天熱藥物化學-電子教材:第一章

第一章  總   論

本章目的要求

1. 了解天然藥物化學的含義和研究內容

2. 了解天然藥物化學研究的意義及其在藥學專業(yè)中地位

3. 掌握天然藥物化學成分提取分離的原理及方法

4. 了解天然藥物化學成分結構研究的主要程序及采用的方法

第一節(jié) 緒論   introduction

一、 天然藥物化學的的含義和研究內容

天然藥物化學  Natural  Medicine Chemistry or Chemistry ofNatural Medicines

中 藥 化 學  Chemistry of Chinese  Traditional  Medicines

植 物 化 學  phytochemistry

天然產(chǎn)物化學  Chemistry of Natural products or Naturalproduct Chemistry

1．天然藥物化學的概念―――是一門運用現(xiàn)代化科學理論與方法研究天然藥物中化學成分的一門學科。

天然藥物包括：植物藥、動物藥、礦物藥、海洋藥物，其中以植物藥為主，是藥物地個重要組成部分。

2．有效成分與無效成分的概念

化學成分----分為有效成分和無效成分。

有效成分-----具有顯著的生物活性，有一定的物理常數(shù)，能用分子式和結構式表示彈體化合物。多為二次代謝產(chǎn)物如生物堿、苷類、黃酮類、強心苷等

無效成分-----無生物活性其他成分。淀粉、蛋白質、樹脂、無機鹽等。

二者的關系是相對的（對某一活性指標而言，如麻黃平喘止咳作用的成分是麻黃堿，淀粉、樹脂、揮發(fā)油視為無效成分)而和互變的（多糖多為無效成分，現(xiàn)代研究許多多糖具有活性，如香菇多糖具有抗腫瘤作用)。

3．研究內容――包括各類天然產(chǎn)物的化學成分（主要是生理活性成分和藥效成分)的結構類型，物理化學性質、提取分離方法，以及主要類型化學成分的鑒定和生物合成途徑等。

二、研究目的與任務

（1)為合理采集、妥善貯藏天然藥物提供科學依據(jù)。

（2)為天然藥物的合理炮制提供現(xiàn)代科學根據(jù)。

（3)為天然藥物真?zhèn)舞b別，質量控制提供客觀依據(jù)。

（4)為擴大藥物資源，開發(fā)新藥體提供有效途徑。

（5)為探索中藥治療疾病的原理創(chuàng)造有效條件。

三、天然藥物化學國內外研究概況

1769年瑞典化學家舍勒從酒石分離出酒石酸。 苯甲酸(1775)、乳酸(1785)、沒食子酸(1786)等有機酸類物質。

明代李延的《醫(yī)學入門》（1575)中記載了用發(fā)酵法從五倍子中得到?jīng)]食子酸的過程。書中謂“五倍子粗粉，并礬、曲和勻，如作酒曲樣，入瓷器遮不見風，侯生白取出�！�

   從藥用動植物中提取活性成分則始于19世紀。第一個被提取的成分是嗎啡堿（一種異喹啉生物堿)，于1806年由法國化學家F·澤爾蒂納自鴉片中提取。此后的數(shù)十年間發(fā)掘了大量民間藥中的活性成分，1820年從金雞納樹皮中分離奎寧(quinine)；1826 年從血液中分離氯化血紅素(hemin)；1828 年從煙草中分離煙堿(nicotine)；1832 年從人參中分離胡蘿卜素(carotene )；1885 年從麻黃中分離麻黃堿(ephedrine)；1901 年獲得結晶性腎上腺素(a-drenaline)；1910 年發(fā)現(xiàn)維生素B1(oryzanin)，1928年發(fā)現(xiàn)青霉素(penicillin)等。吐根堿(emetine) 、士的寧( strychnine) 、秋水仙堿(colchicine) 、小檗堿(berberine) 、阿托品(at ropine) 、可卡因(cocaine)等生物堿也是在19 世紀發(fā)現(xiàn)的。

20 世紀是天然藥物化學迅速發(fā)展和“藥味”濃郁的時期,以色譜技術用于天然化合物的分離、純化,譜學技術滲透到結構鑒定和生物活性試驗普遍開展為特點。

20世紀50年代先后自印度蘿芙木中獲得降壓活性成分利血平（reserping)，以及從降血糖藥長春花中獲得抗癌活性成分長春堿，成為兩個很有價值的藥物，引起了各方的重視。

