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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:附錄四　實(shí)驗(yàn)室常用技術(shù)參數(shù)資料

一、核酸及蛋白質(zhì)常用數(shù)據(jù)1．化合物分子量λmax(pH7.0)1摩爾溶液（pH7.0）中λmax時(shí)的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712．常…

一、核酸及蛋白質(zhì)常用數(shù)據(jù)

1．

化合物分子量λmax(pH7.0)1摩爾溶液（pH7.0)中λmax時(shí)的最大吸收值OD280/OD260
ATP507259154000.15
CTP48327190000.97
GTP523253137000.66
UTP484262100000.38
dATP494259152000.15
dCTP46727193000.98
dGTP507253137000.66
dTTP48226796000.71

2．常用核酸的長度與分子量

核酸核苷酸數(shù)分子量
λDNA48502（雙鏈環(huán)狀)3.0×107
pBR3224363（雙鏈)2.8×106
28SrRNA48001.6×106
23SrRNA37001.2×106
18SrRNA19006.1×105
19SrRNA17005.5×105
5SrRNA1203.6×104
tRNA（大腸桿菌)752.5×104

3．常用核酸蛋白換算數(shù)據(jù)

（1)重量換算

1μg=10-6g　 1pg=10-12g

1ng=10-9g 　1fg=10-15g

（2)分光光度換算：

1A260雙鏈DNA=50μg/ml

1A260單鏈DNA=30μg/ml

1A260單鏈RNA=40μg/ml

（3)DNA摩爾換算：

1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端

1μg pBR322 DNA=0.36pmol

1pmol 1000bp DNA=0.66μg

1pmol pBR322=2.8μg

1kb雙鏈DNA（鈉鹽)=6.6×105道爾頓

1kb單鏈DNA（鈉鹽)=3.3×105道爾頓

1kb單鏈RNA（鈉鹽)=3.4×105道爾頓

（4)蛋白摩爾換算：

100pmol分子量100，000蛋白質(zhì)=10μg

100pmol分子量50，000蛋白質(zhì)=5μg

100pmol分子量10，000蛋白質(zhì)=1μg

氨基酸的平均分子量=126.7道爾頓

（5)蛋白質(zhì)/DNA換算：

1kb DNA=333 個(gè)氨基酸編碼容量=3.7×104MW蛋白質(zhì)

10，000MW蛋白質(zhì)=270bp DNA

30，000MW蛋白質(zhì)=810bp DNA

50，000MW蛋白質(zhì)=1.35kb

100，000MW蛋白質(zhì)=2.7kb DNA

4．常用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物

（1)高分子量標(biāo)準(zhǔn)參照（2)中分子量標(biāo)準(zhǔn)參照（3)低分子量標(biāo)準(zhǔn)參照
肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00
肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500
β-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脫氫酶55，000抑制劑　
磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700馬心肌球蛋白16，900
牛血清白蛋白66，200醛縮酶40，000溶菌酶14，400
過氧化氫酶`57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1)8，100
醛縮酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2)6，200
　　抑制劑　肌球蛋白（F3)2，500
　　溶菌酶14，400　　

5．常用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物

λDNA/HindⅢλDNA/EcoRⅠλ/HindⅢ+EcoRⅠpBR322/HaeⅢ
231302122621227587123
941674215148405104
65575804497350489
43615643426845880
23224843353043464
20273530202726757
564　190423451
125　158421321
　　137519218
　　97418411
　　8311247
　　564　　
　　125　　

續(xù)上表

pBR322/HinfⅠφχ174/HinfⅠφχ174/Hae Ⅲφχ174/TapⅠ
163172614013532914
51771311810781175
506553100872404
39650082603327
34441766310231
29841348281141
2213114227187
2202494023454
1542002419433
75151　11820
　　　72　

二、常用緩沖液

1．分子克隆常用緩沖液

2．磷酸緩沖液

（1)25℃下0.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制※

pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)
5.88.591.5
6.013.286.8
6.219.280.8
6.427.872.2
6.638.161.9
6.849.750.3
7.061.538.5
7.271.728.3
7.480.219.8
7.686.613.4
7.890.89.2
8.094.06.2

（2)25℃下0.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制※

pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)
5.87.992.1
6.012.088.0
6.217.882.2
6.425.574.5
6.635.264.8
6.846.353.7
7.057.742.3
7.268.431.6
7.477.422.6
7.684.515.5
7.889.610.4
8.093.26.8

※:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000ml，根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程計(jì)算其pH值：

pH=pK’+1g([質(zhì)子受體]/[質(zhì)子供體])

在此，pK’=6.86(25℃)。

3．電泳緩沖液

測序凝膠加樣緩沖液

98%去離子甲酰胺

10mol/L EDTA(pH8.0)

0.025%二甲苯青FF

0.025%溴酚藍(lán)

甲酰胺：許多批號的試劑級甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進(jìn)行處理。不過，一旦略呈黃色，則應(yīng)用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時(shí)進(jìn)行去離子處理，并用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70℃。

常用的電泳緩沖液

緩沖液使用液濃貯存液（每升)
Tris-乙酸（TAE)1×：0.04mol/L Tris-乙酸50×：242gTris堿
　0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸
　　100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸（TPE)1×:0.09mol/L Tris-磷酸10×:10gTris堿
　0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml)
　　40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸（TBE)a0.5×0.045mol/L Tris-硼酸5×：54gTris堿
　0.001mol/L EDTA27.5硼酸
　　20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
堿性緩沖液b1×:50mmol/L NaOH1×:5ml 10mol/L NaOH
　1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
Tris-甘氨酸c1×:25mmol/L Tris5×:15.1gTris
　250mmol/L 甘氨酸94g苷氨酸（電泳級)（pH8.3)
　0.1% SDS50ml 10% SDS(電泳級)

說明：

①TBE溶液長時(shí)間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5×溶液，出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。

以片都以1×TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5×的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。

進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1×TBE以提供足夠的緩沖容量。

②堿性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

③Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2×SDS凝膠加樣緩沖液：

100mmol/L Tris·HCl(6.8)

200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT)

4%SDS（電泳級)

0.2%溴酚藍(lán)

20%甘油

不含DTT的2×SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應(yīng)在臨用前取1mol/L貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。

4．凝膠加樣緩沖液

緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度
Ⅰ0.25%溴酚藍(lán)4℃
0.25%二甲苯青FF
40%（W/V)蔗糖水溶液
Ⅱ0.25溴酚藍(lán)室溫
0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll400)
Ⅲ0.25%溴酚藍(lán)4℃
0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液
Ⅳ0.25%溴酚藍(lán)4℃
40%(W/V)蔗糖水溶液
堿性加樣緩沖液:
300mmol/L NaOH
6mmol/L EDTA
Ⅴ18%聚蔗糖(Ficoll400)4℃
0.15%溴甲酚綠
0.25%二甲苯青FF

使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽極泳動(dòng)的染料。溴酚藍(lán)在瓊脂糖中移動(dòng)的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以0.5×TBF作電泳液時(shí)，溴酚藍(lán)在瓊脂糖中的泳動(dòng)速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動(dòng)則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%～1.4%的范圍內(nèi)，這些對應(yīng)關(guān)系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。

選用哪一種加樣染料純屬個(gè)人喜惡。但是，對于堿性凝膠應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因?yàn)樵趬A性pH條件下其顯色較溴酚更藍(lán)為鮮明。

5．各種pH值的Tris緩沖液的配制

各種pH值的Tris緩沖液的配制
所需pH值（25℃)0.1mol/L HCl的體積
7．145．7
7．244．7
7．343．4
7．442．0
7．540．3
7．638．5
7．736．6
7．834．5
7．932．0
8．029．2
8.126.2
8.222.9
8.319.9
8.417.2
8.514.7
8.612.4
8.710.3
8.88.5
8.97.0

某一特定pH值的0.05mol/LTris緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應(yīng)體積（單位：ml)的0.1ml/L HCl混合，加水將體積調(diào)至100ml

（2)溫度對50mmol/LTris·HCl液pH值的影響

4℃25℃37℃
8．17．57．2
8．27．67．3
8．37．77．4
8．47．87．5
8．57．97．6
8．68．07．7
8．78．17．8
8．88．27．9
8．98．38．0
9．08．48．1
9．18．58．2
9．28．68．3
9．38．78．4
9．48．88．5

（6)常用緩沖液的pKa值

緩沖液分子量pKa值緩沖范圍
Trisa12.18.087.1～7.9
HEPESb283.37.477.2～8.2
MPOSc209.37.156.6～7.8
PIPESd304.36.766.2～7.3
MESe195.26.095.4～6.8

a：三羥甲基氨基甲烷；b：N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-嗎啉代)丙磺酸；d：N，N’-雙（2-乙磺酸)哌嗪；e：2-（N-嗎啉代)乙磺酸。

