醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)-授課講稿:第九章

第九章 新技術(shù)在醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)中的應(yīng)用　

第一節(jié) 蜱螨細(xì)胞的體外培養(yǎng)

一、蜱細(xì)胞的培養(yǎng)

（一)材料的選擇

實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)可獲得大量健康、無病的蜱群。此外，應(yīng)考慮下列因素：①處于發(fā)育階段的蜱組織，其細(xì)胞處于有絲分裂階段。②所選的蜱組織能提供大量細(xì)胞，并保證一定的接種密度。③選擇初培養(yǎng)時(shí)不需要過繁操作的蜱組織。

目前常用于初培養(yǎng)的蜱組織包括：蛻皮前飽血若蟲體內(nèi)正在發(fā)育的成蟲組織、蟲卵和飽血雌蟲的血淋巴。

（二)蜱表面滅菌

先將蜱放入0.5%家用漂白粉中浸泡，用蒸餾水沖洗數(shù)次，再在1:10的若考（Roccal)液中換洗2次，時(shí)間20min；再用70%乙醇洗1次；用滅菌蒸餾水洗2次。

（三)蜱組織的摘出及碎解

取已消毒好的若蟲，用昆蟲針固定于蠟層，置于滅菌的平皿內(nèi)，用剪刀沿背緣剪開并去掉背板，用解剖針和鑷子取出卵巢、輸卵管及其體壁內(nèi)膜，放在另一裝滅菌生理鹽水的平皿內(nèi)，洗滌2次，再移入盛有培養(yǎng)液的小平皿中，吸出培養(yǎng)液，將聚在一起的蜱組織用滅菌PBS洗2次，加入一定量0.25%胰酶威爾遜液，將蜱組織剪碎，消化20~30 min，1500rpm離心10 min，棄上清，沉淀用PBS再洗一次同法離心，將沉淀用預(yù)先配好的應(yīng)用液吹打混勻后，按1ml量分裝于容積為5ml的小方瓶內(nèi)，培養(yǎng)于28℃溫箱內(nèi)。

若用蜱卵進(jìn)行初培養(yǎng)要比發(fā)育的成蟲簡便且快速。具體方法是：用鑷子將消毒好的蜱卵在不銹鋼沙網(wǎng)上碾碎，使細(xì)胞出來。所得混合物包括胚胎細(xì)胞、卵黃和卵殼的碎片。將上述混合物以1 500rpm離心10min，所得沉淀物明顯分兩層，上層呈奶油色，主要由胚胎細(xì)胞組成，下層呈深褐色，主要由卵殼組成。用吸管吸出上層混勻于營養(yǎng)液中，則得到含卵殼碎片很少的細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行培養(yǎng)。

（四)培養(yǎng)基

Leibovits（1963)設(shè)計(jì)的L-15培養(yǎng)基適用于各種蜱組織培養(yǎng)。若進(jìn)行封閉培養(yǎng)，配好應(yīng)用液后要加NaHCO₃。使用前還應(yīng)添加滅活胎牛血清、胰蛋白磷酸鹽肉湯、水解乳蛋白、酵母浸膏及青霉素、鏈霉素等，培養(yǎng)基的pH值6.5~7，常用6.8。

（五)初培養(yǎng)接種細(xì)胞的量

對(duì)初培養(yǎng)來說，接種蜱細(xì)胞量的比例按蜱材料數(shù)量來計(jì)算。接種細(xì)胞密度必須要大。接種細(xì)胞數(shù)量可依據(jù)形成細(xì)胞單層所需要的時(shí)間來判定。初培養(yǎng)后4周內(nèi)形成單層，其接種數(shù)量較適宜。通常用雷登氏管接種1ml懸液；選用容積為5ml的小方瓶常接種1~2ml懸液。培養(yǎng)瓶容積與培養(yǎng)基容積之比為5:1~10:1為佳。

（六)換液及傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞開始貼壁到完全貼壁這段時(shí)間內(nèi)，該培養(yǎng)瓶應(yīng)盡量減少移動(dòng)。

2、應(yīng)在6~10d換培養(yǎng)液1次，換液時(shí)倒去一半舊液并以同容積的新液取代。

3、為縮短初培養(yǎng)的時(shí)限，應(yīng)增加接種物的量，或者換用效果更好的培養(yǎng)基。

4、若細(xì)胞層致密不均勻，則可將其重新懸浮，并讓其重新貼附于同一培養(yǎng)瓶內(nèi)。

二、螨細(xì)胞的培養(yǎng)

目前常用于細(xì)胞培養(yǎng)的螨類主要是革螨及恙螨。

（一)細(xì)胞來源

革螨細(xì)胞：將野外捕獲的革螨置于28℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，以發(fā)育為幼蟲和若蟲作為細(xì)胞培養(yǎng)材料。

恙螨細(xì)胞：將從鼠體自行爬下的飽食恙螨幼蟲入飼養(yǎng)管于28℃生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。以飼養(yǎng)出的若蟲、成蟲、卵、子代幼蟲作為螨細(xì)胞培養(yǎng)材料。

（二)方法

1、螨體消毒

將革螨、恙螨的幼蟲、若蟲置于70%乙醇消毒10min，棄去乙醇后，置含有效氯1%的次氯酸鈉溶液作用2min，水洗后再用含0.05%氯化高汞的70%乙醇溶液消毒10min，水洗，在28℃環(huán)境中培養(yǎng)10h作用。

2、螨細(xì)胞原代培養(yǎng)

將培養(yǎng)10 h后的若蟲及子代幼蟲用眼科剪剪碎；每種螨加2ml pH7.2~7.4的0.75%胰蛋白酶，37℃消化30min，2000rpm離心15min，棄上清，將沉淀物懸于4ml 10%牛血清199培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，直至螨組織塊成絮狀，再用10%牛血清199液離心洗滌3次。每種螨可得細(xì)胞懸液3 ml，接種于TC199（Gibco)培養(yǎng)液中，加0.4 %水解乳蛋白，15 %胎牛血清（FBS)，0.03 %谷氨酰胺，100 U/ml青、鏈霉素和適量18種非必需氨基酸，置pH6.8~7.2、28℃、5%CO₂環(huán)境中。每周半量換液培養(yǎng)。

3、傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞生長成單層后移去上層培養(yǎng)液，在“條件培養(yǎng)基”（即換液量與原液量各半) 中繼續(xù)生長2~3d，刮下細(xì)胞層，用吸管吹打分散后傳代。數(shù)代后，每周以1:2~4 分種率傳代，同時(shí)作凍存試驗(yàn)。

第二節(jié) 同工酶技術(shù)在蜱螨學(xué)中的應(yīng)用

一、同工酶技術(shù)

同工酶的定義：生物體內(nèi)催化的化學(xué)反應(yīng)相同，而分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫學(xué)性質(zhì)不同的一類酶，被稱為同工酶（Isoenzyme)。這類酶可以存在于生物的同一種屬或同一個(gè)體的不同組織、甚至同一組織或細(xì)胞中。

同工酶技術(shù)：是指運(yùn)用同工酶分離及同工酶譜分析技術(shù)，對(duì)生物進(jìn)化、遺傳變異和疾病發(fā)生等進(jìn)行研究，并為疾病診斷、治療和控制提供依據(jù)的一項(xiàng)技術(shù)。

同工酶技術(shù)的原理

由于同工酶是生物體內(nèi)天然的遺傳標(biāo)記。利用同工酶研究生物的遺傳基因，已成為遺傳學(xué)上的重要內(nèi)容。同工酶是染色體上不同基因座位基因的表達(dá)產(chǎn)物，在生物的生長發(fā)育過程中，同工酶可以反映出基因如何表達(dá)，能較好地反映不同物種之間的遺傳差異以及生物間種或株的基因特征和差異性，具有可靠的生理特性和物種遺傳特征。當(dāng)生物體在感染病害，受到損傷或在不良條件下都會(huì)發(fā)生同工酶的變化。