   1960年左右開始了對海洋天然產(chǎn)物的研究。

20世紀80年代以來，由于分子生物技術的迅猛發(fā)展，為有效成分的提取和功能研究提供了新方法。

 參考文獻

1.《現(xiàn)代中草藥成分化學》吳壽金, 中國醫(yī)藥科技出版社2001

2.《中草藥有效成分提取與分離》徐任生,上海科技出版社  

3.《中草藥成分化學》林啟壽，科學出版社1977

4.《中藥化學》-同步輔導系列叢書高幼衡,科學出版社 2005

5.《中藥成分有效成分提取分離技術》盧艷花，化學工業(yè)出版社 2005

6.《天然產(chǎn)物化學》徐任生，科技出版社1997

7.《有機化合物波譜解析》姚新生,中國醫(yī)藥科技出版社,2001

8. 《植物藥有效成分手冊》江紀武 , 人民衛(wèi)生出版社，1986

9.《黃酮類化合物鑒定手冊》中國科學院上海藥物研究所植化室編譯. 科學出版社，1981

10.《質譜學在天然有機化學中的應用》叢浦珠.科學出版社,1987

11.《分析化學手冊  第七分冊 核磁共振波譜分析》 于德泉,楊峻山主編，化學工業(yè)出版社, 1999

第二節(jié)   生物合成 biosynthesis

植物體內的物質代謝過程與生物合成，

一、一次代謝與二次代謝的概念，

對維護植物生命活動來說是不可缺少的過程，且?guī)缀醮嬖谟谒�有綠色植物中，稱為一次代謝過程。

并非在所有的植物中都能發(fā)生，對對維護植物生命活動來說不起重要作用，稱為二次代謝過程。

二、一次代謝產(chǎn)物及二次代謝產(chǎn)物

糖、蛋白質、脂質、核酸等對維護植物生命活動來說是不可缺少的物質，一些代謝過程作為原料或前體的物質如乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、莽草酸及一些氨基酸等為一次代謝產(chǎn)物（primary metabolites)。

生物堿、萜類、甾類、黃酮類等為二次代謝產(chǎn)物（secondary metabolites)

三、主要的生物合成途徑

1.醋酸-丙二酸途徑（acetate-melinate  pathway，AA-AM途徑)――生成脂肪酸、酚類、蒽酮類

2.甲戊二羥酸途徑（ mevalonic acid pathway，MVA途徑)――生成萜類和甾體

3.桂皮酸（Cinnamiv Acid Pathway)及莽草酸途徑（Shikinmic Acid Pathway)――具有C₆-C₃和C₆-C₃-C₆骨架的化合物如苯丙素類（phenylpropanoids)、香豆素類（coumarins)、木質素類（lignins)、木脂體類（lignans)和黃酮類（flavonoids)

4氨基酸途徑（Amino Acid Pathway)――生成生物堿。

5.復合途徑   常見種類

（1)醋酸-丙二酸－莽草酸途徑

（2)醋酸-丙二酸－甲戊二羥酸途徑

（3)氨基酸－甲戊二羥酸途徑

（4)氨基酸－醋酸-丙二酸途徑

（5)氨基酸－莽草酸途徑

總結

概念：天然藥物化學、有效成分、無效成份、一次代謝產(chǎn)物、二次代謝產(chǎn)物

天然藥物化學包括內容

學習天然藥物化學的意義

天然藥物化學成分主要的生物合成途徑，各途徑主要合成什么成分

思考題：

1.解釋名詞

天然藥物化學；一次代謝產(chǎn)物；

有效成分； 一次代謝過程；

無效成分； 二次代謝產(chǎn)物；

二次代謝過程；

2.回答問題

1)天然藥物化學研究的主要內容。

2)學習天然藥物化學的目的意義。

3)酚類和蒽酮類、萜類和甾體 、香豆素類和黃酮類 、生物堿等分別經(jīng)何生物途徑衍生而來 。

第三節(jié) 提取分離方法Methods of extraction and isolation

一、中草藥有效成分的提取

（一)提取方法：

常見的提取方法有：溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、升華法。其中，溶劑提取法應用最廣。

1．溶劑提取法

（1)常用溶劑的特點：

環(huán)己烷，石油醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇

  極性：小 ————大

  親脂性：大 ———— 小 

 親水性：小 ———— 大 

①比水重的有機溶劑：氯仿

②與水可以以任意比例混溶的有機溶劑：丙酮、乙醇、甲醇

③常用來從水中萃取苷類、水溶性生物堿類成分的有機溶劑：正丁醇

④溶解范圍最廣的有機溶劑：乙醇

 （2)溶劑提取法的原理：根據(jù)相似者相溶原理，選擇與化合物極性相當?shù)娜軇�將化合物從植物組織中溶解出來，同時，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其極性與溶劑極性相差較大的化合物也可溶解出來。

  各種溶劑提取的范圍

 石油醚或汽油－油脂、臘、葉綠素、揮發(fā)油、游離甾體、三萜類化合物。

 氯仿或乙酸乙酯――游離生物堿、有機酸、黃酮、香豆素的苷元等中等性化合物。

丙酮或乙醇、甲醇――苷類、生物堿鹽、鞣質等極性化合物。

水――氨基酸、糖類、無機鹽等水溶性成分。

（3)溶劑提取法方法

溶劑提取法一般包括浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等，其使用范圍及特點見下表。

2．水蒸氣蒸餾法：適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸汽蒸餾而不被破壞、難溶或不溶于水的成分的提取，如揮發(fā)油、小分子的香豆素類、小分子的醌類成分。 

