|
1942年，Stokstad首次成功地合成了葉酸，并闡明了葉酸的化學結構。半個世紀過去了，葉酸一直是學術界的研究熱點。目前的研究證實，婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經管畸形發(fā)生的重要病因之一［1］。葉酸與同型半胱氨酸代謝關系密切，對預防心血管疾病的發(fā)生具有重要的生物學意義［2］。
葉酸是一組化學結構相似，生化特性相近的化合物統(tǒng)稱，是由喋啶、對氨基苯甲酸和1個或多個谷氨酸結合而成。食物中的葉酸絕大多數(shù)是以喋酰多谷氨酸(或稱多谷氨酸葉酸)的形式存在的。食物葉酸經小腸粘膜細胞內特異葉酰多谷氨酸水解酶的作用，水解為喋酰單谷氨酸(或稱單谷氨酸葉酸，PteGlu)后吸收。吸收后的單谷氨酸葉酸一部分又轉變?yōu)槎喙劝彼崛~酸，在肝臟、紅細胞及其他組織細胞內貯存，其余部分則以單谷氨酸葉酸的形式分布于血漿、組織液、膽汁及尿液中。肝臟的葉酸濃度是血漿的幾百倍，但其單谷氨酸葉酸濃度與血漿相近。
葉酸以8種輔酶形式存在于生物體內，為一碳單位的載體參與嘌呤、嘧啶等重要物質的合成。用于評價人體葉酸營養(yǎng)狀況最常用的檢測指標是紅細胞葉酸及血清或血漿葉酸。目前，葉酸的檢測方法已有多種，其中微生物法、同位素放射免疫法的使用最為廣泛。
一、微生物法
微生物法是檢測生物體內葉酸的經典方法，通常所用的微生物有干酪樣乳酸桿菌（L.casei)、糞鏈球菌和啤酒小球菌屬。此3種微生物對不同形式葉酸的敏感度不同。糞鏈球菌只對非甲基化葉酸敏感，如PteGlu、二氫葉酸(DHF)和四氫葉酸(THF)，可用于鑒別分析各種形式葉酸在不同檢測物的分布。L.casei對單谷氨酸葉酸、含2或3個谷氨酸葉酸(PteGlu2、PteGlu3)及其還原型衍生物均敏感，是3種微生物中反應譜帶最寬的一種，也是最為常用的菌種。它對含7個谷氨酸葉酸(PteGlu7)的敏感度很小，約為對PteGlu敏感度的1％，故有人認為L.casei對超過3個谷氨酸基團的多谷氨酸葉酸無響應。但有研究發(fā)現(xiàn)，L.casei對PteGlu4、PteGlu5、PteGlu6和PteGlu7的敏感度分別為對PteGlu的 65.6％、19.9％、3.5％ 及2.4％，同時對某些形式的多谷氨酸葉酸的敏感度隨培養(yǎng)時間的延長而增加，其機理有兩種可能：其一，微生物在培養(yǎng)過程中合成水解酶，隨培養(yǎng)時間延長，水解酶產量增加，促使部分長鏈谷氨酸水解斷裂；其二，細菌在培養(yǎng)過程中細胞壁對多谷氨酸葉酸的通透性增加。所以，盡管L.casei對葉酸的反應譜帶較寬，但如檢測物中含有多谷氨酸葉酸須將樣品在檢測前加入多谷氨酸葉酸水解酶進行水解，使各種形式葉酸均轉變成單谷氨酸葉酸，否則檢測結果不能代表其葉酸總含量。
傳統(tǒng)的微生物學檢測方法是試管法，操作繁雜。1987年，Newman和Tsai［3］在進行食物葉酸分析過程中，對傳統(tǒng)的方法做了改良，將96 孔酶標板和全自動酶標板讀數(shù)儀(酶標儀)引進方法中，大大減少了試劑的消耗，縮短了加樣及人工讀取檢測結果的時間。如使用在對數(shù)生長期冷凍保存的L.casei菌種或／及對抗生素耐藥菌株，還可使檢測方法進一步簡化。另有研究證實［4］，使用對數(shù)生長期L.casei菌種(ATCC7469)可使檢測物培養(yǎng)時間從36～48 小時減至18小時。O′Broin和Kelleher［5］用L.casei氯霉素耐藥株(NCIB10463)對血清及紅細胞葉酸進行檢測，結果與傳統(tǒng)的微生物法檢測結果呈顯著線性相關(r值分別為0.975和0.96)。使用氯霉素耐藥株，可以省略試劑過濾消毒及無菌操作等步驟。
盡管微生物法靈敏度高，結果準確，但也有許多局限性，如整個實驗周期長，批間檢測結果重復性差，檢測結果受樣品中所含抗葉酸藥物或抗生素成分的影響等。用β-乳酰胺酶處理樣品后，可消除青霉素和先鋒霉素等抗生素對葉酸檢測結果的干擾［5］。