根據(jù)同工酶分子結(jié)構(gòu)及免疫學(xué)性質(zhì)等特點(diǎn)，目前用于同工酶分離技術(shù)的方法主要包括：電泳、層析、酶學(xué)及免疫學(xué)等方法，其中電泳法最為常用。

同工酶的染色方法有：原染色法、熒光染色法、放射染色法、電子傳遞染色法和酶連鎖染色法。其原理是利用酶活性的特異性，在染色液中加入底物和酶活性所需的因子，通過酶促反應(yīng)生成有色物，顯示酶帶，以便觀察、記錄和分析結(jié)果。

同工酶技術(shù)的應(yīng)用

在生物學(xué)研究中，同工酶可用于研究物種進(jìn)化、遺傳變異、雜交育種和個(gè)體發(fā)育、組織分化等；

在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)上，同工酶用于疾病的診斷和研究疾病發(fā)生（如腫瘤發(fā)生)等；

在臨床醫(yī)學(xué)上，一些同工酶被用作診斷指標(biāo)，如冠心病及冠狀動(dòng)脈血栓引起的心肌受損患者血清中的LDH1（H4)及LDH2（MH3)含量增高，而肝細(xì)胞受損患者血清中LDH5（M4)增高。

二、同工酶技術(shù)在蜱螨學(xué)中的應(yīng)用

同工酶技術(shù)因其敏感性高、特異性強(qiáng)、廉價(jià)而簡便的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法在種下亞分類方面的缺陷，能成功地區(qū)分形態(tài)上十分接近的種，并且還能精確闡明種以下各類群間、種間甚至屬間的遺傳分化程度，被用作蜱螨學(xué)分類研究及種類鑒定的重要工具之一。

1、酯酶同工酶

劉群紅、張浩（2001)應(yīng)用等電聚焦電泳（IEFE)方法研究腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae)和粉塵螨（Dermatophagoides farinae)的酯酶同工酶和蛋白質(zhì)，并將兩者進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，腐食酪螨的酯酶同工酶可見8條帶，其中2條主帶，而粉塵螨的酯酶有7條帶，其中3條為主帶，表明兩種粉螨的酯酶同工酶及相關(guān)蛋白質(zhì)的電泳譜可在一定程度上反映出科、屬、種的差別，酯酶同工酶具多態(tài)性，可應(yīng)用于螨種鑒定及遺傳變異的探討。

國內(nèi)應(yīng)用原盤電泳對(duì)5種革螨的酯酶同工酶、蘋果酸脫氫酶同工酶和乳酸脫氫酶同工酶的研究表明不同種屬革螨的同工酶譜具有明顯的差別，具有重要的分類學(xué)意義。

俞小淙等（1991)應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳技術(shù)（ IEF )對(duì)8種甲螨的酯酶同工酶酶譜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，8種甲螨均具有特異的酯酶同工酶譜，表現(xiàn)在其酶帶總數(shù)、酶帶的排列、主帶數(shù)及各主帶的PI值存在差異，符合形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。

2、α-磷酸甘油脫氫酶（α-GPDH )和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT)

Cicolani et al.（1981)在兩種形態(tài)學(xué)特征不易區(qū)分的親緣種革螨的標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)α-磷酸甘油脫氫酶（α-GPDH )和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT)具有鑒定酶的性質(zhì)，從而使所有的標(biāo)本得到鑒定。

3、檢測環(huán)境污染

俞小淙等（1992)還應(yīng)用電泳技術(shù)檢測汞、鎘、銅以及有機(jī)氯等有害物質(zhì)對(duì)秋田全大翼甲螨和滑菌甲螨酯酶同工酶的影響。結(jié)果表明，這幾種有害物質(zhì)對(duì)兩種甲螨酯酶同工酶均有明顯的抑制作用，且毒性物質(zhì)的濃度與抑制程度有關(guān)。提示這兩種甲螨可以作為一種指示生物以監(jiān)測環(huán)境污染、保護(hù)人類健康。

三、同工酶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

① 能較好地反映不同種株間的遺傳差異，具有可靠的生理特性和遺傳特征；

② 同工酶的遺傳和表達(dá)遵循遺傳學(xué)的基本定律，便于遺傳學(xué)研究；

③ 對(duì)同工酶資料進(jìn)行遺傳學(xué)計(jì)算，使蜱螨系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化的研究有可度量的遺傳學(xué)基礎(chǔ)；

④ 同工酶是結(jié)構(gòu)基因編碼的直接產(chǎn)物，其作為基因的標(biāo)志更直接地反映遺傳信息；

⑤ 簡便、易行，結(jié)果明確，可比性強(qiáng)。

局限性：

① 同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，是基因的生化表現(xiàn)型，而非基因本身；

② 實(shí)驗(yàn)中常用于同工酶分析的同工酶種類有限；

③ 所選同工酶的所有基因不一定都能表達(dá)在酶譜上；

④ 同工酶的變異不一定都和形態(tài)變異或生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)；

⑤ 實(shí)驗(yàn)中還可能會(huì)產(chǎn)生非遺傳的或人為的酶帶，干擾酶譜分析。

第三節(jié) PCR技術(shù)在蜱螨學(xué)研究中的應(yīng)用

一、PCR基本原理

PCR是一種在引物介導(dǎo)和耐熱DNA酶催化下體外模擬天然DNA復(fù)制過程的酶促反應(yīng)，包括高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)階段，具有高度的特異性和敏感性。PCR采用了一對(duì)寡聚DNA作為引物，通過加溫、變性-退火-DNA合成周期性多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。經(jīng)過25~30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)10⁶，理論上可檢出樣品中單一拷貝的DNA片段。

隨著技術(shù)的發(fā)展，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，又不斷涌現(xiàn)衍生許多新的相關(guān)技術(shù)，如反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR)、錨式PCR（anchored PCR)、差異顯示PCR（differential display PCR)、免疫PCR等。PCR-ELISA則是將PCR與核酸雜交、ELISA連為一體，用ELISA鑒定PCR產(chǎn)物。

二、基本PCR技術(shù)

PCR體系中的基本要素：

① DNA模板：可以是單鏈或雙鏈，包括基因組DNA，質(zhì)粒DNA。

② 一對(duì)寡聚DNA引物：分別與模板DNA鏈兩側(cè)的3’端序列互補(bǔ)，用于擴(kuò)增兩者間的DNA序列。

③ 耐熱DNA聚合酶：通常是Taq DNA聚合酶或其類似物，可在高溫下（72℃)催化DNA合成，并能在加熱95℃時(shí)不失活。

④ 緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需pH、離子強(qiáng)度等環(huán)境。

⑤ 四種單核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，提供DNA合成的原料。

影響PCR主要因素：

MgCl₂濃度、循環(huán)次數(shù)、聚合酶穩(wěn)定性、退火溫度等。

三、PCR技術(shù)在蜱螨學(xué)研究中的應(yīng)用

1、國外研究

Dean等（2001，2002)采用多位點(diǎn)取代擴(kuò)增法研究Phytoseinlus persimilis生物學(xué)特性，證實(shí)其缺乏一種被稱為CLO（Cytophage-like organism)樣成分。

在研究變異革蜱Dermacentor variabilis誘導(dǎo)宿主最初免疫反應(yīng)機(jī)制中，Ceraul等（2003)采用了RT-PCR從淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出兩條分別為624bp和225bp的基因片段，其中可編碼一個(gè)含74個(gè)氨基酸殘基的肽酶，該酶存在于昆蟲和蜱體內(nèi)。當(dāng)宿主受其感染，可侵入宿主粒細(xì)胞，通常于15 min后產(chǎn)生分泌性蛋白，持續(xù)時(shí)間18 h，產(chǎn)生類似細(xì)菌感染導(dǎo)致的白細(xì)胞升高的結(jié)果。

Phytoseiid螨是一類可阻止瘟疫傳播的有益螨，還可防止谷物霉變。由于該螨體積微小（通常<0.5mm)，肉眼難以識(shí)別。Jeyaprakash等（2002)提取多種螨DNA，先用普通PCR擴(kuò)增，再有高保真PCR擴(kuò)增線粒體12S rRNA特異性片段，很容易區(qū)別雌雄成衛(wèi)生資格考試網(wǎng)蟲、若蟲、幼蟲、卵的差異。

