脫落細胞檢驗醫(yī)生除要熟練掌握細胞形態(tài)學特點外，還必須掌握各項操作和染色技術及觀察方法，所以脫落細胞學檢查技術是重要的學習內(nèi)容之一。它包括標本采集、制片、固定和染色、鏡下觀察方法及診斷要領等。
正確地采集標本是細胞學診斷的基礎和關鍵之一，故要準確地選擇部位，盡可能在病變區(qū)直接采集細胞。采集的標本必須保持新鮮，盡快制得，以免細胞自溶或腐敗。盡可能避免血液、粘液等混入標本內(nèi)，采集方法應簡便，操作輕柔，避免病人痛苦和引起嚴重并發(fā)癥及促進腫瘤擴散，下面介紿幾種常用的標本采集方法。
（一)直視采集法
外陰、陰道、陰道穹窿、宮頸、口www.med126.com腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼結(jié)膜及皮膚等部位，可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直腸、氣管和肺內(nèi)支氣管則使用纖維內(nèi)鏡在病灶處直接刷取細胞制片。
（二)自然分泌液的采集法
1．痰液涂片檢查：痰興高采烈為支氣管等呼吸的分泌物，對支氣管肺癌和其它呼吸道疾病細胞學診斷具有重要價值。
2．尿液涂片檢查：收集尿液中脫落的泌尿道細胞成分，作泌尿道腫瘤和某些疾病的細胞學診斷。
3．乳頭溢涂片檢查：用于導管內(nèi)乳頭狀瘤和乳腺癌細胞學檢查。
4．前列腺液涂片檢查：采用前列腺按摩法取得分泌物，作前列腺細胞學診斷。
（三)灌洗洗
向空腔器官或腹腔、盆腔（剖腹探查時)灌注一定量生理鹽水沖洗，使其細胞成分脫落于液體中，收集灌洗液離心制片，作細胞學檢查。
（四)磨擦法
利用磨擦工具在病變部位磨擦，將擦取物直接涂片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、線網(wǎng)套、氣囊等。可分別用于鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。
（五)針穿抽吸法
當有胸腔、腹腔、心包腔及關節(jié)腔積液時，可用針穿抽吸部分積液作細胞學檢查。此外某些深部組織器官，如淋巴結(jié)、甲狀腺、軟組織、肝等亦可作細針穿刺吸取部分細胞進行涂片診斷。
（一)涂片前準備工作及涂片方法
1．涂片前準備工作
（1)保證標本新鮮，取材后盡快制片。
（2)涂操作要輕巧，避免擠壓以防止損傷細胞。涂片要均勻，厚薄要適度，太厚細胞堆疊，太薄細胞過少，均影響診斷。
（3)玻片要清潔無油漬，先用硫酸洗滌液浸泡沖洗，再用75%乙酸浸泡。
（4)含蛋白質(zhì)的標本可直接涂片，缺乏蛋白質(zhì)的標本，涂片前先在玻片上涂薄層粘附劑，以防止染色時細胞脫落，常用粘附劑為蛋白甘油，由等量生雞蛋白和甘油混合而成。
（5)每位患者的標本至少涂兩張玻片，以避免漏診。涂片后立即在玻片一端標上編號。
2．涂片制備方法
（1)推片法：用于稀薄的標本，如血液，胸、腹水等。取離心后標本一小滴滴在玻片偏右側(cè)端，用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。
（2)涂抹法：適用于稍稠的檢液，如鼻咽部標本。用竹棉簽在玻片上涂布，由玻片中心經(jīng)順時針方向外轉(zhuǎn)圈yin抹；或從玻片一端開始平行涂抹，涂抹要均勻，不宜重復。
（3)壓拉涂片法：將標本夾于橫豎交叉的兩張玻片之間，然后移動兩張玻片，使之重疊，再邊壓邊拉，獲得兩張涂片。該法適用于較粘稠標本，如痰液。
（4)吸管推片法：用吸和將標本滴在玻片一端，然后將滴管前端平行置于標本滴上，平行向另一端均速移動滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用于胸、腹水標本。
（5)噴射法：用配細針頭的注射器將標本從左至右反復均勻地噴射在玻片上，此法適用于各種吸取的液體標本。
（6)印片法：將切取的病變組織用手術切開，立即將切面平放在玻片上，輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。
（二)涂片的固定
固定（fication)的目的是保持細胞自然形態(tài)，防止細胞自溶和細菌所致的腐敗；固定液能沉淀和凝固細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和破下細胞內(nèi)溶酶體酶，使細胞不但保持自然形態(tài)，而且結(jié)構清晰，易于著色。因此標本愈新鮮，固定愈及時，細胞結(jié)構愈清晰，染色效果愈好。
