睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體的研究進展

關(guān)鍵詞： 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 受體 基因表達

　　摘要　　睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）自70年代發(fā)現(xiàn)以來倍受重視，其對神經(jīng)細胞的生長、分化具有明顯的營養(yǎng)作用。有關(guān)CNTF及其受體的組織分布、蛋白質(zhì)和基因的分子結(jié)構(gòu)、生長學活性、表達調(diào)節(jié)等的研究取得了新的進展并展現(xiàn)了臨床應用前景。

　　1956年Cohen純化出第一個神經(jīng)營養(yǎng)因子——神經(jīng)生長因子（NGF），隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5（NT-4/5），構(gòu)成了神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT-Fs）家族，它們對神經(jīng)細胞生長、分化有重要作用。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF）因最初從鳥的睫狀神經(jīng)節(jié)中提取出來，可維持副交感神經(jīng)節(jié)活性而得名，它不屬于NTFs家族成員，與其無同源性，屬非靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。CNTF最早由Helfand等在1976年發(fā)現(xiàn)，1984年Barbin等從雞睫狀神經(jīng)元提取獲得，并于1989年獲得CNTF cDNA。

　　1 CNTF及其受體的組織分布

　�、臗NTF陽性細胞 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CNTF陽性細胞主要分布在大腦皮質(zhì)、嗅球、小腦皮質(zhì)下區(qū)。體外培養(yǎng)的Ⅰ型膠質(zhì)細胞也可見CNTF表達。細胞內(nèi)定位：膠質(zhì)細胞主要在胞體、突起呈陰性，神經(jīng)元細胞在胞核、胞漿呈陰性[1]；但亦有不一致的報道[2]。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)，CNTF主要分布在髓鞘/雪旺細胞、睫狀神經(jīng)節(jié)；雪旺細胞CNT呈高水平表達，主要分布于胞體和突起，而核中無陽性反應。

　　⑵睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（CNTFR） 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以小腦CNTFR-α mRNA水平最高，其他依次為后腦、中腦、丘腦、下丘腦、紋狀體、海馬、皮質(zhì)和嗅球，且腦脊液中也存在可溶性CNTFR-α，在外周組織中以胃髓肌CNTFR-α mRNA水平最高，其次為皮膚、肺、腸、腎、肝、脾和胸腺。周圍神經(jīng)系統(tǒng)的交感神經(jīng)節(jié)、副交感神經(jīng)節(jié)均存在CNTFR。

　　2 CNTF和CNTFR的分子結(jié)構(gòu)

　　⑴人類CNTF（hCNTF） hCNTF分子質(zhì)量為（20-24）×103（20－24 kD），酸性蛋白質(zhì)，僅在第17位有一個Cys，分子內(nèi)無二硫鍵、也無N-糖基化位點和信號及肽，屬于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，而非分泌蛋白質(zhì)，與LIF、IL-6、OSM、GOSF等可能同屬一個家族，富含α-螺旋結(jié)構(gòu)，具有相似的四螺旋束樣空間結(jié)構(gòu)。有A、B、C、D等4個螺旋結(jié)構(gòu)，其C端形成松散的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，B螺旋結(jié)構(gòu)后段和C螺旋結(jié)構(gòu)可能形成蛋白質(zhì)的疏水核心[3]。

　�、艭NTFR CNTFR分子質(zhì)量52×103（52 kD）,是由三個亞基（CNTFR-α、LIFR-β和gp130）構(gòu)成的復合體。CNTFR-α是CNTF的特異結(jié)合蛋白質(zhì)，如果缺損，gp130將與LIF結(jié)合，而不與CNTF結(jié)合；人與大鼠CNTFRα的氨基酸序列有94%的同源性，屬非跨膜蛋白質(zhì)，其借糖基-磷脂酰肌醇鍵（glycosyl-phos-phatidylinositol lindage,GPI）錨在細胞膜上[4]，但可被細胞膜上的磷脂酶裂解因此CNTFR-α可以結(jié)合形式或可溶形式存在[5]。LIFR-β和gp130存在于細胞膜上，參與JAK/TYK偶聯(lián)，起信號傳遞作用[6]。CNTFGN cNTFR結(jié)合過程可能是：CNTF先與可溶性CNTFR-α結(jié)合，然后再連接LIFR-β和gp130，繼而激活JAK/STAT信號傳遞通路將信號向細胞內(nèi)傳遞。