Lima等（2001)從Boophilus microplus cDNA文庫中分離出GST的cDNA基因，利用RT-PCR檢測蜱組織的GST和其幼蟲mRNA表達(dá)水平，成功地進(jìn)行了種間鑒定，具有較高的靈敏性。

2、國內(nèi)研究

我國對(duì)蜱螨分子生物學(xué)研究較少。李朝品等較早利用PCR法體外擴(kuò)增粉塵螨Der f 1、Der f 2 cDNA， 序列分析結(jié)果證實(shí)出淮南地區(qū)Der f 1 cDNA與國外粉塵螨Der f 1 cDNA序列存在一定差異，Der f 2 cDNA與國內(nèi)粉塵螨Der f 2 cDNA存在一定差異，主要表現(xiàn)為缺失一約87bp的插入序列。

第四節(jié) 反義核酸技術(shù)在蜱螨學(xué)中的應(yīng)用

反義核酸（Antisense oligonucleotide)是指能與特定mRNA精確互補(bǔ)、特異性阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)。反義核酸技術(shù)是基因治療技術(shù)的一種，是根據(jù)核酸雜交原理，設(shè)計(jì)針對(duì)特定靶序列的反義核酸，從而抑制特定基因的表達(dá)。20世紀(jì)80年代以來，反義核酸技術(shù)作為一種選擇性序列特異性的基因表達(dá)抑制方法，已廣泛用于病毒、腫瘤、心血管等疾病的治療。

一、反義核酸的分類

反義核酸包括反義RNA、反義DNA及核酶（ribozyme)。

1、反義RNA

將能對(duì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用的RNA稱為反義RNA。反義RNA的種類較多，作用機(jī)制復(fù)雜，常見的反義RNA見表9-1。

表9-1  原核細(xì)胞內(nèi)天然存在的11種反義RNA

反義RNA按其作用機(jī)制可大致分為三大類：

Ⅰ類反義RNA：這類反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制（ⅠA類)或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對(duì)RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解（ⅠB類)。

Ⅱ類反義RNA：這類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機(jī)制尚不完全清楚，可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結(jié)合后會(huì)引起核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而阻止了核糖體的結(jié)合。

Ⅲ類反義RNA：這類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。

反義RNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：反義RNA可以用化學(xué)法或酶法人工合成，也可利用重組DNA技術(shù)從反義表達(dá)載體中產(chǎn)生。載體可為病毒、質(zhì)粒及脂質(zhì)體。然后通過顯微注射法或共轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使特定基因表達(dá)。

2、反義DNA

又稱反義寡核苷酸，是指一段能與特定的DNA或RNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，并阻止其轉(zhuǎn)錄和翻譯的短鏈脫氧核苷酸。

（1)反義DNA的作用機(jī)制：反義DNA在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均能發(fā)揮作用。在細(xì)胞質(zhì)中，反義DNA和mRNA形成雜交體阻斷核糖體與mRNA結(jié)合，或促進(jìn)RNA酶H定點(diǎn)切割RNA，阻止mRNA的翻譯。反義DNA能穿過核膜，因此在細(xì)胞核中可與前體mRNA甚至和DNA上的互補(bǔ)序列結(jié)合，從而干擾轉(zhuǎn)錄剪接或成熟轉(zhuǎn)錄物質(zhì)運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)。其他機(jī)制包括：與mRNA5’前導(dǎo)序列（從帽子至AUG起始密碼子下游幾個(gè)核苷酸)互補(bǔ)的反義DNA可以不依賴RNA酶H而抑制蛋白質(zhì)合成；通過與引物競爭、cDNA延長終止，以及與聚合酶結(jié)合等抑制逆轉(zhuǎn)錄過程。

（2)反義DNA的構(gòu)建和應(yīng)用：人工構(gòu)建的反義DNA大多經(jīng)化學(xué)修飾，以硫代磷酸酯（PS)修飾的ODNs較多，可以防止核酸內(nèi)切酶的作用。反義DNA進(jìn)入細(xì)胞方法主要為胞飲作用。但PSODN等不易透過細(xì)胞膜，因此常通過脂質(zhì)體包埋、膽酯共聚物、PEG共聚物等與其形成復(fù)合體利于細(xì)胞的攝取。

3、核酶

Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲核糖體RNA前體在成熟過程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱為核酶。核酶是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。隨著反義核酸技術(shù)的發(fā)展和成熟，已逐漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲病的研究。

核酶廣泛存在于生物細(xì)胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結(jié)構(gòu)。酶活性中心由兩個(gè)臂和中間的功能區(qū)組成。兩個(gè)臂序列高度保守，與靶RNA特異互補(bǔ)結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，功能區(qū)則可通過降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，核酶本身在作用過程中并不消耗。核酶裂解分子依賴嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體（X：C、U、A)下游方向即3"端。

核酶可人工合成。根據(jù)核酶的作用位點(diǎn)、靶mRNA周圍的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工設(shè)計(jì)合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動(dòng)子下游，通過轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNA分子，阻斷基因表達(dá)，特別是阻斷有害基因的表達(dá)成為可能。如果已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達(dá)載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。

二、反義核酸技術(shù)在蜱螨學(xué)中的應(yīng)用

螨是引起過敏性哮喘的常見變應(yīng)原，國內(nèi)外均有報(bào)道反義核酸技術(shù)在哮喘中的應(yīng)用。其作用分為以下七個(gè)方面：抗病毒，抑制炎性介質(zhì)，抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制NF-кB的活性，抑制gob-5的表達(dá)，抑制哮喘速發(fā)型超敏反應(yīng)，抑制胞內(nèi)信號(hào)分子傳遞。

第五節(jié) RNA干涉技術(shù)在蜱螨研究中的應(yīng)用

一、RNA干擾的概念

RNA干擾（RNA interference, RNAi)是一種利用小分子雙鏈RNA（double strain RNA, dsRNA)高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)或使其沉默，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因表型缺失的技術(shù)。RNAi是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS)。由于RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，曾被Science評(píng)為2001年度最重要的成果之一，而被形象地譽(yù)為基因敲低（knock down)或基因沉默（gene silencing)。

自Fire和Mell（1998)發(fā)現(xiàn)RNAi以來，已陸續(xù)證實(shí)植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、鼠、猴、人類的多種細(xì)胞中均存在該現(xiàn)象。因此，有學(xué)者猜想RNAi可能是生物界，包括植物和動(dòng)物等普遍存在的一種古老、保守而又極其重要的遺傳行為。

二、RNA干擾的機(jī)制

RNAi的確切機(jī)制尚不清楚，許多研究結(jié)果顯示dsRNA通過干擾基因組DNA的甲基化、轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA及蛋白質(zhì)的翻譯等不同的機(jī)制對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而誘導(dǎo)特定基因的沉默。

1、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制

外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式導(dǎo)入的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割成約22nt的具有雙鏈結(jié)構(gòu)的小干涉RNA （small interfering RNA, siRNA)，這些siRNA具有5’磷酸、3’羥基末端以及兩個(gè)游離核苷酸突出，這種結(jié)構(gòu)在RNAi調(diào)控途徑中起著關(guān)鍵性的作用。siRNA與核酶結(jié)合形成沉默復(fù)合物（RNA induce silencing complex, RICS)。隨即RICS 中的siRNA在 Dicer酶解旋酶活性作用下開始解旋、解鏈，然后依靠siRNA反義鏈，通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA上，此過程需ATP提供能量。部分結(jié)合到mRNA的單鏈siRNA充當(dāng)引物，以mRNA為模板合成新的dsRNA，新合成的dsRNA仍可被Dicer酶切割而發(fā)揮調(diào)控作用；部分siRNA在其3’端下游12個(gè)堿基的位置由Dicer酶切割mRNA，切割后的mRNA由于沒有5’帽狀結(jié)構(gòu)和Poly（A)尾巴的保護(hù)，很快被其它的核酸酶降解。

