缺血性腦損傷腦內(nèi)移植治療研究進(jìn)展與前景

關(guān)鍵詞： 缺血性腦損傷 腦內(nèi)移植 胚胎 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

　　摘要　　腦移植已成為神經(jīng)科學(xué)中令人注目的領(lǐng)域，采用腦內(nèi)移植治療缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究已逐漸引起人們的關(guān)注，被視為治療缺血性腦損傷很有希望的新途徑、新策略。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和細(xì)胞系的移植由于避開了胎腦移植的倫理和來源問題，已成為新的研究熱點(diǎn)和方向。

　　自Thompson首次進(jìn)行大腦皮質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)以來，腦移植經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，已成為神經(jīng)科學(xué)中令人關(guān)注的領(lǐng)域。近年來，腦內(nèi)移植治療缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究已十分活躍，并取得了很大進(jìn)展[1-3]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，無論是胎腦組織移植還是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植，缺血性腦損傷的腦內(nèi)移植治療均顯示出了較好療效4-6]，為未來臨床應(yīng)用積累了實(shí)驗(yàn)資料。DNA重組技術(shù)和腦立體定向技術(shù)的發(fā)展，使得在未來的臨床應(yīng)用中，可通過建立和發(fā)展細(xì)胞系和細(xì)胞庫，采用腦立體定向技術(shù)的方法，對受體腦進(jìn)行幾乎無損傷的多靶點(diǎn)注射移植和重復(fù)移植。

　　1. 胎腦組織、細(xì)胞移植

　　理想的供體組織及來源，一直是腦移植研究中的重要問題。盡管在未來腦內(nèi)移植治療中，胎腦組織可能因來源和倫理問題而應(yīng)用受限[3，7]，但大量研究表明，胎腦組織具有抗原性低和能無氧代謝等特點(diǎn)，移植后易于成活，能繼續(xù)生長、分化和表達(dá)組織所特有的各種受體[8]，并能與受體腦整合，可產(chǎn)生較好的治療效果[2，4，6]，因此胎腦組織至今仍是腦內(nèi)移植較為理想的的供體組織來源。

　　1.1治療皮質(zhì)、紋狀體缺血性損傷

　　Jansen等[6]對新生期缺血缺氧性損傷大鼠進(jìn)行了胚胎皮質(zhì)細(xì)胞懸液移植治療，盡管已損皮質(zhì)細(xì)胞構(gòu)筑未見明顯重建，但免疫組織化學(xué)顯示移植細(xì)胞明顯呈現(xiàn)為與正常皮質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)化學(xué)表型上的相似性，且移植細(xì)胞與受體腦之間建立了廣泛的纖維投射，宿主動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)缺失得到了相應(yīng)改善。Tillotson等[9]對皮質(zhì)缺血性損傷后進(jìn)行的腦內(nèi)移植證明，移植的胎腦皮質(zhì)組織塊可以成活。Hadani等[10]的研究表明，移植細(xì)胞不僅能在皮質(zhì)梗死灶周邊，而且也能在皮質(zhì)梗死灶中心成活。另有研究表明[11]，皮質(zhì)梗死后梗腦內(nèi)移植與優(yōu)良環(huán)境結(jié)合起來可使神經(jīng)功能得到了意想不到的改善。推測其機(jī)制可能為優(yōu)良環(huán)境激活了各種營養(yǎng)因子的產(chǎn)生；但也有人推測[12]，優(yōu)良環(huán)境可刺激和加強(qiáng)腦的可塑性。Goto等[13]還研究了移植后腦室內(nèi)長期給予GABA激動(dòng)劑muscimol能否通過挽救紋狀體缺血性損傷大鼠宿主黑質(zhì)部分網(wǎng)狀系統(tǒng)神經(jīng)元（sNr神經(jīng)）不致越神經(jīng)元死亡而促進(jìn)紋狀體黑質(zhì)通路的重新形成。他們發(fā)現(xiàn)，移植鼠與未行移植的紋狀體損傷大鼠相比：⑴有明顯的從移植物至同側(cè)黑質(zhì)的軸突投射；⑵同側(cè)黑質(zhì)部分網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存活神經(jīng)元明顯增加；⑶用muscimol的移植動(dòng)物出現(xiàn)脫水嗎啡誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)動(dòng)行為者明顯減少，而未用muscimol者則未見明顯減少。這些結(jié)果提示，移植細(xì)胞的宿主靶神經(jīng)元的保存可能促進(jìn)了移植宿主腦-移植物纖維連接，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)。

　　紋狀體缺血性損傷后的腦內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)研究表明，移植物可以成活并與宿主腦發(fā)生整合，使宿主動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為障礙得到改善[3，14]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，未來臨床上應(yīng)用腦骨移植治療缺血性腦皮質(zhì)、紋狀體損傷具有可行性。