微生物法除可用于檢測血清和全血葉酸外，還可用于檢測紙血片葉酸［6］，檢測結果為葉酸與血紅蛋白的比值。由于紙血片標本制備技術簡單，紙血片葉酸穩(wěn)定性較好，故該法對大規(guī)模人群葉酸營養(yǎng)狀況的流行病學調查具有重要的意義。
二、同位素放射免疫法
盡管微生物法得到各種改進，但仍因耗時大，操作復雜而不能得到廣泛使用。70年代初，有學者提出 同位素放射免疫法檢測血清葉酸。該方法具有快速、簡便的特點，同時由于葉酸放射免疫試劑盒的出現(xiàn)，很快得到普及，尤其廣泛應用于臨床實驗室。
放射免疫法與微生物法檢測葉酸，除原理不同外，檢測結果的意義也有所不同。對大量標本總體而言，兩種方法結果相關性較好，但對個體標本，兩種方法結果的差異較大。微生物法對多谷氨酸葉酸響應值低，不能直接用于檢測葉酸含量。但微生物法對所有單谷氨酸葉酸及其衍生物的反應靈敏度相同，故在用葉酸水解酶處理樣品使所有葉酸形式轉變?yōu)閱喂劝彼崛~酸后進行檢測，可得到準確的葉酸值。同位素放射免疫法對多谷氨酸葉酸反應的相對靈敏度有較大的差別，隨著葉酸濃度增加，反應的相對靈敏度增加，但多谷氨酸葉酸的反應曲線不可能與單谷氨酸葉酸的反應曲線重合；另一方面，多谷氨酸葉酸與結合蛋白的親合性與單谷氨酸葉酸相比較高，不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應靈敏度不同，放射免疫法也不適用于檢測單谷氨酸葉酸衍生混合物。由于上述原因，盡管放射免疫法可用于檢測和評價葉酸的營養(yǎng)狀況，但從定量檢測的角度來講，難以得到準確的葉酸含量值。
目前用于檢測葉酸的放射免疫試劑盒已有數(shù)種，其原理基本相同，但不同的試劑盒檢測結果也有差異［7］,主要區(qū)別有如下幾方面：①競爭結合蛋白不同，或為豬血清結合蛋白，或為牛奶結合蛋白，或為β-乳球蛋白。(l)-5-甲基四氫葉酸與豬血清結合蛋白的親合力好于多谷氨酸葉酸，后者又略好于單谷氨酸葉酸的其他衍生物，而5-甲基四氫葉酸的d型異構體不能與豬血清結合蛋白結合；牛奶結合蛋白與單谷氨酸葉酸和（d,l）-5-甲基四氫葉酸具有相同的親合力，但對單谷氨酸葉酸的其他衍生物的親合力各不相同，對多谷氨酸葉酸的親合力高于對其單谷氨酸葉酸衍生物；β-乳球蛋白則對(d,l)-四氫葉酸的結合力較差。②配制標準系列的溶液不同，主要有兩種，即緩沖液和血清。用血清作配制溶液與用緩沖液作配制溶液的試劑盒相比，檢測結果偏低。③放射免疫法檢測葉酸結果與試劑盒選擇哪一種形式葉酸作標準品有關，如選擇的標準品為(d,l)-5-甲基四氫葉酸，則使用此類試劑盒的前提便是假設檢測物中絕大多數(shù)葉酸是以此單一輔酶形式存在的，從而使檢測結果與實際含量間的誤差增大。以上所述的各種因素可能是造成目前各類試劑盒檢測結果間差別較大的主要原因。所以，盡管各類試劑盒均有其相應的正常值參考范圍，但各實驗室還應結合與葉酸營養(yǎng)狀況有關的其他指標，來確定本實驗室的紅細胞或血漿、血清葉酸正常值。
三、其他方法
1.氣相色譜-質譜檢測：血清或紅細胞葉酸是目前用于評價葉酸營養(yǎng)狀況的兩個重要指標，且紅細胞葉酸是反映體內葉酸貯存狀況的客觀指標，對診斷葉酸缺乏具有更為重要意義。微生物法、放射免疫法可以實現(xiàn)血清或血漿及溶血液葉酸含量的檢測，紅細胞葉酸均是通過某種數(shù)學公式，從溶血液葉酸、血清葉酸和紅細胞壓積等指標計算出來的。1995年，Santhosh-Kumar等［8］提出用氣相色譜-質譜檢測的方法(GC-MS)檢測紅細胞葉酸含量，填補了直接檢測樣品紅細胞葉酸濃度的空白，該方法特異性好，靈敏度高，且結果準確。
