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【摘 要】 目的 了解抗Ⅱ型膠原抗體在類風濕關節(jié)炎(RA)中的臨床意義。方法 以改進的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測179例RA患者和171例其他風濕病患者的血清IgG型抗天然及抗變性Ⅱ型膠原抗體水平。結果 RA患者抗天然和抗變性Ⅱ型膠原抗體陽性率各為22.3%和36.9%，早期RA患者各為30.0%和36.7%。其他風濕病患者中各為3.5%和31.6%，健康人二者均為2.5%�？固烊虎蛐湍z原抗體陽性RA患者類風濕因子檢出率、患者對病情活動性評價高于陰性組(P0.05)�？棺冃寓蛐湍z原抗體和抗天然Ⅱ型膠原抗體同時陽性RA患者的CRP平均水平較高。結論 抗天然Ⅱ型膠原抗體可以作為RA的一個輔助診斷指標�？固烊慌c抗變性Ⅱ型膠原抗體的檢測有助于判斷RA病情活動性。
Anti-type Ⅱ collagen antibodies in rheumatoid arthritis
【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of anti-type-Ⅱ-collagens antibody in rheumatoid arthritis (RA).Method Serum IgG antibodies to native and denatured type Ⅱ collagens (anti-nc Ⅱ and anti-dc Ⅱ) were detected in 179 patients with RA by an improved enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),and their clinical significance was analysed with corresponding clinical materials.Results In RA,the positive rates of anti-nc Ⅱ and anti-dc Ⅱ were 22.3% and 36.9%;in early RA were 30.0% and 36.7%,respectively.In other rheumatic diseases the positive rates were 3.5% and 31.6%,respectively and were both 2.5% in healthy controls.Anti-nc Ⅱ positive RA showed higher prevalence rate of RF and higher scores of patient′s global assessment of disease activity (P 0.05).The presence of anti-nc Ⅱ and anti-dc Ⅱ concomitantly was associated with high CRP level in RA patients.Conclusion Anti-nc Ⅱ could serve as a supplemental parameter in diagnosing RA and together with anti-dc Ⅱ may help evaluate the disease activity.
【Key words】 Rheumatoid arthritis; Anti-type Ⅱ collagen antibody; Enzyme-linked immunosorbent assay; C-reactive protein
抗Ⅱ型膠原抗體(antibodies to type Ⅱ collagen)與類風濕關節(jié)炎(RA)病情活動性、嚴重性的關系目前仍有爭論。本研究參照Fujii等［1］提出的實驗條件檢測179例RA患者、171例其他風濕病和118名正常人血清的抗Ⅱ型膠原抗體，探討其在RA中的臨床意義。結果報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 病人組：為1994年9月至1999年3月在汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕科住院、門診、隨訪的RA患者，共179例，全部符合1987年美國風濕病協(xié)會(ARA)的RA分類標準［2］。其中男性53例，女性126例，年齡17～76歲，平均46.3歲。其中病程1年之內，X線未出現(xiàn)明顯骨質破壞者(以下簡稱早期病例)30例。
1.1.2 對照組：共289例，分為兩組：一組為同期在汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕科門診或住院的非RA的其他風濕性疾病患者171例；另一組為正常對照組，共118名。
1.2 抗Ⅱ型膠原抗體的體測
參照Fujii等［1］的方法。