1．固定液：細胞學檢查常用的固定液有下列三種：第一種乙醚酒清固定液：該固定液滲透明性較強，固定效果好適用于于一般細胞學常規(guī)染色；二種是氯仿酒精固定液：又稱卡諾氏固定液。其優(yōu)點同上；第三種95%酒精固定液：適用于大規(guī)模防癌普查。制備簡單。但滲透作用稍差。
2．固定方法
（1)帶濕固定：涂片后未待標本干燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細胞結(jié)構清楚，染色新鮮。適用于巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網(wǎng)涂片等常任常用此方法。
（2)干燥因定：涂片后未待其自然干燥，再行固定。適用于稀薄標本如尿液、胃沖洗液等，也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。
3．固定時間：一般為15-30min。含粘液較多標本，如痰液、陰道分泌物、食管拉網(wǎng)等因定時間在適當延長；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定時間可酌情縮短。
（三)涂片的染色
1．染色的目的和原理：染色的日的是借助于一種或多種染料，使組織和細胞內(nèi)結(jié)構分別著不同的染色，這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細胞內(nèi)部結(jié)構，作出正確判斷。
組織細胞染色原理至今尚無滿意的解釋，可能是物理作用，也可能是化學作用，或者是兩者綜合作用的結(jié) 果。
染色的物理作用是利用毛細管現(xiàn)象，滲透、吸收和吸附作用，使染料的色素顆粒牢固地進入組織細胞，并使其顯色。
染色的化學作用是滲入組織細胞的染料與其相應的物質(zhì)起化學反應，產(chǎn)生有色的化合物。
各染料都具有兩種性質(zhì)，即產(chǎn)生顏色；征收被組織形成親和力。這兩種性質(zhì)主要由發(fā)色基因和助色基因所產(chǎn)生的。
發(fā)色基團：苯的衍生物具有可見光區(qū)吸收帶。這些衍生物顯不的吸收帶與其價鍵的不穩(wěn)定性有關，如對苯二酚為無色，當其氧化后失去兩個氫原子，它的分子或則變?yōu)橛悬S色的對醌，這種產(chǎn)生顏色的醌式環(huán)稱為發(fā)色基團。若一種化合物含有幾個環(huán)，只要其中有一個醌式環(huán)就會發(fā)出顏色，稱此發(fā)色基團為色原（chromogen).
助色基團：是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團（酸堿性基團)。它能使染色的色澤進一步加深，并使其與被染色組織具有親和力。
助色基團的性質(zhì)決定染料是酸性堿性。堿性染料具有堿性助色基團，在溶媒中產(chǎn)生的帶色部分為帶正電荷的陽離子，吻與組織細胞內(nèi)帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合而顯色。如細胞核內(nèi)的主要化學成分脫氧化核糖核酸易被蘇木素染成紫藍色，稱嗜堿性。酸性染料具有酸性用力色基團，在溶酶中產(chǎn)生帶色部分為陰離子，易與組織細胞內(nèi)帶正電荷部分結(jié)合而顯色，此性質(zhì)被稱為嗜酸性，如細胞漿內(nèi)訂成分為蛋白質(zhì)，易與伊紅或橘黃結(jié)合呈紅色或橘黃色。
2．常用染色方法：臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種：
（1)巴氏染色法：本法染色特點是細胞具有多色性顏色，色彩鮮艷多彩。涂片染色的透明性好，胞質(zhì)顆粒分明，胞核結(jié)構清晰，如鱗狀上皮過度角化細胞胞質(zhì)呈橘黃色；角化細胞顯粉紅色；而角化前細胞顯淺綠色或淺藍色，適用于上皮細胞染色或觀察陰道涂片中激素水平對上皮細胞的影響。此方法的缺點是染色程序比較復雜。
（2)蘇木精—伊紅（hemotoxylin eosin,HE)染色法：該方法染色透明度好，核與胞質(zhì)對比鮮明。染色步驟簡便，效果穩(wěn)定。適用于痰液涂片，觖質(zhì)核呈紫藍色，胞質(zhì)淡玫瑰紅色，紅細胞呈淡朱紅色。
（3)瑞特—吉姆薩染色法（wrightgiemsa atain)；本方法多用于血液，骨髓細胞學檢查。胞質(zhì)內(nèi)顆粒與核安危質(zhì)結(jié)構顯示較清晰。操作簡便。
為提高診斷率和防止造成差錯，檢查涂片前必須嚴格核對涂片編號，了解送檢單上填寫的全部資料；閱片要全面、認真、細心觀察。