近來研究表明Dicer酶屬于RNA酶Ⅲ家族成員，至少包含了四個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N-末端解旋酶結(jié)構(gòu)域（依賴ATP酶活性)、PAZ結(jié)構(gòu)域、雙鏈RNA酶催化結(jié)構(gòu)域及雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的dsRNA。Dicer結(jié)構(gòu)細(xì)微的變化即可導(dǎo)致切割間距的改變，表現(xiàn)為被切割成的siRNA長度發(fā)生改變，從而不能發(fā)揮RNAi作用或者表現(xiàn)出非特異性基因沉默。

2、翻譯水平的調(diào)節(jié)機(jī)制

細(xì)胞內(nèi)70nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)或dsRNA前體轉(zhuǎn)錄物被Dicer/Argonaute復(fù)合物特異性識(shí)別后，降解成為成熟的大小為21nt、5’端為單磷酸基、3’端為羥基的單鏈小RNA分子，即小時(shí)序RNA（small temporal RNA, stRNA)或微RNA（micro RNA, miRNA)。stRNA與相關(guān)蛋白結(jié)合成另一種RISC復(fù)合體，可識(shí)別并結(jié)合靶序列的3’端非編譯區(qū)（UTR)，抑制其翻譯過程從而調(diào)控基因表達(dá)。

3、基因組DNA甲基化機(jī)制

在植物研究發(fā)現(xiàn)dsRNA可以影響基因組的甲基化修飾及改變?nèi)旧�體結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因的表達(dá)，為RNAi的機(jī)制帶來了極大的補(bǔ)充。若外源基因以多拷貝形式整合到同一位點(diǎn)上形成正向或反向重復(fù)，甲基化酶可識(shí)別這些重復(fù)序列，引起這些基因位點(diǎn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)網(wǎng)的甲基化。若甲基化發(fā)生在啟動(dòng)子則產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS)；如果發(fā)生在編碼序列則產(chǎn)生PTGS。dsRNA還可通過細(xì)胞內(nèi)一種名為Polycomb的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象的“開關(guān)”狀態(tài)。在這一過程中，dsRNA或siRNA通過堿基互補(bǔ)首先與靶DNA序列結(jié)合，隨后引導(dǎo)Polycomb復(fù)合體與鄰近序列結(jié)合，靶基因隨即沉默，這一效應(yīng)可在細(xì)胞分裂后傳至下一代。

三、RNA干擾的特點(diǎn)

dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾具有以下特點(diǎn)：

1、RNAi具有高度特異性

對(duì)某些特定目的基因的dsRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)僅能使該基因的mRNA發(fā)生特異性降解，特異性阻抑該內(nèi)源基因的功能。

2、RNA干涉抑制基因的表達(dá)具有高效性

低濃度的dsRNA可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的阻抑效應(yīng)。研究表明每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只要有幾分子的dsRNA就能作用于高豐度的內(nèi)源性mRNA分子，阻抑靶基因的功能。

3、干涉作用的廣泛性

在部分生物中，siRNA分子能通過細(xì)胞膜、細(xì)胞間和組織屏障被轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使得RNA干擾作用廣泛。例如在線蟲小腸中微注射稀釋的dsRNA分子，在線蟲小腸以外的其它組織也產(chǎn)生對(duì)靶基因的阻抑效應(yīng)；如果用含表達(dá)目的基因dsRNA載體的大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲，在體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等中都產(chǎn)生dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾在美麗線蟲中RNA干擾不僅發(fā)生在親代動(dòng)物本身，還發(fā)生在子代動(dòng)物中。

4、與傳統(tǒng)的研究基因的方法如基因敲除、誘變等技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有簡單、快速、省時(shí)、省力等特點(diǎn)。

四、RNA干擾在蜱螨研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景

在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，RNAi技術(shù)主要集中在對(duì)秀麗新桿線蟲 （Caenorhabitis elegans)基因功能的研究，目前人們已應(yīng)用RNAi技術(shù)成功的闡明該線蟲至少1/3的基因的功能。

RNAi技術(shù)在醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，仍是方興未艾，自Sukanya N成功的運(yùn)用dsRNA阻斷Ixodes scapilaris唾液腺抗凝血酶Salp14基因的表達(dá)，證明該技術(shù)可以應(yīng)用于蜱螨的研究以來，RNAi技術(shù)僅被應(yīng)用于Amblyomma americanum 唾液腺相關(guān)蛋白v-SNARs基因和組胺酸結(jié)合蛋白HBP基因的研究，RNAi技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)螨類的研究至今仍未見報(bào)道。將RNAi技術(shù)應(yīng)用于蜱螨研究目前遇到的挑戰(zhàn)是蜱、螨基因組的提取及其cDNA文庫的建立和在體外連續(xù)培養(yǎng)、傳代大多數(shù)寄生蜱螨。相信隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，以dsRNA為基礎(chǔ)的RNAi技術(shù)將大大推動(dòng)蜱螨的基因組學(xué)的研究，還有可能設(shè)計(jì)出RNAi芯片，高通量地篩選藥物作用靶基因，逐個(gè)檢測蜱、螨基因的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能，并且它還將在關(guān)鍵蛋白質(zhì)在蜱和螨發(fā)病機(jī)制中的重要作用，防止蜱螨在人群中的傳播、基因治療等領(lǐng)域推動(dòng)醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)的發(fā)展。

第六節(jié) 噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)在蜱螨研究中的應(yīng)用

噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)（Phage display technology, PDT)是利用在改造的噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因PⅢ或PⅧ區(qū)引入外源基因，以融合形式表達(dá)外源肽或蛋白，使其隨著噬菌體的組裝而呈現(xiàn)在噬菌體表面，保持特定的空間構(gòu)象，并通過免疫親和吸附法篩選特異性肽或蛋白的一項(xiàng)新技術(shù)。

在蜱螨變應(yīng)原研究方面，可以利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)建立各種屬蜱螨的噬菌體cDNA文庫，并進(jìn)行文庫的篩選和抗原蛋白的鑒定。Eriksson TL等曾利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)構(gòu)建塵螨Lepidoglyphus destructor的cDNA表達(dá)文庫并對(duì)新的抗原進(jìn)行了篩選，分離、鑒定了L. destructor的三種新變應(yīng)原。

噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)極大地推動(dòng)了抗體工程的發(fā)展，為在體外模擬免疫系統(tǒng)的抗原選擇和抗體多樣化過程，進(jìn)而篩選高特異性、高親和力的基因工程抗體提供了技術(shù)支持，噬菌體抗體技術(shù)已被廣泛用于構(gòu)建篩選特異性單鏈、單區(qū)或更小片段抗體。

利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，將抗體分子片段基因與外殼蛋白基因（基因Ⅲ或基因Ⅷ)連接，構(gòu)建表達(dá)性基因文庫，即為噬菌體抗體展示文庫（phage antibody display repertoire)，經(jīng)篩選可獲得特異性抗體基因，噬菌體抗體庫的構(gòu)建大致分為以下幾步：

1、噬菌體抗體的構(gòu)建

抗體Fab和ScFv（單鏈抗體可變區(qū)基因片段)均可在噬菌體中表達(dá)，并呈現(xiàn)在噬菌體表面。在Fab表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)，可將L鏈基因和Fd段基因構(gòu)建于一個(gè)載體上，轉(zhuǎn)染大腸桿菌。Fd段或L鏈基因與噬菌體外殼蛋白基因（基因Ⅲ或基因Ⅷ)相連，融合蛋白錨定在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上，與另一條鏈（游離狀態(tài))結(jié)合可形成抗原結(jié)合特異性的抗體。在ScFv表達(dá)時(shí)，利用PCR技術(shù)和DNA接頭（linker)，可將L鏈和H鏈的V區(qū)基因隨機(jī)重組在一起，再克隆到載體中去表達(dá)ScFv抗體分子片段（ScFv基因與基因Ⅲ或Ⅷ連接)，并呈現(xiàn)在噬菌體表面利于篩選。將特異性抗原固相化，用文庫的噬菌體與其反應(yīng)，經(jīng)過洗滌，洗脫，收獲和純化表達(dá)特異性抗體的噬菌體。