2．色譜分析法:以上所述各種葉酸的檢測方法，其檢測結果均為單或／和多谷氨酸葉酸及其衍生物混合物的總量。即使是微生物法也因不同微生物對不同形式葉酸的生物利用率不同，無法進行某一種或某幾種單谷氨酸葉酸衍生物的分析檢測。70年代，有學者提出應用色譜分析法，包括高效離子交換層析、離子對分配層析和高效液相色譜分析(HPLC)技術分離提取各種形式的葉酸，但由于葉酸濃度低于檢測器檢測下限，人們不得不在應用色譜技術分離提取葉酸后，再用微生物學檢測方法進行定量檢測。因該方法費時，需要樣品量較大，故其實際應用受到限制。HPLC-電化學檢測方法對單谷氨酸葉酸及其衍生物的檢測靈敏度高于紫外或熒光檢測方法［9］，對四氫葉酸及5-甲基四氫葉酸的檢測靈敏度是微生物法的10～50倍。此方法可用于人類及大鼠等多種生物樣品葉酸檢測，且檢測前無需樣品濃縮處理。這項技術的應用對體內葉酸吸收、代謝及轉運等基礎理論的研究具有重要意義。1996年，Gunter等［7］發(fā)現(xiàn)，HPLC對全血葉酸的檢測結果與Bio-Rad放射免疫試劑盒對同份樣品葉酸的測定結果相近，但血漿葉酸的測定結果僅為其他方法測定結果的一半，作者認為盡管HPLC對5-甲基四氫葉酸特異性好，但在洗脫過程中有葉酸丟失的可能。HPLC技術復雜，不適用于臨床常規(guī)檢測。
3．離子捕獲法:Wilson等［10］提出離子 捕獲法檢測葉酸，該技術可謂葉酸檢測技術中的最新方法，即在實驗中，樣品加入變性劑后葉酸與內源性結合蛋白分離，釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結合，合成產物經過離子捕獲池而與陽離子纖維結合，最后通過堿性磷酸酶與喋酸(葉酸的類似物)結合物對葉酸結合蛋白上游離結合位點的探查，定量分析樣品的葉酸含量。該研究證實，離子捕獲法測定血清或紅細胞葉酸，其結果與同位素放射免疫法的結果具有良好的相關性，相關系數(shù)分別為0.96 和0.93。
4．其他方法:80年代后期～90年代，有學者相繼提出用非放射性標記蛋白結合技術檢測血液葉酸，其中包括克隆酶供體免疫測定法(CEDIA)［11］、酶聯(lián)配體吸附試驗(ELLSA)［12］、化學發(fā)光受體實驗等［13］。CEDIA方法的原理在激素、地高辛及其他維生素的檢測中已有應用，其血清葉酸檢測結果與放射免疫法相近，該方法檢測速度約為放射免疫法的兩倍，又無離子輻射，操作簡單，可作為一般實驗室常規(guī)檢查。不足之處為費用高，約為放射免疫法的2～3倍�；瘜W發(fā)光法檢測重現(xiàn)性好，靈敏度較高，對低濃度葉酸樣品檢測結果明顯高于其他方法［7］。
20家研究所或臨床實驗室對目前用于檢測血清及全血葉酸的幾種方法進行了比較研究［7］，結果顯示，血清葉酸和全血葉酸檢測結果平均變異系數(shù)分別為27.6％和35.7％，部分樣品用不同方法檢測的結果可相差2～9倍，表明不同實驗室的葉酸檢測結果差異較大，不同檢測方法的檢測結果之間可比性較差。這種差異不利于正確地客觀地評價某人群葉酸營養(yǎng)狀況，同時也給制定每日膳食葉酸供給量帶來困難。隨著葉酸在巨幼紅細胞貧血、高同型半胱氨酸血癥及神經管畸形的預防中的作用進一步明確，確定統(tǒng)一的檢測方法和參照標準，提高葉酸檢測準確率的需求也日益緊迫。目前美國疾病控制中心(CDC)、美國國家標準與技術研究院和美國農業(yè)部等機構已開始這方面的工作。
參考文獻
1 MRC Vitamin Study Research Group.Prevention of neural tube defects: results of the Medical Research Council vitamin study.Lancet，1991，338:131-137.
2 Green R, Jacobsen DW. Clinical implications of hyperhomocysteinemia. In: Bailey LB, ed. Folate in health and disease. New York：Marcel Dekker, 1995.99-102.