3．升華法：固體物質受熱不經(jīng)過熔融，直接變成蒸汽，遇冷后又凝固為固體化合物，稱為升華。中草藥中有一些成分具有升華的性質，可以利用升華法直接自中草藥中提取出來。如樟腦、咖啡因。

二、中草藥有效成分的分離與精制

（一)根據(jù)物質溶解度差別進行分離

1．結晶及重結晶法

利用不同溫度可引起物質溶解度的改變的性質以分離物質。將不是結晶狀態(tài)的固體物質處理成結晶狀態(tài)的操作稱結晶；將不純的結晶進一步精制成較純的結晶的過程稱重結晶。

（1)溶劑選擇的一般原則：

不反應；冷時對所需要的成分溶解度較小，而熱時溶解度較大；對雜質溶解度很大或很��；沸點低，易揮發(fā)；無毒或毒性小。

（2) 結晶純度的判定：

結晶形態(tài)和色澤：單一化合物的結晶具有結晶形狀均一和均勻的色澤。

熔點和熔距：單一化合物具有一定的熔點和較小的熔距，結晶前后的熔點應一致，熔距很窄，在1℃~2℃的范圍內。但要注意雙熔點，如漢防己乙素、芫花素及一些與糖結合的苷類化合物。

色譜法：單一化合物在薄層色譜或紙色譜層析中經(jīng)三種不同的溶劑系統(tǒng)展開，均為一個斑點者。

2．溶劑分離法（溶劑沉淀法)

在中草藥提取液中加入另一種溶劑以改變混合物溶劑的極性，使一部分物質沉淀析出，從而實現(xiàn)分離。如：水—醇法除多糖、蛋白質等水溶性雜質；醇—水法除樹脂、葉綠素等水不溶性雜質；醇—醚法或醇—丙酮法使苷類成分，而脂溶性樹脂等雜質則存留在母液中。

3酸提堿沉法，堿提酸沉法

酸性、堿性或兩性有機化合物來說，通常通過加入酸、堿以調節(jié)溶液的pH，以改變分子的存在狀態(tài)（游離型或解離型)，從而改變溶解度而實現(xiàn)分離。生物堿-酸提堿沉法，黃酮、蒽醌類－堿提酸沉法，蛋白質－等電點

 4．金屬鹽沉淀法：酸性或堿性化合物還可通過加入某種沉淀試劑使之生成水不溶性的鹽類沉淀等析出。如加入鉛鹽、雷氏銨鹽等。

（二)根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離。

1．兩相溶劑萃取法

（1)原理：利用混合物中各成分在兩相互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離。

①分配系數(shù)K值（即分配比)：溶質在兩相溶劑中的分配比（K)在一定溫度及壓力下為一常數(shù)

②分離難易與分離因子b：分離因子b可以表示分離的難易。分離因子b可定義為A、B兩種溶質在同一溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的比值。一般情況下，b≥100，僅作一次簡單萃取就可實現(xiàn)基本分離；但100≥b≥10時，則需萃取10~12次；b≤2時，要實現(xiàn)基本分離，需作100次以上萃取才能完成。b≌1時，則K_A≌K_B，意味著兩者性質及其相似，即使作任意次分配也無法實現(xiàn)分離。

  ③分配比與pH：對酸性、堿性及兩性化合物來說，分配比還受溶劑系統(tǒng)的影響。因為pH的變化可以改變它們的存在狀態(tài)（游離型或解離型)，從而影響在溶劑系統(tǒng)中的分配比。

 一般pH<3時，酸性物質多呈非解離狀態(tài)（HA)、堿性物質則呈解離狀態(tài)（BH⁺)存在；但pH>12，則酸性物質多呈解離狀態(tài)（A^—)、堿性物質則呈非解離狀態(tài)（B)存在。據(jù)此，可采用在不同pH的緩沖溶液與有機溶劑中進行分配的方法，使酸性、堿性、中性及兩性物質的以分離。

（2)各種萃取方法：

① 簡單萃�。豪�用分液漏斗進行兩相溶劑萃取。

②逆流連續(xù)萃取法：是一種連續(xù)的兩相溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多根的萃取管。

③逆流分配法（CCD)：又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，與兩相溶劑逆流萃取法原理一致，對于分離具有非常相似性質的混合物效果較好。