2、噬菌體抗體的表達(dá)載體

用于噬菌體抗體表達(dá)的載體包括噬菌體載體和噬粒（phagemid)。將抗體片段基因與野生型噬菌體基因Ⅲ的5端連接，可表達(dá)與蛋白Ⅲ基因的N端融合的抗體片段分子，呈現(xiàn)在噬菌體的表面。噬粒是含噬菌體基因間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，本身不含噬菌體蛋白編碼基因，在導(dǎo)入大腸桿菌后不產(chǎn)生子代噬菌體。當(dāng)用輔助噬菌體感染時(shí)，輔助噬菌體編碼的噬菌體蛋白，可將單鏈?zhǔn)闪�DNA包裝成噬菌體病毒顆粒釋放出來，其外殼蛋白呈現(xiàn)抗體分子片段，同時(shí)含有g(shù)p3和gp8，并能再次感染大腸桿菌而繁殖。噬粒具有質(zhì)粒特性，帶有抗藥性基因和復(fù)制起點(diǎn)，便于篩選含目的片段的克隆和在大腸桿菌內(nèi)的擴(kuò)增。

3、噬菌體抗體分子的親和力成熟

同模擬體內(nèi)B細(xì)胞經(jīng)抗原多次刺激后產(chǎn)生的抗體親和力增加一樣，由于抗體基因庫的容量大，基因的隨機(jī)組合及CDR區(qū)的堿基突變（可采取PCR錯(cuò)配、隨機(jī)突變等)，可獲取高親和力的抗體基因片段。

4、抗體分子基因片段的可溶性表達(dá)

在噬菌體抗體呈現(xiàn)中，抗體分子片段在融合蛋白的N端呈游離狀態(tài)，可正確的折疊，形成具有功能的蛋白分子。如果抗體片段基因和外殼蛋白基因（Ⅲ或Ⅷ)間放置amber終止密碼子（TAG)，則在不帶琥珀抑制基因（amber suppressor)的宿主菌中，TAG為終止密碼子，合成的抗體分子蛋白多肽穿過細(xì)胞內(nèi)膜，以可溶蛋白的形式分泌表達(dá)；而在帶有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗體分子多肽以融合蛋白的形式錨定在細(xì)菌膜上。

構(gòu)建噬菌體抗體庫可以繞過雜交瘤途徑來制備單克隆抗體，這既可以免去制備免疫性抗原和免疫小鼠的繁瑣，又能克服異源抗體，雜交瘤融合率低、穩(wěn)定性差、抗體產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，而且篩選的抗體目的性強(qiáng)。但有關(guān)蜱螨的免疫抗體文庫尚未見有報(bào)道。

此外，噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)可在分子水平研究抗原、抗體之間作用的特點(diǎn)，尤其是IgE與變應(yīng)原之間的相互作用。也可用于蜱螨源性變態(tài)反應(yīng)患者體內(nèi)IgE水平的研究。

第七節(jié) 蜱螨的分子系統(tǒng)學(xué)

生物系統(tǒng)學(xué)（systematics)是研究生物多樣性以及它們中間的任何一個(gè)類群和其他類群的各種關(guān)系的科學(xué)。系統(tǒng)學(xué)研究是建立在分類學(xué)基礎(chǔ)之上的，而對(duì)生物進(jìn)行分類是人類認(rèn)識(shí)生物世界的第一步。60 年代開始，新的系統(tǒng)發(fā)生、數(shù)據(jù)逐漸積累，計(jì)算機(jī)硬件和軟件的建立使系統(tǒng)發(fā)生學(xué)取得了長足的進(jìn)步，特別是蛋白質(zhì)、核酸分子結(jié)構(gòu)檢測方法和生物信息技術(shù)方法的迅猛發(fā)展，給生物系統(tǒng)學(xué)注入了新鮮的活力。從物種的進(jìn)化到高級(jí)分類單元的相互關(guān)系，從種群的個(gè)體變異到近緣種的鑒定，大量的分子生物學(xué)技術(shù)越來越多地應(yīng)用于生物系統(tǒng)學(xué)研究的各個(gè)層次，這樣就產(chǎn)生了一門新的學(xué)科——分子系統(tǒng)學(xué)（molecular systematics)。

一、定義及其發(fā)展歷史

分子系統(tǒng)學(xué)是通過檢測生物大分子包含的遺傳信息，定量地描述、分析這些信息在分類、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化上的意義，從而在分子水平上解釋生物的遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化規(guī)律的一門學(xué)科。它以分子生物學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、遺傳學(xué)、分類學(xué)和進(jìn)化論為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)、生物化學(xué)和儀器分析技術(shù)的最新發(fā)展為研究手段，是一門交叉性很強(qiáng)的學(xué)科。

其發(fā)展歷史根據(jù)研究方法的發(fā)展大致可分為三個(gè)階段：

第一階段：20 世紀(jì)50～60 年代, 分子系統(tǒng)學(xué)的研究主要在蛋白質(zhì)的水平。主要研究方法是傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法（血清學(xué)鑒定)和60 年代中期出現(xiàn)的酶電泳技術(shù)。

第二階段：酶電泳技術(shù)在20世紀(jì)70年代成為分子系統(tǒng)學(xué)的熱點(diǎn)技術(shù)，并在脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系的研究上取得了一定成果。同時(shí)分子系統(tǒng)學(xué)研究隨著DNA分子結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)入了核酸水平時(shí)期，早期的技術(shù)有核型分析、帶型分析、熒光原位雜交、染色體原位隱藏雜交、細(xì)胞分型、脈沖場梯度交變電泳等，70 年代末期，mtDNA的限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)開始在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的種群結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用, 并逐漸成為動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究的有力工具。

第三階段：80 年代以來, 以PCR和Southern 雜交為基礎(chǔ)發(fā)展了一系列衍生技術(shù), 如限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（restriction fragment length polymorphism, RFLP)、PCR-RFLP、DNA指紋圖譜技術(shù)（DNA fingerprinting, DNAfp)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 技術(shù)（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)等, 近幾年來又發(fā)展了微衛(wèi)星DNA 指紋圖譜技術(shù)（mircoDNA fingerprinting)、基因芯片技術(shù)（gene chip)及核酸序列測定技術(shù)（gene sequencing)等, 使分子系統(tǒng)學(xué)在DNA水平的研究飛速發(fā)展并取得了大量的顯著成果。

二、分子系統(tǒng)學(xué)研究的一般步驟和實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、研究步驟

分子系統(tǒng)學(xué)的主要研究步驟包括：① 標(biāo)本的收集，包括標(biāo)本與模式標(biāo)本、已有標(biāo)本和新標(biāo)本；② 選擇可取、合適的分子分類手段對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析；③ 選擇合適的數(shù)據(jù)模型和分析方法分析所得到的數(shù)據(jù)，建立符合物種發(fā)育關(guān)系的系統(tǒng)樹（phylogenetic tree)，并進(jìn)行檢驗(yàn)校正；④ 結(jié)合形態(tài)學(xué)分類等傳統(tǒng)方法，確定該物種的分類地位和親緣關(guān)系。

2、研究手段

分子系統(tǒng)學(xué)研究可應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)及儀器分析等多種技術(shù)手段。限于篇幅，這里僅介紹近年來發(fā)展迅速的蛋白質(zhì)分子系統(tǒng)學(xué)和核酸分子系統(tǒng)學(xué)技術(shù)。

三、分子系統(tǒng)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及在蜱螨學(xué)研究中的應(yīng)用

（一)蛋白質(zhì)的分子系統(tǒng)學(xué)