1.2.1 微量反應板的包被及封閉：正常羊血清于62 ℃加熱20 min，加入固體Tris (0.05 mol/L)、NaCl (0.15 mol/L)和2 mol/L HCl，調pH值至8備用(BNGS)。天然Ⅱ型膠原在46 ℃水浴中加熱20 min，即為變性膠原。
將天然Ⅱ型和變性Ⅱ型膠原分別溶解于0.05 mol/L的醋酸中，濃度為3 mg/ml。0.02 mol/L磷酸緩沖液(PB) pH 7.6稀釋膠原溶液，使?jié)舛葹?0 μg/ml，加入微量反應板孔，每孔100 μl，保鮮膜覆蓋，4 ℃過夜。
在與待檢血清標本進行溫育之前，包被好的微量反應板用含0.05%吐溫－20的生理鹽水溶液洗滌3次，然后每孔加入100 μl BNGS，室溫(24～28 ℃)下封閉30 min，洗滌液洗滌3次。
1.2.2 檢測：BNGS稀釋待檢及陽性對照、陰性對照血清，轉入微量反應板的微孔中，設二孔平行，每孔100 μl，同時設空白對照。室溫溫育2 h，生理鹽水-吐溫溶液洗滌3次。含25%BNGS的0.1 mol/L TBS pH 8.0溶液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG，每反應 孔加入100 μl，室溫溫育2 h，洗滌。將聯(lián)苯二胺和過氧化氫溶解于檸檬酸-磷酸緩沖液pH 5.0中，使各自濃度分別為0.05%和0.017%，加入反應孔，每孔100 μl，37 ℃溫育30 min后每孔加入終止液1.25 mol/L硫酸50 μl終止反應，酶標分光光度計492 nm處測吸光度(A)值。
1.2.3 結果判斷：以正常血清的平均A值加3個標準差作為正常值上限，待檢血清A值超過者即被認為是陽性。
1.3 統(tǒng)計學處理
計量資料數(shù)據(jù)采用t檢驗，計數(shù)資料數(shù)據(jù)采用χ2檢驗。
2 結果
2.1 ELISA工作濃度的選擇：為便于比較，選擇工作濃度時以天然Ⅱ型膠原作為包被抗原，測定血清抗天然Ⅱ型膠原抗體水平。
參照文獻［3］的方法進行。結果表明，Ⅱ型膠原包被液濃度以40 μg/ml，第二抗體辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG稀釋度以1∶400，血清以1∶40稀釋為最佳。
2.2 RA患者及對照組血清抗Ⅱ型膠原抗體檢測結果：179例RA患者中，抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性者40例，陽性率22.3%，顯著高于健康人和疾病對照組(3.5%和2.5%)(P＜0.05)；抗變性Ⅱ型膠原抗體陽性者66例，陽性率36.9%，與正常對照組(2.5%)相比差異有極顯著性(P＜0.000 1)，與其他風濕病(31.6%)差異不大。30例早期RA患者抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性9例，陽性率為30.0%。
抗天然Ⅱ型膠原抗體對RA診斷的敏感性為22.3%，特異性為96.9%，抗變性Ⅱ型膠原抗體對RA診斷的敏感性為36.9%，特異性為80.3%。
2.3 抗Ⅱ型膠原抗體與RA病情的關系：抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性患者RF陽性率高于陰性組(79.5%對61.8%，P＝0.041)，病情活動評分較高(8.5±9.5對6.6±1.5，P＝0.027)�？棺冃寓蛐湍z原抗體陽性RA患者血清CRP平均水平較陰性組高(24.8%對19.6%，P＝0.003)。晨僵時間、壓痛關節(jié)數(shù)、腫脹關節(jié)數(shù)、干燥綜合征并發(fā)率、類風濕結節(jié)的發(fā)生率、功能分級二組間無統(tǒng)計學差異。IgG、IgM、IgA、γ-球蛋白，ESR水平、ANA陽性率及滴度、放射學病情進展及使用SAARDs的比例等方面在陽性組與陰性組無差異�？棺冃寓蛐湍z原抗體陽性的早期RA患者ESR、CRP水平較陰性組增高(P＜0.05)。
27例抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性RA患者抗變性Ⅱ型膠原抗體同時陽性。本組病人RF檢出率高于其他RA患者(P＜0.05)。CRP水平也較高(19.6±17.5對16.8±16.0，P＝0.007)。
3 討論
抗Ⅱ型膠原抗體檢測方法有多種，目前以ELISA法應用最為廣泛。Fujii等［1］比較了吐溫－20、牛血清白蛋白和一些動物血清(如兔、雞、牛、羊)阻止人血清免疫球蛋白與酶標微量反應板的吸附作用后認為，與其他動物血清及吐溫－20相比，兔和羊血清減少非特異性吸附作用效果最好。他用正常新鮮兔血清封閉酶標反應板，使RA病人與健康對照者血清的抗Ⅱ型膠原抗體滴度差異明朗化，并進一步提出該抗體可作為RA的一早期診斷指標［4］。我們雖未做多種動物血清封閉酶標反應板的比較，但通過采用Fujii等改進的ELISA檢測血清抗Ⅱ型膠原抗體水平后我們發(fā)現(xiàn)，對照組抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性率甚低，使其對RA的診斷特異性達96.9%，在早期RA中敏感性略高于非早期RA患者，表明該抗體的檢測可以作為對RA診斷的一個補充。