④液滴逆流分配法（DCCC)：本法必須選用能生成液滴的溶劑系統(tǒng)，且對高分子化合物的分離效果較差，處理樣品量小，并要有一定的設備，操作較繁瑣。

一般b>50時，簡單萃取即可分離，b<50時，則易采用逆流分溶法。

2．紙色譜（PPC)：紙色譜的原理與液—液萃取法基本相同。

原理：分配原理

支持劑：纖維素

固定相：水

流動相：水飽和的有機溶劑

Rf值：化合物極性越小，Rf值越大；反之，化合物極性越大，Rf值越小。

應用：用作微量分析，特別適合于親水性較強的成分，其層析效果往往比吸附薄層色譜效果好。但紙層析一般需要較長的時間。

3．液—液分配柱色譜：

原理：分配原理

支持劑：硅膠、硅藻土、纖維素粉等

正相分配色譜：固定相：水、緩沖溶液

流動相：固定相飽和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱極性有機溶劑

洗脫順序：化合物極性越小，越先出柱；反之化合物極性越大，越后出柱。

應用：通常用于分離水溶性或極性較大的成分，如生物堿、苷類、糖類、有機酸等化合物。

反相分配色譜： 固定相：石蠟油、化學鍵合固定相

流動相：固定相飽和的水或甲醇等強極性有機溶劑

洗脫順序：化合物極性越大，越先出柱；反之化合物極性越小，越后出柱。

應用：適合于分離脂溶性化合物，如高級脂肪酸、油脂、游離甾體等。

4．液—液分配薄層色譜法：

液—液分配色譜法也可在硅膠薄層色譜上進行。

因此，液—液分配柱色譜的最佳分離條件可以根據(jù)相應的薄層色譜結果（正相柱用正相薄層色譜，反相柱用反相薄層色譜)進行選定。

5．化學鍵合固定相：

常用反相硅膠薄層色譜及柱色譜的填料是普通硅膠經(jīng)下列方式進行化學修飾，鍵合上長度不同的烴基（R)、形成親油表面而成。其中以硅烷化鍵合型最為常用，其根據(jù)烴基（R)長度（—C₂H₅、—C₈H₁₇、—C₁₈H₃₇、)分別命名為：RP—2、RP—8、RP—18。

6．加壓相色譜法：

加壓相色譜法又分為：快速柱色譜（約2.02´10⁵Pa)，Lobar低壓柱色譜（<5.05´10⁵Pa)，中壓柱色譜（5.05~20.2´10⁵Pa)，分析用HPLC，制備用HPLC（>20.2´10⁵Pa)。

固定相：RP—2、RP—8或RP—18

流動相：水—甲醇或水—乙腈

洗脫順序：化合物極性越大，越先出柱；反之，化合物極性越小，越后出柱。

應用：通常用于分離水溶性或極性較大的成分，如苷類、酚性化合物等。

（三)根據(jù)物質的吸附性差別進行分離

其中以固—液吸附用的最多，并有物理吸附（硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進行的吸附色譜)、化學吸附（黃酮等酚酸性物質被氧化鋁吸附、生物堿被酸性硅膠吸附等)及半化學吸附（聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附，吸附力較弱，介于物理吸附與化學吸附之間)之分。

1．物質的吸附規(guī)律：

（1) 相似者易于吸附

（2)三要素：被分離的物質與吸附劑、洗脫劑共同構成吸附層析的，

常用的極性吸附劑：硅膠、氧化鋁。硅膠顯微酸性，適于分離酸性和中性化合物，分離生物堿時需在流動相中加入適量的有機堿；氧化鋁呈堿性，適于分離生物堿等堿性成分，不宜用于分離有機酸、酚性等酸性成分。均為極性吸附劑，故有以下特點：

①被分離物質極性越強，吸附力越強。強極性溶質將優(yōu)先被吸附。

②溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質的吸附能力越強。隨溶劑極性的增強，則吸附劑對溶質的吸附力將減弱。

③當加入極性較強的溶劑后，先前被硅膠或氧化鋁所吸附的溶質可被置換而洗脫出來。

常用的非極性吸附劑：活性炭。對非極性物質具有較強的親和力，在水中對溶質表現(xiàn)出強的吸附能力。從活性炭上洗脫被吸附的物質時，溶劑的極性越小，洗脫能力越強。

2．極性及其強弱判斷：

（1)一般化合物的極性按下列官能團的順序增強：

—CH₂—CH₂—，—CH₂=CH₂—，—OCH₃，—COOR，>C=O，—CHO，—NH₂，—OH，—COOH

（2)溶劑的極性可大體根據(jù)介電常數(shù)的大小來判斷。介電常數(shù)越大，則極性越大。一般溶劑的介電常數(shù)按下列順序增大：

  環(huán)己烷（1.88)，苯（2.29)，無水乙醚（4.47)，氯仿（5.20)，乙酸乙酯（6.11)，乙醇（26.0)，甲醇（31.2)，水（81.0)

3．吸附柱色譜法用于物質的分離的特點：

（1)以硅膠或氧化鋁為吸附劑進行柱色譜分離時：吸附劑的用量一般為試樣量的30～60倍。

（2)一般以TLC展開時使組分Rf值達到0.2~0.3的溶劑系統(tǒng)作為最佳溶劑系統(tǒng)進行洗脫。實踐中多用混合的有機溶劑系統(tǒng)。

（3)為避免化學吸附，酸性物質宜用硅膠、堿性物質宜用氧化鋁作為吸附劑進行分離。

4．聚酰胺吸附色譜法：

（1)原理：氫鍵吸附。

 一般認為系通過分子中的酰胺羰基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的游離胺基與醌類、脂肪酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。吸附強弱取決于各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。