因涂片中細胞成分分布極為分散，所以顯微鏡觀察時必須按順序視全張涂片，用推進器從左至右。自上而下移動，仔細觀察每一個視野，歸后將蓋片邊緣亦做仔細檢查，經(jīng)防止漏診（圖20-1)。
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圖20-1 觀察切片的移動法
A錯誤的玻片移動法
B正確的玻片移動法
涂片細胞學檢查十分重視低倍觀察，先宏觀涂片中各種細胞成分，發(fā)現(xiàn)異常細胞時，再轉(zhuǎn)換高倍視野，仔細觀察細胞結(jié)構，明確性質(zhì)，做出正確診斷。
（一)細胞學診斷的書寫方式
細胞學檢查癌細胞的診斷方式分為直接法和分級法。
1．直接法：根據(jù)細胞學檢查結(jié)果，直接寫出關于疾病的診斷如痰抹片檢查結(jié)果為“倆支氣管鱗癌”。
2．分級法：將涂片中細胞學檢查發(fā)現(xiàn)的細胞變化，用分級方式表示。它的優(yōu)點是能真實地反映細胞學所見。較這客觀。目前有三級、四級、和五級三種分類方法。五級分類法過于繁瑣，實際應用中較難掌握。因此國內(nèi)仍常用三級或四級分類法，該兩種分類法較為簡單明確，易于掌握，能夠更準確地反映涂片的本質(zhì)。
（1)三級分類法：將細胞學檢查結(jié)果分為陰性，可疑和陽性三級。
Ⅰ級：陰性：無核異質(zhì)細胞，涂片中均為正常細胞或一般退變細胞。
Ⅱ級：可疑。涂片中發(fā)現(xiàn)核異質(zhì)細胞，但不能肯定的是腫瘤細胞，應重復送檢。
Ⅲ級：陽性。涂片中發(fā)現(xiàn)典型癌細胞，有時根據(jù)癌細胞形態(tài)特征及分布，初步進行分類。
（2)四級分類法：將細胞學檢查結(jié)果分為陰性、核異質(zhì)，可疑和陽性四級。
Ⅰ級：陰性。
Ⅱ級：核異質(zhì)。涂片中發(fā)現(xiàn)少量核異質(zhì)細胞，由高度炎癥增生所www.med126.com致。
Ⅲ級：可疑。涂片中見重度核異質(zhì)細胞，其形態(tài)基本符合惡性腫瘤細胞標準，但數(shù)量過少，還不能完全排除癌前期病變或高度炎癥墳生的可能，建議臨床重復送檢。
Ⅳ級：陽性。
（3)五級分類法
Ⅰ級：無核異質(zhì)細胞。
Ⅱ級：少量輕度核異質(zhì)細胞，但無惡性證據(jù)。
Ⅲ級：有較多重度核異質(zhì)細胞，但不能肯定為惡性。
Ⅳ級：有大量重度核異質(zhì)細胞，但仍缺乏典型惡性腫瘤細胞的證據(jù)。
Ⅴ級：發(fā)現(xiàn)典型惡性腫瘤細胞，根據(jù)其細胞形態(tài)，作出初步的分類。
（二)提高細胞學診斷的要領
1．熟練掌握病理學：脫落細胞來自組織，所以是病變組織的部分反映，具有踏實的病理學基礎，才能對千變?nèi)f化的脫落細胞形態(tài)作出正確的判斷。
2．多思考、多比較：涂片中細胞成分，背景成分以及細胞變性程度等每例各不相同，閱片時要分析思考和比較，最好用涂片中某一背景成他，如淋巴細胞或紅細胞作標本。
3．密切結(jié)合臨床：多與臨床醫(yī)生聯(lián)系，了解臨床癥狀，化驗及影像診斷結(jié)果，避免盲目性。
4。認識脫落細胞學的局限性：無充分證據(jù)，寧可保存守一點。未肯定的報告對臨床亦有參考價值。
5．了解各種染色的特性和優(yōu)缺點因不同染色方法，細胞表現(xiàn)差別很大。
（三)細胞學診斷的誤診原因
細胞學診斷誤診造成臨床診斷的錯誤，以致影響對患者疾病的診斷治療。誤診形式有假陽性和假陰性兩種。前者是在非腫瘤患者涂片中找到所謂的癌細胞；后者是在腫瘤患者涂片內(nèi)未找到癌細胞。
細胞學檢查從取材到最后診斷，任何一個步驟處理不當，均可產(chǎn)生誤診。引起的誤診原因有以下幾種：
1．標本取材不當：未取到真有癌細胞部分，如痰液制片時未仔細選擇有效病理成分；或患者咳痰方式不對，未采集到支氣管深部分泌物等。
2．標本不新鮮：細胞學檢查標本必須在采集后1-2小時內(nèi)涂片，立即固定，以防止細胞自溶。
3．編號錯誤：會發(fā)生誤診嘏造成醫(yī)療事故。故送檢標本、申請單、涂片、報告單編號后應仔細核對，避免出現(xiàn)差錯。
4．細胞污染：涂片在固定和染色過程中，不斷有細胞脫落于試劑中，這些細胞有可能粘附在其它患者涂片上而造成誤診，故要經(jīng)常過濾或現(xiàn)換試劑。
5．觀察不仔細或方法不正確而發(fā)生的漏誤。
6．腫瘤細胞分化好，與正常細胞不易區(qū)別。
7．經(jīng)放療或化療后，正常上皮細胞受射線作用，有明顯的形態(tài)學改變，吻誤診為癌細胞。