20 世紀(jì)60 年代，蛋白質(zhì)分子系統(tǒng)學(xué)研究以組織勻漿液中可溶性蛋白質(zhì)的免疫學(xué)方法為主。以后又發(fā)展了純蛋白的微量補(bǔ)體技術(shù)。70 年代產(chǎn)生了單克隆抗體技術(shù)，使免疫（血清)系統(tǒng)學(xué)方法更加準(zhǔn)確可靠。70～80年代主要以等位酶基因電泳為主，以后蛋白質(zhì)序列和立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也用于系統(tǒng)學(xué)研究中。到目前為止,蛋白質(zhì)分子系統(tǒng)學(xué)研究方法可歸為四類:免疫學(xué)（血清學(xué)) 方法、電泳方法、一級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法和立體結(jié)構(gòu)分析方法。

1、免疫學(xué)（血清學(xué))方法

血清系統(tǒng)學(xué)（Systematic Serology)是應(yīng)用抗體、抗原反應(yīng)研究蛋白質(zhì)之間或有機(jī)體之間進(jìn)化關(guān)系的學(xué)科。20世紀(jì)五六十年代應(yīng)用于系統(tǒng)學(xué)較多的是傳統(tǒng)的血清學(xué)反應(yīng)，即凝集反應(yīng)（agglutination)、沉淀反應(yīng)（precipitation)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（complement fixation reaction)和中和反應(yīng)（neutralization)。七十年代以來微量補(bǔ)體固定技術(shù)和免疫標(biāo)記技術(shù)大量的應(yīng)用于系統(tǒng)學(xué)研究的各個(gè)層次和領(lǐng)域，其中應(yīng)用最為廣泛的應(yīng)屬酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及基于ELISA的一系列衍生實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

2、酶電泳技術(shù)

60年代中期酶電泳技術(shù)開始應(yīng)用于分子系統(tǒng)學(xué)研究，隨后在昆蟲的分類和進(jìn)化研究中廣泛應(yīng)用。同工酶和等位酶電泳技術(shù)通過分析酶的電泳譜帶可間接達(dá)到在基因水平上研究遺傳變異的目的, 同工酶和等位酶是應(yīng)用最多的兩類酶。由于等位酶譜帶與等位基因之間關(guān)系更加明確, 因而以等位酶電泳的應(yīng)用更為廣泛。

酶電泳分析步驟可分為蛋白質(zhì)的提取、分離、染色、解釋和應(yīng)用。得到的蛋白質(zhì)必須在-70℃溫度下保存，但即使在這樣的溫度條件下，一些蛋白質(zhì)也會(huì)在數(shù)月內(nèi)降解�？捎糜诿笝z測的電泳主要有淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和醋酸纖維素膜電泳等。多數(shù)研究表明，改變電泳條件能檢測出更多的變異。

酶電泳方法的優(yōu)點(diǎn)：可以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)檢測出大量樣本中許多座位上的遺傳變異，在種群水平上檢測遺傳變異快速有效，儀器設(shè)備簡單，方便節(jié)省，較短時(shí)間的預(yù)電泳和反應(yīng)材料的長生命周期。缺點(diǎn)：可利用的遺傳位點(diǎn)數(shù)量較小，只能檢測編碼酶蛋白的基因位點(diǎn)，對(duì)非編碼基因的變異則無能為力；同時(shí), 密碼子同義突變的廣泛存在使之無法檢測全部的DNA變異，因而低估遺傳變異水平，而且等位基因位點(diǎn)易受選擇壓力的影響，進(jìn)一步降低了它用于估計(jì)遺傳變異的精確性，因而用等位酶數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育重建說服力較弱。

3、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

不同種屬生物的功能相同的蛋白質(zhì)分子，其一級(jí)結(jié)構(gòu)有種屬差異，差異的大小反映了種屬之間的親緣關(guān)系和蛋白質(zhì)分子進(jìn)化的規(guī)律。在這些蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，有一些位置上的氨基酸殘基不因種屬來源的不同而改變，即在進(jìn)化過程中始終保持不變。利用蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)的研究極有意義，根據(jù)其序列建系統(tǒng)樹有兩大優(yōu)點(diǎn)，即蛋白質(zhì)中位點(diǎn)變化的規(guī)律可用經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ兔枋觯ㄈ缱钪�名的Dayhoff 模型)，物種間無明顯的氨基酸偏愛性。但是，蛋白質(zhì)測序工作較困難、費(fèi)用高，現(xiàn)已逐漸有被核酸測序所代替。依據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行蜱螨分子進(jìn)化和分類的研究至今尚未見報(bào)道。

4、蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)在一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，經(jīng)過空間盤旋折疊成為具有生物活性和功能的大分子。生物大分子的功能主要是在其三維結(jié)構(gòu)上體現(xiàn)的，分子間的相互作用也依賴于三維結(jié)構(gòu)及其附近的環(huán)境，而且由于同源生物大分子的三維結(jié)構(gòu)比其一級(jí)結(jié)構(gòu)更具保守性。例如，來自不同種屬的細(xì)胞色素C，它有的可能在一級(jí)結(jié)構(gòu)上差異大，但在三維結(jié)構(gòu)上其主鏈構(gòu)象卻是相同的。通過比較生物大分子的立體結(jié)構(gòu)特征來推斷生物類群之間的系統(tǒng)發(fā)育，可以得到一些在僅用一級(jí)結(jié)構(gòu)來進(jìn)行研究時(shí)所不可能得到的有意義的信息和結(jié)果。Bajaj等（1984)通過對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的比較研究表明，在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物的絲氨酸蛋白酶中，除Ser195、Ser 214、His 57、Asp 102 和Asp 194 這幾個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸外，其余位于活性部位的所有氨基酸都是保守的，且其中有5個(gè)甘氨酸殘基和2個(gè)半胱氨酸殘基是不變的。

5. 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析（mass spectrometry)包括質(zhì)譜檢測、軟件程序分析及數(shù)據(jù)庫檢索。質(zhì)譜分析可以對(duì)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，通過數(shù)據(jù)庫檢索，質(zhì)譜分析可以比較被檢蛋白的多肽質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中蛋白的多肽質(zhì)譜，并以此為根據(jù)對(duì)被檢蛋白進(jìn)行鑒定。而且，質(zhì)譜分析還可檢測到蛋白消化后形成的多肽的氨基酸序列，再通過數(shù)據(jù)庫檢索對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜分析所獲得的蛋白氨基酸序列是對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定的最準(zhǔn)確而有效的手段。

此方法是將蛋白質(zhì)用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis)從混合樣本中分離出來，進(jìn)行染色，目前主要的染色方法有金屬銀染色、金屬鋅負(fù)染色（negative zinc imidazole staining)、考馬斯藍(lán)染色（coomassie blue staining)等，然后用質(zhì)譜儀檢測，計(jì)算出差異蛋白，進(jìn)行鑒定。

目前質(zhì)譜分析主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由于其耗資大，費(fèi)時(shí)多，操作復(fù)雜，至今還未應(yīng)用于分子系統(tǒng)學(xué)的研究，相信隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，不久的將來必將成為分子系統(tǒng)學(xué)研究的有力工具。

（二)核酸的分子系統(tǒng)學(xué)研究

　　根據(jù)核酸（DNA 和RNA)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究開始于70年代。最早是測定基因組大小[（G+ C)%含量] 和基因組DNA2DNA（RNA)雜交等。1979年RFLP開始應(yīng)用于分子系統(tǒng)學(xué)研究，1980美國學(xué)者Botstein發(fā)現(xiàn)DNA限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP)可作為遺傳標(biāo)記。1985年P(guān)CR 技術(shù)和DNAfp 的出現(xiàn)，擴(kuò)展了分子系統(tǒng)學(xué)的方法和對(duì)象。90年代，RAPD2PCR、AFLP、微衛(wèi)星和小衛(wèi)星DNA的DNAfp及DNA序列分析技術(shù)成為分子系統(tǒng)學(xué)的主要方法。

1、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)分析

限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)分析是80年代中期發(fā)展起來的一種DNA多態(tài)分析技術(shù)，它將目標(biāo)DNA序列經(jīng)一定數(shù)目和種類的限制性內(nèi)切酶（RE)進(jìn)行酶切, 由于不同的目標(biāo)DNA 的序列結(jié)構(gòu)（遺傳信息)有差異，RE 在其上的識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目和距離就發(fā)生了改變，因而產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的DNA 片段。然后通過Southern 雜交可以把與被標(biāo)記DNA 相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜（較簡單的靶序列，如mtDNA 可以省卻雜交直接用電泳方法檢測)，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系的分析。