7．溫度對常用緩沖液pH的影響

緩沖體系pKa(20℃)△pKa/10℃
Mes6.15-0.110
Ada6.60-0.110
PiPes6.80-0.085
Aces6.90-0.200
Bes7.15-0.160
Mops7.20-0.013
Tes7.50-0.200
Hepes7.55-0.014
Tricine8.15-0.210
Tris8.30-0.310
Bicine8.35-0.180
Glycylglycine8.40-0.280

三、常用酶的配制

1．溶菌酶

用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20℃。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

2．蛋白水解酶類

　貯存液貯存溫度反應(yīng)濃度反應(yīng)緩沖液溫度預(yù)處理
0.01mol/L Tris(pH7.8)
鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水)1mg/ml0.01mol/L EDTA37℃自消化b
0.5% SDS
0.01mol/L Tris(pH7.8)
蛋白酶Kc20mg/ml-20℃（溶于水)50μg/ml0.005mol/L EDTA37～56℃無須預(yù)處理
0.5% SDS

a：鏈霉蛋白酶是從鏈球菌（Streptomycesgriseus)中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，經(jīng)自消化的鏈酶蛋白酶的配制方法如下：把該酶的粉末溶解于10mmol./lTris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml濃度，于37℃溫育1h。經(jīng)消化的鏈霉蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存-20℃。

c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber)中純化得到。該酶有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶K消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴于Mg2+的核酸酶的作用)。但是，如果要消化對蛋白酶K具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGT（pH8.0)至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。

3．無DNA酶的RNA酶

將胰RNA酶（RNA酶A)溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。

四、常用抗生素溶液

抗生素貯存液a工作濃度
濃度保存條件嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒
氨芐青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml
羧芐青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml
氯霉素34mg/ml(溶于乙醇)-20℃25μg/ml170μg/ml
卡那霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml
鏈霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml
四環(huán)素b5mg/ml(溶于乙醇)-20℃10μg/ml50μg/ml

a：以水為溶劑的抗生素貯存液通過0.22μm濾器過濾除菌。以乙醇為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應(yīng)放于不透光的容器保存。

b：鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應(yīng)使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基)。

五、常用貯存液的配制

1．30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】

將29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45μm孔徑)過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。

【注意】

丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具�？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗�可能會含有少量未聚合材料。

一些價(jià)格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1Mallinckrodt)，攪拌過夜，然后用Whatman 1號濾紙過濾以純化之。

在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。

2．40%丙烯酰胺

【配制方法】

把380g丙烯酰胺（DNA測序級)和20g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補(bǔ)足至終體積為1L。

【注意】

見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測定。

3．放線菌素D溶液

【配制方法】

把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255)純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于-20℃。

【注意】

放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時(shí)必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實(shí)驗(yàn)桌面上進(jìn)行，謹(jǐn)防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。

藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。

4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP)溶液

【配制方法】

在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/L NaOH調(diào)至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小份保存于-70℃

5．10mol/L乙酸酰溶液

【配制方法】

把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。

6．10%過硫酸銨溶液

【配制方法】

把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4℃保存數(shù)周。

7．BCIP溶液

【配制方法】

把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽（BCIP)溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃

8．2×BES緩沖鹽溶液

【配制方法】

用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BES[N，N-雙（2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室溫下用HCl調(diào)節(jié)　該溶液的pH值至6.96、然后加入蒸餾水定容至100ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20℃。

9．1mol/L CaCl2溶液

【配制方法】

在200ml蒸餾水中溶解54gCaCl2·6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20℃。

【注意】

制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取出一小份解凍并用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑)過濾除菌，然后驟冷至0℃。

10．2.5mol/L CaCl2溶液

【配制方法】

在20ml蒸餾水中溶解13.5gCaCl2·6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。

11．1mol/L二硫蘇糖醇（DTT)溶液

【配制方法】

用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2)溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20℃。

【注意】

DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。

12．脫氧核苷三磷酸（dNTP)溶液

【配制方法】

把每一種dNTP溶解于水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris堿分別調(diào)節(jié)　每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH試紙檢測)，把中和后的每種dNTP溶液各取一份作適當(dāng)稀釋，在下表中給出的波長下讀取光密度計(jì)算出每種dNTP的實(shí)際濃度，然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存于-70℃。