（2)吸附能力的強弱

通�；�合物在水溶劑中大致有以下規(guī)律：

①形成氫鍵的基團數(shù)目越多，則能力越強。

②成鍵位置對吸附能力也有影響。易形成分子內氫鍵者，其在聚酰胺上的吸

附響應減弱。

③分子中芳香化程度高這，則吸附性增強；反之，則減弱。

一般情況下，各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力由弱致強的大致順序如下：

水—甲醇—乙醇—氫氧化鈉水溶液—甲酰胺—二甲基甲酰胺—尿素水溶液

其中，最常應用的洗脫系統(tǒng)是：乙醇—水

（3)應用：

①特別適合于酚類、黃酮類化合物的制備和分離。

②脫鞣質處理

③ 對生物堿、萜類、甾類、糖類、氨基酸等其他極性與非極性化合物的分離也有著廣泛的用途。

5．大孔吸附樹脂：通常分為極性和非極性兩類。

（1)原理：吸附性和分子篩性相結合。吸附性是由范德華引力或氫鍵引起的。分子篩是由于其本身多孔性結構產(chǎn)生的。

（2)影響因素：

①一般非極性化合物在水中易被非極性樹脂吸附，極性化合物在水中易被極性樹脂吸附。糖是極性水溶性化合物，與D型非極性樹脂吸附作用很弱。

②物質在溶劑中的溶解度大，樹脂對此物質的吸附力就小，反之就大。

（3)應用：廣泛應用于化合物的分離與富集工作中。如：苷類與 糖類的 分離，生物堿的精制，多糖、黃酮、三萜類化合物的分離等。

（4)洗脫液的選擇：洗脫液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。最常用的是乙醇—水。

（四)根據(jù)物質分子大小進行分離

1．凝膠過濾法：

（1)原理：分子篩原理。即利用凝膠的三維網(wǎng)狀結構的分子篩的過濾作用將化合物按分子量大小不同進行分離。

（2)出柱順序：按分子由大到小順序先后流出并得到分離。

（3)常用的溶劑：

 ①堿性水溶液（0.1mol/L NH₄OH)含鹽水溶液（0.5mol/L NaCl等)

②醇及含水醇，如甲醇、甲醇—水

③其他溶劑：如含水丙酮，甲醇-氯仿

（4)凝膠的種類與性質：種類很多，常用的有以下兩種：

① Sephadex-G：只適用于水中應用，且不同規(guī)格適合分離不同分子量的物質。

②Sephadex LH-20：為Sephadex G-25經(jīng)羥丙基化后得到的產(chǎn)物，具有以下兩個特點：具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質；在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常常起到反相分配色譜的作用，適合于不同類型有機物的分離。應用最廣。

2．膜過濾法：

 （1)概念：膜過濾法是一種用天然或人工合成的膜，以外界能量或化學位差為推動力，對雙組分或多組分的溶質和溶劑進行分離、分級、提純或富集的方法。

 （2)分類：膜過濾技術主要包括滲透、反滲透、超濾、電滲析、液膜技術等。

3．透析法：

透析法是膜過濾法中的一種。

（1)原理：透析法是利用小分子物質在溶液中可通過半透膜、而大分子物質不能透過半透膜的性質，以達到分離的目的，本質上是一種分子篩作用。

（2)應用：對于生物大分子，一般可以通過透析法進行濃縮和精制。如藥用酶的精制。

分離和純化皂苷、蛋白質、多肽、多糖等大分子物質，可將其留在半透膜內，而將如無機鹽、單糖、雙糖等小分子的物質透過半透膜，進入膜外的溶液中，而加以分離精制。應用：

（五)根據(jù)物質解離程度不同進行分離

具有酸性、堿性、兩性基團的化合物在水中多呈解離狀態(tài)，據(jù)此可用離子交換法進行分離。

原理：離子交換原理

固定相：離子交換樹脂

流動相：水或含水溶劑

洗脫液：強酸性陽離子交換樹脂（H型)——稀氨水洗脫

  強堿性陰離子交換樹脂（OH型)——稀氫氧化鈉洗脫

1．分類：根據(jù)交換基團不同分為：

①陽離子交換樹脂： 強酸性（—SO3^-H⁺)

弱減性（—COO^-H⁺)

②陰離子交換樹脂： 強堿性[—N⁺（CH₃)₃Cl]

  弱減性（—NH2及仲胺、叔胺基)

