAT的活性，從而增加Ach的釋放。雌性激素對于膽堿能系統(tǒng)神經(jīng)元的營養(yǎng)作用可能部分地經(jīng)過神經(jīng)營養(yǎng)因子與其受體結(jié)合后傳遞信息而被介導(dǎo)。Gibbs等研究發(fā)現(xiàn)雌性激素的劑量和給藥治療的周期不同，它對神經(jīng)營養(yǎng)因子基因以及受體的表達(dá)有不同的效果。臨床應(yīng)用中絕經(jīng)后的婦女用雌性激素替代治療可以預(yù)防AD病的發(fā)生[21]，但是乳腺癌發(fā)病率明顯增高這一副作用也不容忽視。雌性激素和NGF協(xié)同應(yīng)用于臨床還有待于進(jìn)一步的探索。
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