　　3 CNTF和CNTFR-α基因結(jié)構(gòu)

　�、舎CNTF基因 位于第11號染色體長臂近端，屬單拷貝基因，編碼區(qū)長600 bp，兩個外顯子之前有一個1kb左右的內(nèi)含子，內(nèi)含子位于第38-39個氨基酸之間，轉(zhuǎn)錄起始位于起始密碼子上游5 bp，此處存在可與轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ D結(jié)合的TATA序列，該序列上游91bp存在jun和fos家族二聚體的結(jié)合位點5'-TGAHTCA-3[5，7]；終止子后650 bp處有兩個聚腺苷酸AATAAT序列，這兩個AATAAT系列與保守的AATAAT系列不完全相同，產(chǎn)生編印400核苷酸的3'翻譯區(qū)。人、兔、大鼠CNTF同源性達84%左右，而與NGF的同源性卻很低。

　　⑵CNTFR-α基因 由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，長度至少35 bp，位于染色體的9P13位置，前兩個外顯子和第10個外顯子含5'、3'非翻譯區(qū)，第3個外顯子編碼信號肽，第4個外顯子編碼Ig樣結(jié)構(gòu)域，第5-8個外顯子編碼細胞因子受體樣結(jié)構(gòu)域，第9個外顯子編碼疏水的GPI識別序列。

4 CNTF生物活性

　　4.1 營養(yǎng)神經(jīng)元

　　CNTF的營養(yǎng)作用突出表現(xiàn)在對中樞和周圍運動神經(jīng)元的營養(yǎng)作用，不僅表現(xiàn)在對培養(yǎng)的胚胎運動神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用，而且在體研究亦發(fā)現(xiàn)其影響胚胎運動神經(jīng)元的發(fā)育、分化；神經(jīng)損傷后見到雪旺細胞CNTF呈高水平表達，神經(jīng)軸突逆轉(zhuǎn)運CNTF增加，提示CNTF參與神經(jīng)損傷后的修復、再生[8-10]，損傷后CNTF反應性增高是細胞的保護性反應。此外，CNTF還影響交感神經(jīng)節(jié)、感覺神經(jīng)節(jié)均有CNTFR-α表達，因此被認為是CNTF的靶組織。新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元胞體對軸突損傷反應敏感，容易導致胞體變性、死亡，但生后3周這種易感性明顯減弱，可能與此時雪旺細胞CNTF mRNAT蛋白質(zhì)水平較高有關(guān)；利用同源重組技術(shù)修飾CNTF基因（基因打靶技術(shù)）使其失活，可導致動物先天性運動神經(jīng)元變性、死亡[11]；如果修飾CNTFR-α基因，小鼠則于出生后24h內(nèi)死亡，基段神經(jīng)核細胞脫失56%[12]。據(jù)此，可推測還存在另一未發(fā)現(xiàn)的CNTF，其生物活性大于已發(fā)現(xiàn)的CNTF。

　　4.2 影響非神經(jīng)組織

　　CNTF屬于細胞因子大家族的成員，因此它對非神經(jīng)組織生理、病理過程也有調(diào)節(jié)作用。體外實驗證實，CNTF能夠微弱抑制外周血單核細胞產(chǎn)生IL-8和前列腺素E2，加入CNTFR-α后CNTF的這種抑制作用大大加強[13]。此外，CNTF能抑制胚胎多能干細胞的分化[11]，誘導肝細胞表達急性反應蛋白[14]，皮下注射CNTF可預防失神經(jīng)支配的肌肉發(fā)生萎縮[15，16]。

　　4.3 營養(yǎng)的協(xié)同作用

　　目前所知神經(jīng)營養(yǎng)因子與神經(jīng)元的關(guān)系并非一一對應，一種神經(jīng)營養(yǎng)因子可作用多種神經(jīng)元，一種神經(jīng)元接受多種營養(yǎng)因子的營養(yǎng)、調(diào)節(jié)、而且神經(jīng)營養(yǎng)因子之間存在協(xié)同作用。培養(yǎng)的運動神經(jīng)元基質(zhì)中加入BDNF或CNTF均能使胞內(nèi)CHAT水平升高，聯(lián)合應用更加明顯，進一步研究發(fā)現(xiàn)單獨作用BDNF或CNTF均不能阻止Wobbler突變鼠神經(jīng)肌肉進行性退化，但兩種因子聯(lián)合應用卻能阻止其發(fā)病[7]。