本組RF檢出率在抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性RA患者較陰性組高，且有統(tǒng)計學意義。與林冰等［5］所觀察到的結果一致。國外的報道多認為抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性與RF檢出率無關［6］。是否存在人種差異，有待進一步證實。
CRP為一急性時相反應產物，其水平可作為判斷RA活動性的一個指標。Morgan等［7］報道僅部分RA患者CRP與抗天然及抗變性Ⅱ型膠原抗體 水平相關。本組179例RA患者抗變性Ⅱ型膠原抗體陽性者血清CRP平均水平明顯高于陰性組，且有高度的統(tǒng)計學意義。抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性組患者CRP水平偏高。早期RA抗變性Ⅱ型膠原抗體陽性患者ESR、CRP水平顯著較陰性者為高，提示這組患者炎癥活動似更為顯著。
Charriere等［8］研究認為，抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性與患者X線病情進展較慢、較輕有關。但林冰等［5］報道抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性RA患者關節(jié)X線分期較高，認為該組病人病情更重。我們的研究未發(fā)現(xiàn)抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性組與陰性組在放射學分期、Sharp評分上有統(tǒng)計意義的差別。
在本研究中，RA患者抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性者抗變性Ⅱ型膠原抗體多呈陽性，單純抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性者較少(占全部抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性RA患者的31.7%)。進一步分析抗天然和抗變性Ⅱ型膠原抗體與臨床的關系發(fā)現(xiàn)，抗天然Ⅱ型膠原抗體陽性與否對抗變性Ⅱ型膠原抗體與CRP水平的關系有影響：當抗天然Ⅱ型膠原抗體陰性時，抗變性Ⅱ型膠原抗體與CRP水平即無明顯關系，表明抗天然Ⅱ型膠原抗體狀況對活動性同樣起著關鍵作用，檢測抗Ⅱ型膠原抗體有助于對RA活動性的估計。
參 考 文 獻
1,Fujii K,Tsuji M,Murota K,et al.An improved enzyme-linked immunosorbent assay of anti-collagen antibodies in human serum.J Immunol Methods,1989,124:63-70.
2,Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1988,31:315-324.
3,馬東來，張敏，許華林，等.類風濕關節(jié)炎患者血清Ⅱ型膠原抗體檢測.中國實驗臨床免疫學雜志，1996，8：28-30.
4,Fujii K,Tsuji M,Kitamura A,et al.The diagnostic significance of anti-type Ⅱ collagen antibody assay in rheumatoid arthritis.Int Orthop,1992,16:272-276.
5,林冰，吳東海，張榮富，等.類風濕關節(jié)炎患者抗天然Ⅱ型膠原抗體的測定及臨床意義.中國康復醫(yī)學雜志，1997，12：170-172.
6,Choi EK,Gateaby PA,McGill NW,et al.Autoantibodies to type Ⅱ collagen:occurrence in rheumatoid arthritis,other arthritides,autoimmune connective tissue diseases,and chronic inflammatory syndromes.Ann Rheum Dis,1988,47:313.
7,Morgan K,Clague RB,Collins I,et& nbsp;al.A longitudinal study of anticollagen antibodies in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1989,32:139-145.
8,Charriere G,Hartmann DJ,Vignon E,et al.Antibodies to types Ⅰ,Ⅱ,Ⅸ and Ⅺ collagen in the serum of patients with rheumatic diseases.Arthritis Rheum,1988,31:325-332.
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