堿基波長（nm)消化系數(shù)（ε)[L/（mol·cm)]
A2591.54×104
G2531.37×104
C2719.10×103
T2607.40×103

比色杯光徑為1cm時(shí),吸光度=εM

13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液

【配制方法】

在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O)，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)　溶液的pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒)然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。

【注意】

EDTA二鈉鹽需加入NaOH將溶液的pH值調(diào)至接近8.0，才能完全溶解。

14．溴化乙錠（10mg/ml溶液)

【配制方法】

在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。

【注意】

小心：溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)務(wù)必戴上手套，稱量染料時(shí)要戴面罩。

15．2×HEPES緩沖鹽溶液

【配制方法】

用總量為90ml的蒸餾水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4·2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/lNaOH調(diào)節(jié)　pH值至7.05，再用蒸餾水定容至100ml。用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存于-20℃。

16．IPTG溶液

【配制方法】

IPTG為異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量為238.3)，在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。

17．1mol/L乙酸鎂溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。

18．1mol/L MgCl2溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解203.4gMgCl2·6H2O，用水定容至1L，分裝成小份并高壓滅菌備用。

【注意】

MgCl2極易潮解，應(yīng)選購小瓶（如100g)試劑，啟用新瓶后勿長期存放。

19．β-巰基乙醇（BME)溶液

【配制方法】

一般得到的是14.4mol/L溶液，應(yīng)裝在棕色瓶中保存于4℃。

【注意】

BME或含有BME的溶液不能高壓處理。

20．NBT溶液

【配制方法】

把0.5g氯化氮藍(lán)四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。

21．酚/氯仿溶液

【配制方法】

把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液層，保存于4℃。

【注意】

酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡，穿防護(hù)服。所有操作均應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥中進(jìn)行。與酚接觸過的部位皮膚應(yīng)用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。

22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF)溶液

【配制方法】

用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L)，分裝成小份貯存于-20℃。如有必要可配成濃度高達(dá)17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L)。

【注意】

PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。

PMSF在水溶液中不穩(wěn)定。應(yīng)在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時(shí)，20μmmol/l PMSF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié)　為堿性（pH>8.6)并在室溫放置數(shù)小時(shí)后，可安全地予以丟棄。

23．磷酸鹽緩沖溶液（PBS)溶液

【配制方法】

在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)　溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。

24．1mol/L乙酸鉀（pH7.5)溶液

【配制方法】

將9.82g乙酸鉀溶解于90ml純水中，用2mol/L乙酸調(diào)節(jié)　pH值至7.5后加入純水定容到1L，保存于-20℃。

25．乙酸鉀溶液（用于堿裂解)

【配制方法】

在60ml 5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。

26．3mol/L乙酸鈉（pH5.2和pH7.0)溶液

【配制方法】

在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)　pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)節(jié)　pH值至7.0，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。

27．5mol/L NaCl溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。

28．10%十二烷基硫酸鈉（SDS)溶液

【配制方法】

在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)　溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。

【注意】

SDS的微細(xì)晶粒易擴(kuò)散，因此稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS，10%SDS溶液無須滅菌。

29．20×SSC溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/l NaOH溶液調(diào)節(jié)　pH值至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。

30．20×SSPE溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6g NaH2PO4·H2O和7.4g EDTA，用NaOH溶液調(diào)節(jié)　pH值至7.4（約需6.5ml 10ml/L NaOH)，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。

31．100%三氯乙酸溶液

【配制方法】

在裝有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V)TCA。

32．1mol/L Tris溶液

【配制方法】

在800ml水中溶解121.91gTris堿，加入濃HCl調(diào)節(jié)　pH值至所需值。

pH　HCl

7.4 70ml

7.6 60ml

8.0 42ml

應(yīng)使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。

【注意】

如1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)予丟棄并置備質(zhì)量更好的Tris。

盡管多種類型的電極均不能準(zhǔn)確測量Tris溶液的pH值，但仍可向大多數(shù)廠商購得合適的電極。

Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1℃，pH值大約降低0.03個(gè)單位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃時(shí)的pH值分別為9.5、8.9和8.6。

33．Tris緩沖鹽溶液（TBS)（25mmol/l Tris)