 2．應用：

①用于不同電荷離子的分離，如水提取物中的酸性、堿性、兩性化合物的分離。

②用于相同電荷離子的分離，如同為生物堿,但堿性強弱不同，仍可用離子交換樹脂分離。   

2．應用：揮發(fā)油、一些液體生物堿的提取分離常采用分餾法。

思考題：

1中藥有效成分提取的方法及特點

2.常用溶劑的種類、特點及提取范圍

3.按照原理不同分離的方法有哪些？

4.正相色譜和反相色譜有何異同

5.硅膠、氧化鋁、聚酰胺、葡聚糖凝膠、大孔吸附樹脂、離子交換和紙層等色譜分離化合物的原理、影響因素、適用范圍。

6.按照分配比不同分離的方法有哪些？

7.解釋名詞：分配系數(shù)、CCD、DCCC、HSCCC、Sephadex LH-20、Sephadex G

第四節(jié)  結構研究法  determination  of structure

一、化合物的純度測定

純度檢查的方法：①均勻一致的晶形 ②明確、敏銳的熔點，熔距窄1～2度 ③色譜方法－TLC或PC（三種)呈現(xiàn)單一斑點。④HPLC或GC為單一吸收峰。

二、結構研究的主要程序  見講義

三、結構研究中采用的主要方法

（一)分子式的確定

1.元素定量分析+分子量測定

例：某化合物測定值：  C 79.35％  H 10.21％  計算O  100-79.35-10.21＝10.44％

   三元素所占比例  原子比

   C＝79.35÷12.01＝6.61＝10.16 10

   H＝10.21÷1.008＝10.31   ÷0.65   ＝15.58 16   即C₁₀H₁₆O

   O＝10.44÷16. 00＝0.65  ＝1 1 

   分子式 為 （C₁₀H₁₆O)n   分子量為456 則該化合物的分子式為456÷152＝3

（C₁₀H₁₆O)₃

2.同位素峰度比法

原理：已知組成有機化合物的主要元素（F、P、I除外)均由相對峰度比一定的同位素所組成，且重元素一般比輕元素重1～2個質量單位。故重元素組成的分子也較由輕元素組成的正常分子重1～2個質量單位。在大多數(shù)有機化合物的MS圖上，如人見到穩(wěn)定的分子離子峰〔M+〕時，則在高出其1～2個質荷比（m/z)處還可同時見到〔M+1〕及〔M+2〕兩個同位素峰。對一定的化合物來說其[M]、[M+1]及[M+2]峰的相對強度應為一定值(含Cl、Br時除外)。

例  某有機未知物，由質譜給出的同位素峰度比如下：

  m/z  ①相對豐度

150〔M〕  100

151〔M+1〕  9.9

152〔M+2〕   0.9

②計算C、H、O的數(shù)目  M為偶數(shù)  說明不含氮

nc＝   ＝＝ 9

no  ＝  ＝  ＝2.1

n_H  ＝M-(12 nc+16 no )＝150-（12×9+16×2)＝10

該化合物分子式為C9H10O2  

亦可查Beynon表，根據(jù)〔M+1〕％和〔M+2〕％數(shù)據(jù)查表可直接得到分子式。

   同位素峰度比法因為樣品用量少，故對分子量在500以下、又能生成穩(wěn)定分子離子的化合物來說仍不失為一種值得優(yōu)先選用的方法。

3.  高分辨質譜（HI-MS)法

HI-MS測得的分子離子峰可精確到小數(shù)點第3位，可直接通過查表得到分子式。

4.  計算分子的不飽和度（Index of unsaturation)

u＝Ⅳ -  +  +1 

（二)波譜分析在結構鑒定中的意義――確定化合物的功能基和平面結構

1. 紫外-可見吸收光譜

【意義】  對于分子中含有共軛雙鍵、α，β不飽和羰基結構的化合物以及芳香化合物的結構鑒定來說是一種重要的手段。通常主要用于判斷化合物的骨架類型，在某種情況下如黃酮，香豆素類化合物，可用于測定化合物的精細結構。

【原理】  紫外吸收光譜是記錄有機分子吸收紫外光后產(chǎn)生價電子能級躍遷（由基態(tài)――激發(fā)態(tài))而形成的吸收光譜。由于化合物不同，所含價電子類型不同，故產(chǎn)生電子躍遷類型也不同，反應出紫外吸收峰的位置和強度也不同。

【躍遷形式】

δ δ* 躍遷   C-H 由于δ鍵 的電子云在鍵軸方向相互重疊，鍵結合激發(fā)所需能量大，在遠紫外區(qū)10～200nm 。如甲烷   λ125nm

π   π^*躍遷  C＝C π鍵的電子云在鍵軸方向相互側面重疊，重疊程度畢前者小，易激發(fā)，在200nm左右。π-π共軛在200-700nm處，孤立雙鍵在200-245nm。

  n  π* 躍遷  C＝O，C＝N等。N電子（雜原子未成鍵的電子)比成鍵電子受核束縛小，一般活動大，更易激發(fā)，在近紫外區(qū)，200-700nm，logε�。é�，10～100)。

 n δ*  躍遷  n－H，N－H，S－H等（雜原子上未共用的n電子躍遷到δ*軌道上，形成n δ*  躍遷)所需能量與π   π*接近，200nm，本身不能吸收大于200nm的光波，但與法色團相連可使吸收峰向長波移動。

【應用】（1)強度樣品是否為某已知化合物：鍵樣品與標準品的紫外光譜進行對照，若兩個化合物相同，其紫外光譜應完全相同。

（2)強度未知不飽和化合物的結構骨架：――判斷類型

  黃酮   UVλnm  248，312（強)

二氫黃酮   UVλnm   276，300（弱)

甲型強心苷  UVλnm  217～220nm

乙型強心苷  UVλnm  295～300nm

  （3)異構體的判斷：反式（trans)異構體的λmax和εmax較相應的順式（cis)異構體為大（立體障礙影響)。酮式和烯醇式。

 2．紅外光譜（IR infrared spectra)