RFLP 分析數(shù)據(jù)多態(tài)信息量大，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，不受環(huán)境及物種發(fā)育階段影響，呈孟德爾遺傳，可以有效區(qū)分純合子和雜合子，而且非等位的RFLP標(biāo)記不存在上位效應(yīng)，只要有探針就可檢測出不同物種或個(gè)體的同源DNA分子的RFLP，對(duì)于物種間親緣關(guān)系的研究特別有用。但RFLP技術(shù)對(duì)樣品純度要求較高，當(dāng)樣品很少時(shí)要結(jié)合應(yīng)用PCR擴(kuò)增，探針的制備很費(fèi)功夫，標(biāo)準(zhǔn)方法必需先構(gòu)建cDNA文庫并篩選出可用作探針DNA序列，技術(shù)路線復(fù)雜，而且雜交中存在放射性安全問題, 不宜為一般的實(shí)驗(yàn)室所采用。另外，它無法檢測靶序列中的重復(fù)序列區(qū)，態(tài)性檢測水平過分依賴于所選用的RE的種類和數(shù)目，由于不同的RE識(shí)別位點(diǎn)的進(jìn)化速率不同，因而，對(duì)于不同的進(jìn)化靶序列，如果選樣不當(dāng)就會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)偏差。

目前在分子系統(tǒng)學(xué)中用于RFLP分析的靶序列主要是基因組DNA和線粒體DNA（mtDNA)，其中mtDNA是系統(tǒng)進(jìn)化研究的一個(gè)強(qiáng)有力的工具，尤其是動(dòng)物線粒體。因?yàn)樗�的堿基替換速率相對(duì)較快，而且高效的單倍體遺傳和母系遺傳方式減小了檢測時(shí)的有效種群大�。╡ffective population size)，提高了遺傳漂移的敏感性，是目前分子系統(tǒng)學(xué)上最佳的靶序列。

2、微衛(wèi)星DNA指紋圖譜技術(shù)

微衛(wèi)星DNA也稱簡單串聯(lián)重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR)，在所有真核生物基因組中隨機(jī)分布，由于重復(fù)次數(shù)和程度的不同使所在的基因座位呈現(xiàn)一定的多態(tài)性。微衛(wèi)星DNA 的重復(fù)在基因組的進(jìn)化中起著非常重要的作用，因而，被認(rèn)為是遺傳信息含量最高的遺傳標(biāo)記，并日益成為基因組分析和分子進(jìn)化分析最普遍的工具。在分子系統(tǒng)學(xué)研究中，可以利用某個(gè)微衛(wèi)星DNA兩端的保守序列設(shè)計(jì)探針，同基因組DNA雜交或通過PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)通過放射自顯影得到的雜交信號(hào)進(jìn)行分析，得到標(biāo)記的探針雜交檢測微衛(wèi)星DNA 的變異。

微衛(wèi)星DNA在基因組中多態(tài)性高，并且等位基因數(shù)目多，呈共顯性遺傳，其指紋圖譜有極高的多態(tài)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，適用于任何真核生物的系統(tǒng)進(jìn)化研究。但是，微衛(wèi)星座位突變機(jī)率高，對(duì)變異反應(yīng)極其靈敏，所以易受到趨同變異引起的平行演化（homoplasy)程度（size)的影響，從而給物種間親緣關(guān)系的評(píng)估帶來誤差；此外，這一技術(shù)耗時(shí)較長，花費(fèi)較大，并存在著放射性安全的問題，而且只能檢測那些已知序列的微衛(wèi)星DNA。

3、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的，以一系列隨機(jī)合成的寡核甘酸單鏈為引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。RAPD在寄生蟲的分類鑒定上應(yīng)用較廣泛，尤其對(duì)傳統(tǒng)分類學(xué)方法難以解決的問題更加適用。以一個(gè)隨機(jī)引物對(duì)生物標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)本都能擴(kuò)增出一些DNA片段，其中有些片段為種特異，且為種內(nèi)所有個(gè)體所共有，有些片段則為某些個(gè)體所特有。而用不同的引物擴(kuò)增同一標(biāo)本，即使引物中一個(gè)堿基對(duì)的差異也將導(dǎo)致全套擴(kuò)增產(chǎn)物帶型的完全改變，所以可用RAPD技術(shù)可對(duì)蜱螨的種、株型及種群進(jìn)行鑒定區(qū)分。

楊銀書等選取3條不同的隨機(jī)排列堿基順序的多聚核苷酸單鏈為引物（P、P6、P7)進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并對(duì)這7種硬蜱的DNA多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示7種硬蜱分別擴(kuò)增出不同數(shù)量與不同分子質(zhì)量的DNA片段，有些硬蜱DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中具有相同的DNA條帶，反映出它們的基因組DNA具有同源性；同時(shí)又具有各自獨(dú)特的DNA條帶，且DNA條帶的亮度也有差異。被擴(kuò)增出的7種蜱的DNA片段既表現(xiàn)為種特異性，又反映了種的同源性，因此，RAPD技術(shù)可以準(zhǔn)確地區(qū)分這 7種蜱。劉運(yùn)喜等采用聚合酶鏈反應(yīng)/限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR/RFLP)技術(shù)對(duì)恙蟲病東方體山東分離株、小盾纖恙螨勻漿及恙蟲病病人全血中提取的DNA Sta56基因進(jìn)行分析，并與Nested PCR基因分型的結(jié)果進(jìn)行比較，來鑒定山東地區(qū)恙蟲病東方體的基因型。結(jié)果山東地區(qū)恙蟲病東方體流行株主要基因型與日本地方株Kawasaki型類似,但與日本地方株存在遺傳差異；同時(shí)還有Karp型Ot存在。采用PCR/RFLP方法可以準(zhǔn)確對(duì)Ot-Sta56基因分型。

Tonya等以線粒體細(xì)胞色素ｂ（Cyt b)和核糖體rRNA基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄空間ITS1作為種群目標(biāo)分子標(biāo)記位點(diǎn)，采用SSCP-PCR技術(shù)對(duì)黑腳硬蜱的種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果在Cytｂ位點(diǎn)上共發(fā)現(xiàn)7個(gè)單倍基因型，在ITS1位點(diǎn)上共發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因型，沿美國東海岸分布的黑腳硬蜱隸屬于兩個(gè)不同的南北種群。

RAPD的優(yōu)點(diǎn)是簡便快速，在24小時(shí)內(nèi)可完成全部實(shí)驗(yàn)；無需貴重儀器;需樣量少，特別適于微小型昆蟲；可擴(kuò)增干制或固定標(biāo)本；應(yīng)用多種引物可進(jìn)行高級(jí)階元間比較；與RFLP技術(shù)結(jié)合可進(jìn)行快速序列分析。盡管諸如RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)在寄生蟲分類中有較廣泛的應(yīng)用，但這些技術(shù)還存在一些不足，如 RAPD標(biāo)記為顯性分子標(biāo)記，不能區(qū)分純合子及雜合子；而且結(jié)果重復(fù)性較差，各實(shí)驗(yàn)室資料缺乏可比性。但如果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，這些不足可以克服。

4、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymophism, AFLP)技術(shù)是由VOS. P 和Zebeau M等將RFLP 分析法和PCR法結(jié)合起來發(fā)展的一種新的基因組DNA 多態(tài)性分析技術(shù)。該技術(shù)將得到的DNA樣品先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后有RE酶切，電泳。與RFLP相比最大的優(yōu)點(diǎn)是：所需的DNA 量少，不需Southern 雜交，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性較好,表現(xiàn)孟德爾遺傳，每個(gè)AFLP反應(yīng)可以檢測的位點(diǎn)50～100個(gè),多態(tài)性強(qiáng),適宜于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、分子系統(tǒng)學(xué)研究。

5、基因芯片技術(shù)