【配制方法】

在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl、0.2g KCl和3g Tris堿，加入0.015g酚并用HCl調(diào)至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，分裝后在151bf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，于室溫保存。

34．X-gal溶液

【配制方法】

X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。

雜交試驗(yàn)中用于降低背景的封閉劑

試劑用途
Denhardt試劑Northern雜交
使用RNA探針的雜交
單拷貝序列的Southern雜交
將DNA固定于尼龍膜上的雜交
Denhardt試劑通常配制50×貯存液，過濾后保存于-20℃�？蓪⒃撡A存液10倍稀釋于預(yù)雜交液（常為含有0.5%SDS和100μg/ml經(jīng)變性被打斷的鮭精DNA的6×SSC或6×SSPE)中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分V”Sigmal)，加水至終體積為500ml。
BLOTTOGrunstein-Hogness雜交
Benton-Davis雜交
除單拷貝序列Southern雜交以外的所有Southern雜交
斑點(diǎn)印跡
1×BLOTT（牛乳轉(zhuǎn)移技術(shù)優(yōu)化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer),是含5%膠脂奶粉和0.02%疊氮鈉的水溶液，應(yīng)保存于4℃。使用前可用預(yù)雜交液稀釋25倍。BLOTTO不應(yīng)與高濃度的SDS并用，因?yàn)楹笳邥䦟?dǎo)致牛奶中蛋白質(zhì)析出。如果雜交背景不合要求，可在雜交液中加入NP-40至終濃度為1%。BLOTTO不能用作Northern雜交的封閉劑，因?yàn)檫@一封閉劑中可能含有RNA酶，其活性之高使人無法接受。
注意：疊氮鈉有毒性，取用時(shí)需戴手套小心操作。含疊氮鈉的溶液應(yīng)予明確標(biāo)記。
肝素Southern雜交
原位雜交
肝素（Sigma H-7005，從豬中提取的二級產(chǎn)品或相當(dāng)?shù)燃壍漠a(chǎn)品)用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的濃度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的雜交液中用作封閉劑的濃度為500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的雜交液中的濃度為50μg/ml。
經(jīng)變性并被打斷的鮭精DNAsouthern和Northern雜交
把鮭魚精子DNA（Sigma,Ⅲ,鹽鈉)溶解于水配制成10mg/ml的濃度，必要時(shí)于室溫磁力攪拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的濃度調(diào)至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17號皮下注射針頭12次，以剪切DNA。加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇沉淀DNA。離心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度，測定溶液的OD260值并計(jì)算出精確的DNA濃度，然后煮沸10min，分裝成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加熱5min，然后迅速在冰浴中驟冷。預(yù)雜交液中應(yīng)含有100μg/ml經(jīng)變性并被打斷的鮭魚精子DNA

六、常用凝膠的技術(shù)參數(shù)

1．葡聚糖凝膠的某些技術(shù)數(shù)據(jù)

種類干顆粒直徑（μ)分子量分級范圍床體積毫升/克干分子篩得水值溶脹最少平衡時(shí)間（h)柱頭壓力（kPa)(2.5cm直徑柱)
肽及球形蛋白質(zhì)葡聚糖（線性分子)室溫沸水浴
Sephadex G-1040～ 120～700～7002～ 31.0±0.131　
Sephadex G-1040～ 120～150015002.5～3.51.5±3.531　
Sephadex G-25　　　　　　　　
粗級100～300
(≈5～100目)		　　　　　　　
中級50～150
(≈100～200目)		1,000～
5,000		100～
5,000		4～61.5±0.262
細(xì)級2www.med126.com0～800(≈200～400目)　　　　　　　
超細(xì)10～40　　　　　　　
Sephadex G-50　　　　　　　　
粗級100～200　　　　　　　
中級50～1501,500～500～　　　　　
細(xì)級20～8030,00010,0009～115.0±0.362
超細(xì)10～40　　　　　　　
Sephadex G-75　　　　　　　　
　40～1203,000～1,000～　　　　　
超細(xì)10～4070,000950,00012～157.5±0.52433.92～15.86
Sephadex G-100　　　　　　　　
　40～1204,000～1,000～　　　　　
超細(xì)10～401,500,000150,00015～2010.0±1.04852.35～9.41
Sephadex G-150　　　　　　　　
　40～1205,000～1,000～20～30　　　　
超細(xì)10～40400,000150,00018～2215.0±1.57250.88～3.53
Sephadex G-200　　　　　　　　
　40～1205000～1000～30～40　　　　
　10～40800,000200,00020～2520.0±2.07250.39～1.57