   【定義】由分子震動－轉動（分子中價鍵的伸縮及彎曲震動)能級躍遷引起的光譜稱為紅外光譜（4000-625cm^-1)

   【意義】IR是化合物分子結構的客觀反映，如未知物與已知物的IR完全一樣，即可確定為此化合物。未知物可根據(jù)各種基團的（振動頻率)吸收峰的位移（波長)和吸收峰位置移動的規(guī)律，推測分子中的功能基、化合物類型、結構異構，區(qū)別芳環(huán)的取代圖式及構型、構象。

【主要功能基IR 的特征】

  OH  游離  3650～3500  銳、弱、尖

  締合 3400～3200 鈍、寬

  C=O  1800～1600cm^-1

  酮  1715

  醛  1725

  酯  1735

例如

苯環(huán)  1600-1500 cm^-1

  3．質譜（MSmass spectram)

【定義】 質譜是把化合物分子用一定反式裂解后生成的各種離子，按其質量大小排列而成的圖譜。以離子的質荷比（m/z)為序。

【種類】  EI-MS 電子轟擊 electron impact ionization

 CI-MS 化學電離  chemical   ionization

 FI-MS  場致電離  field ionization

 FD-MS   場解析電離  field  desorption  ionization

FAB-MS  快速原子轟擊  fast  atom  bomdardment

  【用途】  （1) 測定分子量，確定分子式

  （2)通過碎片離子的m/z推測結構或復核分子的部分結構

【主要離子】

1.分子離子峰〔M⁺〕分子失去一個價電子形成的正離子，分子離子的質荷比數(shù)值三就是該分子的分子量。

2.碎片離子

α-開裂   帶正電荷的官能團與相連的α-C原子之間的開裂

β-開裂 帶正電荷的官能團的α位和β位的兩個碳原子之間的開裂。

有時又稱α-裂解   即化合物若含有雜原子的C-X或C=X的官能團，與官能團相連的鍵為α鍵，很易裂解稱α-裂解。

如 生物堿

  β－裂解（亦稱麥氏重排)

  當化合物分子中含有C=X基團（X多為 O,S,N,C)，并且與這個基團相連的鏈上具有γ-氫原子時，這個γ-氫原子可以轉移到X原子上，同時β－鍵發(fā)生裂解。

 執(zhí)業(yè)醫(yī)師

  中性碎片  游離正離子

如強心甙

 烯丙裂解

  在具有雙鍵的烯鏈中，常發(fā)生烯丙裂解，即在雙鍵的β鍵處進行裂解，生成離子叫做烯丙離子（異裂)。

芐基裂解

芳香環(huán)側鏈β－鍵是活性鍵，易裂解，產(chǎn)物為芐基離子，也可擴環(huán)成卓蓊離子。

RDA裂解   Retro-Diels Alder reaction（eleavage)

具有對己烯結構類型的化合物可發(fā)生RDA裂解，形成一個共軛二烯游離正離子和一個烯烴中性碎片。

例如     

FD-MS   可是分子量高達1500-2000的非揮發(fā)性化合物離子化，但重現(xiàn)性差，需較多的實驗技術。有時可加微量的帶陽離子的K⁺、Na⁺等堿金屬化合物測試樣品，因此會產(chǎn)生陽離子復合物（M⁺Na⁺),從而產(chǎn)生明顯的帶金屬離子的分子離子峰和離子碎片峰。此法可適于糖甙、氨基酸、肽蛋白質等。甙可依次脫去糖的碎片。此法提供甙元的信息有時較少。

FAB-MS  與FD-MS相比除了給出分子量和糖碎片的信息，在低質區(qū)還給出了甙元的結構碎片，彌補了FD-MS的不足。

4．核磁共振譜（NMR  Nuclear magnetic resonancespectrum)

NMR是具有磁矩的原子核（¹H ，¹³C等)在磁場的作用下以射頻進行照射，產(chǎn)生能級的躍遷而獲得的共振信號。

¹H-NMR給出的信息：

① H質子的類型及其化學環(huán)境、H 的數(shù)目、位置、及相鄰原子的情況。

②H的分布

③ 相鄰H的關系

缺點：不能給出不含氫基團如C=O、-CN等信號。如含碳較多的化合物，如甾體的化學環(huán)境相近的¹H-NMR不能鑒別。

參數(shù)：化學位移（chemical shift δ) (parts per mollion)

被測定各質子的共軛頻率與參比質子（TMS)的相對距離叫化學位移，用δ表示，ppm(parts per mollion)為單位。

質子的化學位移是由于受到誘導效應、共軛效應、各向異性效應、氫鍵以及質子的快速交換等因素綜合影響的結果，而這些影響因素又和質子相連的基團有關。因此可以利用質子的化學位移值來推斷分子的結構。