　　1.2治療海馬缺血性損傷

　　海馬是全腦缺血最常見的易損區(qū)[1]。在臨床上，海馬的缺血性損傷�？捎勺渲小⑿姆文X復(fù)蘇、及外傷、新生兒窒息、癲癇等多種病因引起，可出現(xiàn)相應(yīng)的學(xué)習(xí)、記憶力功能障礙。大量研究[2，4，7]表明，移植物也能在缺血性損傷的海馬內(nèi)成活，并能與宿主腦整合，使已損神經(jīng)環(huán)路得到重建，以闡明移植物與受體腦之間的整合和發(fā)揮效應(yīng)的具體機(jī)制，觀察移植物可能產(chǎn)生的不利效應(yīng)。Masada等[15]比較了缺血后CAI區(qū)或門/齒狀回區(qū)海馬胎腦移植大鼠功能結(jié)果和形態(tài)學(xué)改變，用雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞和低血壓制作缺血模型，缺血1周后，將胎鼠海馬神經(jīng)元移植至雙側(cè)背側(cè)海馬CAI區(qū)或門/齒回區(qū)，移植4周后，用水迷宮法連續(xù)檢測大鼠行為5d,所有動(dòng)物均經(jīng)灌注固定進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。結(jié)果表明，背側(cè)海馬CAI區(qū)移植與記憶和形態(tài)學(xué)恢復(fù)，移植至背側(cè)海馬CAI區(qū)的神經(jīng)元的形態(tài)上與CAI錐體神經(jīng)元相似，可被鈣結(jié)合蛋白D染成陽性，相反移植至背側(cè)海馬門/齒狀回區(qū)的移植物在形態(tài)上呈異質(zhì)性，用鈣結(jié)合蛋白D染色不濃�？梢姡�缺血后將胚鼠海馬神經(jīng)元移植至背側(cè)海馬CAI區(qū)可有效促進(jìn)記憶功能和形態(tài)的恢復(fù).

2.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和細(xì)胞系的腦內(nèi)移植

　　近年來，隨著DNA的重組技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及細(xì)胞系移植已成為腦移植研究新的熱點(diǎn)。盡管一些研究結(jié)果提供了胚胎CAI移植能促進(jìn)全腦缺血后功能恢復(fù)的證據(jù)，但由于臨床應(yīng)用胚胎組織有些實(shí)踐和倫理學(xué)問題，其應(yīng)用仍受限[1]。Arnold等[16]提示，人海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育至少需要15周。大量研究正致力于發(fā)展非胚胎性供體組織來源。已有一新紀(jì)元與缺血性腦損傷相關(guān)的進(jìn)展，特別是已開發(fā)出營養(yǎng)性移植物和具有靈活發(fā)育能力的祖細(xì)胞、前體細(xì)胞或干細(xì)胞移植物[1]。

　　叢腦缺血可誘導(dǎo)包括腦源性生長因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3-（NT-3）在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子以及生長因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）合成的部位特異性增加。這些改變的時(shí)間過程和發(fā)布提示，它們在啟動(dòng)損傷和回路重建中起重要作用。給予合適的生長因子可增強(qiáng)細(xì)胞存活，特別是在CAI區(qū)，此區(qū)NGF不能上調(diào)，可能與對缺血易損有關(guān)。大量生長因子在缺血模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用�，F(xiàn)已證明，腦室內(nèi)注射胰島素樣生長因子1（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和NGF能減輕缺血缺氧或皮質(zhì)血供中斷后梗死[1]。將大分子物質(zhì)給至合適位置是需要克服的主要問題，顱內(nèi)灌注大分子物質(zhì)可導(dǎo)致創(chuàng)傷或炎癥反應(yīng)，因此將轉(zhuǎn)染過的能釋放合適生長因子的載體細(xì)胞植入靶點(diǎn)是一種有效的替代途徑。全腦缺血前7d，將遺傳修飾過的能表達(dá)NGF的成纖維細(xì)胞植入海馬CAI-CA2區(qū)可減輕海馬CA1-CA2區(qū)細(xì)胞脫失[17]。用能釋放NGF或其他保護(hù)性生長因子的聚合物包裹細(xì)胞也可作為移植的插入和穩(wěn)定載體。Maysinger等[18]表明，包裹移植物可減輕皮質(zhì)血供阻斷后的損傷。將McKay及其同事開發(fā)的細(xì)胞系HiBs用NGF基因轉(zhuǎn)染后，可作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的另一安全途徑[1]。這些移植物能增加老年或損傷小鼠基底前腦膽堿能細(xì)胞體的大小和數(shù)量。