2.聚丙烯酰胺凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)

型號排阻的下限

(分子量)

分級分離范圍

(分子量)

膨脹后的床體積(ml/g干凝膠)膨脹所需最少時(shí)間(室溫,h)
Bio-gel-P-21,600200～2,0003.82～4
Bio-gel-P-43,600500～4,0005.82～4
Bio-gel-P-64,6001,000～5,0008.82～4
Bio-gel-P-1010,0005,000～17,00012.42～4
Bio-gel-P-3030,00020,000～50,00014.910～12
Bio-gel-P-6060,00030,000～70,00019.010～12
Bio-gel-P-100100,00040,000～100,00019.024
Bio-gel-P-150150,00050,000~150,00024.024
Bio-gel-P-200200,00080,000～200,00034.048
Bio-gel-P-300300,000100～400,00040.048

3．瓊脂糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)

型號瓊脂糖含量
%（W/W)		排阻的下限
（分子量)		分級分離的范圍（分子量)生產(chǎn)廠家
Sepharose 4B4　0.3×106～3×106Pharmacia
Sepharose 2B2　2×106～25×106
Sagavac 10102.5×1051×104～2.5×105Seravac
Sagavac 887×1052.5×104～7×105
Sagavac 662×1065×104～2×106
Sagavac 4415×1062×105～15×106
Sagavac 22150×1065×105～15×107
Bio-gel A-0.5M100.5×106<1×104～0.5×106Bio-Rad
Bio-gel A-1.5M81.5×106<1×104～1.5×106
Bio-gel A-5M65×1061×104～5×106
Bio-gel A-15M415×1064×104～15×106
Bio-gel A-50M250×1061×105～50×106
Bio-gel A-150M1150×1061×106～150×106

4．各處凝膠所允許的最大操作壓

凝膠最大靜水壓（kPa)
Sephadex　
G-109.8
G-159.8
G-259.8
G-509.8
G-754.9

5．瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

凝膠濃度（%)線性DNA長度（bp)
0.51000～30000
0.7800～12000
1.0500～10000
1.2400～7000
1.5200～3000
2.050～2000

6．染料在變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度

凝膠濃度（%)溴酚藍(lán)二甲苯青FF
5．035bp140bp
6．026bp106bp
8．019bp75bp
10．012bp55bp
20．08bp28bp

7．染料在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度

凝膠濃度（%)溴酚藍(lán)二甲苯青FF
3.5100bp460bp
5.065bp260bp
8.045bp160bp
12.020bp70bp
15.015bp50bp
20.012bp45bp

七、氨基酸的特性

氨基酸名稱三字母縮寫單字母縮寫質(zhì)量側(cè)鏈電離的pHa值結(jié)構(gòu)式
丙氨酸（alanine)AlaA89.09　

精氨酸（arginine)ArgR174.212.48

天冬酰氨（asparagine)AsnN132.1　

天冬氨酸（aspartic acid)AspD133.13.86

半胱氨酸（systeine)CysC121.12　

谷氨酰胺（glutamine)GlnQ146.15　

谷氨酸（glutamic acid)GluE147.134.25

甘氨酸（glycine)GlyG75.07　

組氨酸（histidine)HisH155.166.0

異亮氨酸（isoleucine)lleI131.17　

亮氨酸（leucine)LeuL131.17　

賴氨酸（lycine)LysK146.19　

甲硫氨酸（methionine)MetM149.21　

苯丙氨酸（phenylanaline)PheP165.19　

脯氨酸（proline)ProP115.13　

絲氨酸（serine)SerS105.06　

蘇氨酸(threonine)ThrT119.12　

色氨酸（tryptophan)TrpW204.22　
酪氨酸（tyrosine)TyrY181.1910.07

纈氨酸（valine)ValP117.15　

八、遺傳密碼

密碼子的第二位

密碼子的第一位（5’端)　UCAG　密碼子的第三位（3端’)
UUUUPheUCUSerUAUTyrUGUGysU
UUCPheUCCSerUACTyrUGGGysC
UUALeuUCASerUAA終止（赭石)UGA終止（乳白)A
UUGLeuUGGSerUAG終止（琥珀)UGGTrpG
CCUULeuCCUProCAUHisCGAArgU
CUCLeuCCCProCACHisCGCArgC
CUALeuCCAProCAAGlnCGAArgA
CUGLeuCCGProCAGGlnCGCArgG
AAUUIleACUThrAAUAsnAGUSerU
AUCIleACCThrAACAsnAGCSerC
AUAIleACAThrAAALysAGAArgA
AUGMetACGThrAAGLysAGCArgG
GGUUValGCUAlaGAUAspGGUGlyU
GUCValGCCAlaGACAspGGCGlyC
GUAValGCAAlaGAAGluGGAGlyA
GUGValGCGAlaGAGGluGGGGlyG