3 Newman EM, Tsai JF.Microbiological analysis of 5 -formyltetrahydrofolic acid and other folates using an automatic 96-well reader.Anal Biochem, 1986,154:509-515.
4 Horne DW ,Patterson D. Lactobacillus casei microbiological assay of folic acid derivatives in 96-Well microtiter plates.Clin Chem,1988,34:2357-2359.
5 O′Broin S,Kelleher B.Mi crobiological assay on microtitre plates of folate in serum and red cells. J Clin Pathol,1992,45:344-347.
6 O′Broin SD,Kelleher BP, Davare A,et al. Field -study screening of blood folate concentrations :specimen stability and finger-stick sampling. Am J Clin Nutr,1997,66:1398-1405.
7 Gunter EW,Bowman BA, Caudill SP,et al.Results of an international round robin for serum and whole-blood folate. Clin Chem,1996,42:1689-1694.
8 Santhosh-Kumar CR,Deutsch JC,Hassell KL,et al.Quantitation of red blood cell folates by stable isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry utilizing a folate internal standard.Anal Biochem,1995,225:1-9.
9 Kohashi M,Inoue K,Sotobayashi H,et al.Microdetermination of folate monoglutamates in serum by liquid chromatography with electrochemical detection. J Chromatogr,1986,382:303-307.
10 Wilson DH,Herrmann R,Hsu S,et al.Ion capture assay for folate with the abbott IMx analyzer.Clin Chem,1995,41:1780-1781.
11 van der Weide J,Homan HC,Cozijnsen-van Rheenen E,et al.Nonisotopic binding assay for measuring vitamin B12 and folate in serum.Clin Chem, 1992,38:766-768.
12 Hansem SI,Holm JA.Competitive enzyme-linked ligand sorbent assay(ELLS A) for quantitation of folates.Anal Biochem,1988,172:160-164.
13 Klukas C, Comerci C, Campbell J,et al. A chemiluminescence receptor assay for folate.Clin Chem,1989,35:1194.
... |