δ的影響因素：

①電子效應引起屏蔽和去屏蔽作用

氫核附近有電負性較大的原子或基團時，氫核的電子云密度降低，抗磁屏蔽減弱，產(chǎn)生順（去)磁屏蔽效應，δ值增加，即向低場移。

R-CH₃ ：1.0左右  R-O-CH₃ ：3-4ppm

②各向異性效應

化學鍵（主要為π鍵)電子流動引起，可為正屏或去屏蔽效應（δ大)

 苯環(huán)上處為正屏蔽  δ6.0—9.5   脂肪族0—5

醛氫處：δ9—10 烯H ：δ4.5—7  炔H：δ1.8—3.0

③氫鍵締合可產(chǎn)生去屏蔽效應，締合程度越大，位移距離越大，在濃溶液形成氫鍵。

  醇   0.5—5.5

OH   酚 會計資格;  4.8—8.0  鄰位有C=O為10—12.0

  烯醇 15.0—19.0   分子內氫鍵

  酸   10.0—13.0

（OH處苯環(huán)和C=O的正屏蔽區(qū)與C=O氫鍵)

  脂肪胺  0.3—2.2

NH   芳香胺  2.6—5.0

  酰胺 5.0—8.5

分子內存在酸性氫核因其化學位移的不穩(wěn)定認識起來比較困難，通常在樣品中加入重水（D₂O)，使酸性氫核通過下列反應與D₂O交換，而使其信號得以消失（快速交換)。

2)偶合常數(shù)（coupling constant J):有機化合物中各類質子由于所處化學環(huán)境和磁環(huán)境不同，當磁核之間發(fā)生自旋偶合作用，質子的共振峰要發(fā)生裂分現(xiàn)象，分別形成一組多元峰。多元峰的譜線之間有一定的間隔距離成為偶合常數(shù)，用J表示，單位是Hz。

影響因素:

①核間距離：間隔的鍵數(shù)。增多， J減少。

：J=10—16（偕偶)   ：J=5—9 Hz （鄰偶)    ：J=0—3Hz（遠程偶合)

：7—9Hz. ：2—3Hz  ：0—1Hz  

②與兩面角有關   ³J=4.2-0.5cosф+4.5×cos²ф

Jae  =2—6Hz  Jaa=8—13Hz Jee=2—8Hz

60º   0—7Hz 180º  60º 0—5Hz

③信號的裂分

 n+1規(guī)律. S（singlet)、d（doudlet)、t（riplet)、q（multiplet)等

④峰面積：確定每個峰相當H的數(shù)目。

 根據(jù)積分曲線的高度與分子中的總H數(shù)，推測每個信號相當?shù)腍 數(shù)。

 2.74（H  dd J =2.9、17Hz)

  3.19（1H  dd J =12.9、17Hz)

  5.46（1H  dd  J =2.9、12.9Hz)

  5.95（1H  d J =2.2Hz)

  5.96（1H  d J =2.2Hz)

  6.90（2H  d J =8.4Hz)

7.40（2H  d J =8.4Hz)

¹³C-NMR

較¹H-NMR靈敏度高，δ1—250ppm，重疊少、分辨率高、易識別可給出C的化學環(huán)境、類型，依靠δ、J、裂分、解析圖譜推測結構。

主要類型c核的化學位移值。

   脂肪C 伯   CH3 q   10—30

仲  -CH2 t   15—35

叔  -CH  d   25—60

季    s   30—40

   烯C C=C110—150

   芳C  120—150

   C=O—CHO 200—220

  180—195

  C—OH 45—90

δ的影響因素：

① 鍵的雜化類型

SP³碳化最高場（單鍵  δ7—57)

SP 碳化其次  （三鍵  δ65—92)

SP²碳化最低場（雙鍵  δ105—145) 

如  CH₃—CH₃ ：δ5.7   CH₂=CH₂ ：δ123.3  ：δ71.9

② 碳核上電子的多少

缺電子碳上由于電子云密度低，去屏蔽效應，在低場。

如C=O最低（δ~ 200ppm)

③ 誘導效應

靠近電負性取代基、雜原子或烷基的碳原子的化學位移向低場移動，移動的多少隨相隔的鍵數(shù)增多而減弱。

 δ伯C<δ仲C<δ叔C<δ季C

CH₃—CH₃  

5.7  15.9  24.3 27.4

④ 共軛效應

共軛的π鍵碳原子的δ與孤立的不同，共軛后向高場移。

⑤ 分子內氫鍵作用

C=O與鄰位的OH形成分子內氫鍵后，使δ向低場移。

此外還有立體效應、取代基位移（CH₃取代、甙化位移等) 對化學位移的影響。

它的信號裂分和偶合常數(shù)

C—C的幾率較少，主要為C—H的偶合，如CH₃(q)、CH(d)、(s)

例

四、立體結構

園二色譜CD   二維NMR C—HCOSY

旋光譜ORD 2D—NMR H—HCOSY

X—衍射等

小結：

1.化合物的純度測定方法

2.結構研究的主要程序

3.分子式確定的方法

4.UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR在結構測定中的意義及作用

5.解釋名詞:¹H-¹HCOSY、NMQC、HMBC、NOE效應、 DETP