　　適合移植的干細(xì)胞或祖神經(jīng)元細(xì)胞系的開發(fā)也正在進(jìn)行之中，為了最有效利用之，這些細(xì)胞必須是條件永生性的（conditionally immortalised）[1]。例如，用溫度敏感性癌基因如SV40大T抗原轉(zhuǎn)染，可允許細(xì)胞在低于許可溫度（330C）時(shí)快速增殖并可體外處理，一旦移植至非許可腦溫（380C）環(huán)境中，細(xì)胞停止分裂而分化成成熟神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞[1]。其次，這些細(xì)胞必須來自祖源（progenitor source），如神經(jīng)上皮（NE）干細(xì)胞，具有多能性發(fā)育能力，以便能根據(jù)其移植進(jìn)的宿主區(qū)域的信號(hào)而發(fā)育成不同類型細(xì)胞。祖細(xì)胞移植物至新生或成年大鼠皮質(zhì)、海馬或小腦均能發(fā)育成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞[1]。

　　Kershaw等[19]已鑒定出來自H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)上皮的條件永生細(xì)胞群（conditionally immortalised cells），它們在干擾素誘導(dǎo)性H-2Kb啟動(dòng)子的控制下表達(dá)突變型SV40大T抗原等位基因。在允許溫度下（330C），這些細(xì)胞可在體外培養(yǎng)基中加了bFGF時(shí)較長時(shí)間表達(dá)nestin（祖細(xì)胞特征分子），可被溴脫氧尿苷（BrdU,正在分裂細(xì)胞特征分子）著色。然而一旦置于非許可溫度（370C）并移去bFGF則BrdU標(biāo)記細(xì)胞分化成多種類型細(xì)胞、一些細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)原纖維特征分子（神經(jīng)元特異烯醇酶，RT97），一些細(xì)胞具有遞質(zhì)特異反應(yīng)性，另一些細(xì)胞則表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞特征分子GFAP。因此，這一細(xì)胞群包含有不同分化能力的祖細(xì)胞，這些細(xì)胞能對缺血環(huán)境發(fā)生反應(yīng)，在這種環(huán)境中、生長因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子和它們的高親和性受體均能促進(jìn)移植物成活、分化和突觸形成[1]。研究者們已將H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞宿主動(dòng)物產(chǎn)生了具有與胚腦細(xì)胞移植同樣有效的移植效應(yīng)，并認(rèn)為這些永生性神經(jīng)細(xì)胞系以及來源于神經(jīng)的更重要的和更具具潛力的移植供體，并將有可能避免未來腦內(nèi)移植使用胎腦供體所面臨的倫理和來源短缺問題。

　　最近，Borlongan等[5]將培養(yǎng)的還原于人胚胎腫瘤細(xì)胞系的神經(jīng)元（NT2N）移植至栓塞性大腦中動(dòng)脈閉塞致短暫局灶性腦缺血大鼠腦內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。移植后1-6個(gè)月，移植NT2N細(xì)胞并用免疫抑制劑治療的缺血?jiǎng)游锱c接受大鼠胎小腦細(xì)胞移植或僅給賦型劑的缺血?jiǎng)游锵啾�，被�?dòng)躲避試驗(yàn)明顯改善，不對稱運(yùn)動(dòng)行為明顯正�；�。冷凍保存NT2N細(xì)胞移植物與新鮮NT2N細(xì)胞移植物相比，在免疫抑制大鼠腦內(nèi)更具活力，更能促進(jìn)免疫抑制和缺血?jiǎng)游镄袨榈幕謴?fù)。這些結(jié)果提示，在神經(jīng)移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)，異種移植和冷凍保存在作為克隆細(xì)胞系移植物來源的有效工具。NT2細(xì)胞系是Andrew等從一種人類畸胎瘤中分離出來的一種胚胎癌細(xì)胞系，來自這種細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過用視黃醛酸處理后，可以分化成類似神經(jīng)元樣細(xì)胞，故稱NT2N細(xì)胞。在Borlongan的移植試驗(yàn)中，NT2N細(xì)胞移植后宿主動(dòng)物并沒有顯示任何不良反應(yīng)，進(jìn)一步提示一些經(jīng)處理后的人類癌性細(xì)胞克隆系也將可能是一種重要的腦內(nèi)移植供體。

3　問題與展望

　　腦內(nèi)移植至今仍是神經(jīng)科學(xué)的前沿，因此目前仍將面臨著許多重要的難題，如移植的免疫問題，供體的來源問題，以及移植物是否能長期存活和與宿主的整合問題等。但基于目前腦內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展，建立和發(fā)展永生性神經(jīng)細(xì)胞系及神經(jīng)干細(xì)胞，仍將可能是今后缺血性腦損傷以及其他腦內(nèi)移植治療研究的重要方向。隨著這些用于腦骨移植治療的細(xì)胞系和細(xì)胞庫的建立，將腦內(nèi)移植與藥物的保護(hù)治療相結(jié)合，腦血管病的治療也許將不再是一個(gè)難題。