　　5 CNTF的基因表達調(diào)節(jié)

　　5.1 發(fā)育調(diào)節(jié)

　　CNTF表達水平在發(fā)育過程中是不斷變化的,Northern轉(zhuǎn)印分析顯示，新生大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)不能測出CNTF mRNA，須至第4天才能測出，提示CNTF較少參與調(diào)節(jié)圍產(chǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育[3]；至第2周坐骨神經(jīng)內(nèi)CNTF mRNA和蛋白質(zhì)均急劇升高，達原來的30倍[18]。

　　5.2 神經(jīng)元活動調(diào)節(jié)

　　Rory在1993年發(fā)現(xiàn)，感覺、運動神經(jīng)元能以軸突逆轉(zhuǎn)運CNTF至胞體，當神經(jīng)受到損傷時這種逆轉(zhuǎn)運將迅速增多[19]，這一反應可被外源性LIF抑制；因此可推測，CNTF的逆轉(zhuǎn)運由膜受體倡導。神經(jīng)損傷后雪旺細胞提高CNTF地表達，大腦中動脈缺血后缺血腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的CNTF水平明顯升高[20]。故CNTF有損傷保護因子之稱。新生大鼠骨髓運動神經(jīng)元胞體對軸突損傷反應敏感，容易導致胞體變性、死亡，但生后3周這種易感性明顯減弱，可能與此時雪旺細胞CNTF mRNA和蛋白質(zhì)水平較高有關(guān)。

　　6 CNTF的醫(yī)用研究現(xiàn)狀與前景

　　隨著研究不斷深入，已逐步認識到CNTF的醫(yī)用價值，并已開始應用于臨床。CNTF目前主要應用于治療運動神經(jīng)元疾病如肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）。動物實驗研究顯示，CNTF有良好的促運動神經(jīng)元生長作用，對外傷后運動神經(jīng)元胞體的變性、死亡顯示出明顯的預防作用；Sendtner發(fā)現(xiàn)，CNTF能夠提高純合子pmn/pmn小鼠面神經(jīng)運動神經(jīng)核神經(jīng)元數(shù)量和膈神經(jīng)的神經(jīng)軸突數(shù)量[21]。但臨床應用的效果卻并不令人滿意；一組臨床研究顯示，730例ALS病人分3組分別給予CNTF30μg/kg、15μg/kg及安慰劑；每周3次皮下注射，治療9個月，結(jié)果顯示，死亡率、并發(fā)癥和肌肉攣縮在治療組與對照組無明顯差異[22]。另一研究發(fā)現(xiàn)，570例ALS病人經(jīng)0.5、2、5、μg/kg-1·d-1rh·CNTF治療6個月后，不但病情無明顯好轉(zhuǎn)，且副作用明顯，咳嗽、體重下降、死亡率增高，并由此導致治療終止。為了解決上述問題，有人將一微囊（內(nèi)裝有能分泌CNTF的活細胞、其膜為半透膜）植入病變局部，可提高局部CNTF濃度，降低血藥濃度、減輕副作用。

CNTF治療其他CNS疾病的研究較少。目前已知CNTF在CNS大部分區(qū)域的水平均較低，但CNTFR-α水平較高，主要分布在神經(jīng)元。細胞培養(yǎng)顯示，CNTF對基底前腦膽堿能等多種神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，但動物實驗發(fā)現(xiàn)單獨應用CNTF并不能使軸突損傷后的基底前腦膽堿能神經(jīng)元和黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元恢復合成CAT酪氨酸羥化酶[23]。CNTF對腦缺血的影響看法不一。Kumon等[24]在自發(fā)性高血壓大鼠的腦缺血實驗中發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射CNTF能夠緩解腦缺血造成的空間認知障礙，且組織學顯示皮質(zhì)的梗死灶和同側(cè)丘腦神經(jīng)元逆行性變性均有改善；但Ogata[25]等在Wistar大鼠腦缺血術(shù)前1周給予CNTF卻未能有效阻止海馬CAI區(qū)的神經(jīng)元死亡。