九、常用酸堿技術(shù)參數(shù)

1．

溶質(zhì)分子式分子量mol/Lg/L重量（%)比重配制mol/L溶液的加入量（ml/L)
冰乙酸CH3COOH60.0517.40104599.51.05057.5
乙酸　60.056.27376361.045159.5
甲酸HCOOH46.0223.401080901.20042.7
鹽酸HCl36.5011.60424361.18086.2
　　　2.90105101.050344.8
硝酸HNO363.0215.991008711.42062.5
　　　14.90938671.40067.1
　　　13.30837611.37075.2
高氯酸HclO3100.5011.651172701.67085.8
　　　9.20923601.540108.7
磷酸H2PO480.0018.101445851.70055.2
硫酸H2P｀O498.1018.001776961.84055.6
氫氧化銨NH4OH35.0014.80251280.89867.6
氫氧化鉀KOH56.1013.50757501.52074.1
　　　1.94109101.090515.5
氫氧化鈉NaOH40.0019.10763501.53052.4
　　　2.75111101.110363.4

2．各種濃度的酸堿貯存液的近似pH值

溶質(zhì)1Na0.1Na0.01Na0.001Na
乙酸0.402.903.403.90
鹽酸0.101.072.023.01
硫酸0.301.202.10　
檸檬酸　2.102.60m.gydjdsj.org.cn/yishi/　
氫氧化銨11.8011.3010.8010.30
氫氧化鈉14.0513.0712.1211.13
碳酸氫鈉　8.40　　
碳酸鈉　11.5011.00　

J a.N為光量濃度[1N≈（1mol/L)×離子價(jià)數(shù)]。

十、放射性核素?cái)?shù)據(jù)

1．放射性核素衰變表

3H35S32P125I131I
時(shí)間(年)剩余活性(%)時(shí)間(年)剩余活性(%)時(shí)間(年)剩余活性(%)時(shí)間(年)剩余活性(%)時(shí)間(年)剩余活性(%)
194.5298.4195.3495.50.298.3
289.3596.1290.8891.20.496.6
384.41092.3386.51287.10.695.0
479.81588.7482.51683.11.091.8
575.42085.3578.52079.41.687.2
671.32582.0674.82475.82.381.2
767.43178.1771.22872.43.176.7
863.73774.5867.83269.14.071.0
960.24371.0964.73666.05.065.2
1056.95067.01061.24063.06.159.3
1153.85763.61158.74460.27.353.4
1250.96559.61255.94857.48.150.0
12.350.07356.01353.25254.8　　
　　8152.51450.75652.4　　
　　87.150.014.350.06050.0　　

2.放射性測定單位

單位定義換算
吸收放射線劑量（拉得rad)100爾格/克（電離輻射傳給單位質(zhì)量物質(zhì)的能量)0.87rad=1r
倫琴（r)使1克空氣產(chǎn)生1.6×1012離子對的X或γ-射線的照射劑量r/0.87=1rad
居里（Ci)每秒放射性衰變3.7×1010個(gè)原子的量1Ci=103mCi=106μCi
毫居（mCi)千分之一居里1mCi=10-3Ci=103μCi
微居（μCi)百萬分之一居里（每分鐘衰變2.2×106次)1μCi=10-6Ci=10-3MCi
伯克萊爾（Bq)每秒衰變1個(gè)原子的量1Bq=3.7×10-10Ci
千伯克萊爾（kBq)　1kBq=103Bq
百萬伯克萊爾（MBq)　1MBq=106Bq
兆伯克萊爾（GBq)　1GBq=109Bq
每分鐘衰變數(shù)（dpm)每分鐘衰變的原子數(shù)2.2×106dpm=1μCi
每分鐘計(jì)數(shù)（cpm)測量儀測出每分鐘β粒子數(shù)Cpm=dpm×計(jì)數(shù)器效率

十一、原子量

符號原子序數(shù)原子量
錒（actinium)Ac89227.02
鋁（aluminium)Al1326.98
镅（americium)Am95(243)
銻（antimony)Sb51121.75
氬（argon)Ar1839.94
砷（arsenic)As3374.92
砹（astatine)At85(210)
鋇（barium)Ba56137.33
锫（berkelium)Bk97(247)
鈹（beryllium)Be49.01
鉍（bismuth)Bi83208.98
硼（boron)B510.81
溴（bromine)Br3579.90
鎘（cadmium)Cd48112.41
鈣（calcium)Ca2040.08
锎（californium)Cf98(251)
碳（carbon)C612.01
鈰（cerium)Ce58140.12
銫（cesium)Cs55132.90
氯（chlorine)Cl1735.45
鉻（chromium)Cr2451.99
鈷（cobalt)Co2758.93
銅（copper)Cu2963.54
鋦（curium)Cm96(247)
鏑（dysprosium)Dy66162.50
锿（einsteinium)Es99(252)
鉺（erbium)Er68167.26
銪（euroqium)Eu63151.96
鐨（fermium)Fm100(257)
氟（fluorine)F918.99
鈁（francium)Fr87(223)
釓（gadolinium)Gd64157.52
鎵（galium)Ga3169.72
鍺（germanium)Ge3272.59
金（gold)Au79196.96
鉿（hafnium)Hf72178.49
氦（helium)He24.00
鈥（holmium)Ho67164.93
氫（hydrogen)H11.00
銦（indium)In49114.82
碘（iodine)I53126.90
銥（iridium)Ir77192.22
鐵（iron)Fe2655.84
氪（krypton)Kr3683.80
鑭（lanthanum)La57139.90
鐒（Lawrencium)Lr103(260)
鉛（lead)Pb82207.2
鋰（lithium)Li36.94
镥（lutetium)Lu71174.96
鎂（Magnesium)Mg1224.30
錳（manganse)Mn2554.93
鍆（mendelevium)Md101(258)
汞（molybdenum)Hg80200.59
鉬（molybdenum)Mo4295.94
釹（neodymium)Nd60144.24
氖（neon)Ne1020.17
镎（neptunium)Np93237.04
鎳（nickel)Ni2858.69
鈮（niobium)Nb4192.00
氮（nitrogen)N714.00
锘（nobelium)No102(259)
鋨（osmium)Os76190.2
氧（oxygen)O815.99
鈀（palladium)Pd46106.42
磷（phosphorus)P1530.94
鉑（platium)Pt78195.08
钚（piutonium)Pu94(244)
釙（polonium)Po84(209)
鉀（potassium)K1939.09
鐠（praseodymium)Pr59140.90
鉅（promethium)Pm61(145)
鏷（protactinium)Pa91231.03
鐳（radium)Ra88226.02
氡（radon)Rn86(222)
錸（rhenium)Re75186.20
銠（rhodium)Rh45102.90
銣（rubidium)Rb3785.46
釕（ruthenium)Ru44101.07
釤（samarium)Sm62150.36
鈧（scandium)Sc2144.95
硒（sillicon)Se3478.96
硅（sillicon)Si1428.08
銀（sliver)Ag47107.86
鈉（sodium)Na1122.98
鍶（strontium)Sr3887.62
硫（sulfur)S1632.06
鉭（tantalum)Ta73180.94
锝（technetium)Tc43(98)
碲（tellurium)Te52127.60
鋱（terbium)Tb65158.92
鉈（thallium)Tl81204.38
釷（thorium)Th90232.03
錫（tin)Sn50118.69
銩（thulium)Tm69168.93
鈦（titanium)Ti2247.88
鎢（tungsten)W74183.85
unhilhexium(Unh)106(263)
unnilpentium(Unp)105(262)
unnilquadium(Unq)104(261)
unnilseptium(Uns)107(262)
鈾（uranium)U92238.02
釩（vanadium)V2350.94
氙（xenon)Xe54131.29
鎰（ytterbium)Yb70173.04
釔（yttrium)Y3988.90
鋅（zinc)Zn3065.38
鋯（zirconium)Zn4091.22

圓括號中的數(shù)字是該元素最穩(wěn)定的同位素的質(zhì)量數(shù)。

（吳康)

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