基因芯片（Gene chip)又稱 DNA芯片、DNA微陣列（DNA microarray)，是將大量的 DNA片段按預(yù)先設(shè)計(jì)的排列方式固化在載體表面如硅片、玻片，并以此為探針，在一定的條件下，與樣品中待測的靶基因片段雜交，通過檢測雜交后的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因信息的快速檢測�；�因芯片可以分為很多種類，常見并廣泛應(yīng)用的有cDNA微陣列和寡核苷酸原位合成。目前，基因芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域主要有：基因表達(dá)譜分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和分型、藥物篩選、基因測序等。

國內(nèi)基因芯片技術(shù)在蜱螨學(xué)中的應(yīng)用主要為恙螨媒性傳染病的檢測和分型等，根據(jù)恙蟲病東方體56kD外膜蛋白基因序列，設(shè)計(jì)群特異性引物及探針，制備寡核苷酸芯片，用Cy3標(biāo)記的引物，利用不對(duì)稱PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段，將擴(kuò)增的DNA片段與芯片上的探針雜交，用熒光掃描儀檢測并分析信號(hào)，建立了特異、靈敏、快速檢測恙蟲病東方體標(biāo)準(zhǔn)株DNA的基因芯片檢測技術(shù)。崔紅等以16 SrDNA為對(duì)象，設(shè)計(jì)并合成4條寡核苷酸探針，利用微陣列技術(shù)構(gòu)建立克次體檢測用生物芯片技術(shù)，建立了一種能在未知標(biāo)本中快速檢測 6種立克次體的方法，對(duì)伯氏考克斯體、漢氏巴爾通體、恙蟲病東方體可以將其鑒定到種或?qū)�。朱進(jìn)等根據(jù)漢坦病毒屬（HV)76-118株和R22株S基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物和探針，制備寡核苷酸芯片，能夠檢測出漢坦病毒HTS型和SEO型病毒核酸的特異性熒光信號(hào)；同時(shí)與瘧原蟲、鉤端螺旋體、恙蟲病東方體、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、血吸蟲等6種病原體的特異性探針對(duì)照，可快速鑒定出7種病原體。

國外基因芯片技術(shù)在蜱螨學(xué)中的應(yīng)用較多。Revel等采用DNA微陣列技術(shù)研究萊姆病病原伯氏疏螺旋體在不同宿主和環(huán)境條件下的基因表達(dá)，螺旋體生活狀態(tài)不同，其基因的表達(dá)也不盡相同，微陣列技術(shù)可為伯氏疏螺旋體的生活史假設(shè)提供可檢測的依據(jù)。Heishi等用螨抽提物接種NC/Nga小鼠獲得遺傳性過敏性皮炎（AD)模型，并用寡聚核苷酸陣列分析其基因，結(jié)果表明此模型可用于闡明AD的發(fā)病機(jī)制并可為AD的治療提供有效的模型。

基因芯片技術(shù)有其顯著的特點(diǎn)。其一，基因芯片能對(duì)微量樣品中的核酸序列進(jìn)行檢測和分析，其高通量、快速、并行化采集生物信息的特點(diǎn)更是優(yōu)于其他傳統(tǒng)的技術(shù)方法。第二，基因芯片技術(shù)以一種系統(tǒng)、整體的方法進(jìn)行研究，打破了“一種疾病、一種基因”的陳舊模式，整體宏觀的研究生物體基因的表達(dá)及功能。

基因芯片技術(shù)仍存在很多的問題，如核酸雜交反應(yīng)的特異度與檢測靈敏度不夠理想、制作方法復(fù)雜、樣品處理繁瑣、標(biāo)記過程耗時(shí)以及價(jià)格昂貴難以普及等。另外，基因芯片上的基因是已知，但很多基因的功能目前尚未研究清楚，有時(shí)盡管知道某基因的表達(dá)發(fā)生了變化，但無法知道這種變化的生理和病理學(xué)意義�；�因表達(dá)終極結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)和酶，才能實(shí)現(xiàn)其各項(xiàng)生理功能，但基因與蛋白質(zhì)功能并非完全平行，因此基因芯片技術(shù)還需要與其他檢測蛋白質(zhì)和酶的實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合。

5、DNA 的序列分析

核酸序列分析是指通過測定核酸序列來比較同源分子之間的相互關(guān)系的方法。比較不同類群個(gè)體的同源的核酸的核苷酸序列，據(jù)此建立分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并推斷類群間的演化關(guān)系，是目前分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育研究的熱點(diǎn)。DNA 序列分析可以保證使某一區(qū)段每個(gè)核苷酸位置上出現(xiàn)的變異都被發(fā)現(xiàn)。

直接測定DNA 序列可以測出所有的DNA 變異，從而獲得最為準(zhǔn)確的遺傳信息，但是這一技術(shù)耗資較大，目前DNA 樣品制備技術(shù)和DNA序列圖象的獲得及數(shù)據(jù)分析方法都不十分理想，序列數(shù)據(jù)本身存在的多重替換問題、協(xié)同進(jìn)化問題和序列進(jìn)化速率的變異等問題以及數(shù)據(jù)分析中的序列對(duì)準(zhǔn)方法的不足都使得它目前的應(yīng)用受到一定的影響。

6、核酸分子標(biāo)記的幾種方法比較

在幾種核酸分子標(biāo)記方法中只有RFLP和DNA指紋圖譜能夠提供雜合子的帶型，即共顯性遺傳，而其它的分子標(biāo)記如RAPD-PCR、AFLP為顯性遺傳，不能顯現(xiàn)雜合子。RFLP方法優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性高，重復(fù)性高，但需用放射性探針檢測，耗資較大。另外，RFLP需要的DNA 量較大（較RAPD 方法而言)，多態(tài)性出現(xiàn)率低，只能檢測內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上的變異，能提供的信息有限。原位雜交的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確直觀，在用整個(gè)基因組DNA或基因組特異重復(fù)序列作探針時(shí)，可以明顯區(qū)分不同物種的染色體組成，在鑒定遠(yuǎn)緣雜種染色體構(gòu)型和結(jié)構(gòu)變異，物種起源演化方面有重要作用。但原位雜交技術(shù)復(fù)雜，對(duì)操作要求較高。RAPD技術(shù)的特點(diǎn)：可以在對(duì)物種沒有任何分子生物學(xué)了解的情況下對(duì)物種的基因組進(jìn)行DNA片段多態(tài)性分析，并結(jié)合其他方法，通過統(tǒng)計(jì)分析，確定其在系統(tǒng)演化中和分類中的地位；RAPD 技術(shù)的引物種類很多，可以對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行地毯式多態(tài)分析，兩個(gè)基因組之間的微小差異也能被反應(yīng)出來；RAPD技術(shù)所需材料的量很少，便于對(duì)大量的小型昆蟲進(jìn)行研究；RAPD技術(shù)不需大型儀器，操作較方便，可以在一般實(shí)驗(yàn)室開展。AFLP技術(shù)的特點(diǎn)是：所需的DNA量少，不需Southern雜交，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)，每個(gè)AFLP反應(yīng)可以檢測的位點(diǎn)多達(dá)50～00個(gè)，多態(tài)性強(qiáng)，非常適宜于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、分子系統(tǒng)學(xué)研究,但實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，耗資大。核酸序列分析在系統(tǒng)發(fā)育分析中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠檢測出基因組的插入、缺失、點(diǎn)突變和轉(zhuǎn)座。

近年來測序與PCR及RFLP技術(shù)相結(jié)合，可以快速經(jīng)濟(jì)地測量大量個(gè)體，是今后有發(fā)展前途的方法�，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，每個(gè)基因均能以其自身特有的平均進(jìn)化速率，可用于不同水平的系統(tǒng)發(fā)育研究；不同基因間的進(jìn)化速率不同，同一基因不同區(qū)段的核苷酸的保守程度也不一樣，這種保守性與編碼蛋白質(zhì)或RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。快速進(jìn)化的基因或核苷酸區(qū)段（如mtDNA、rRNA的IGS 區(qū)域) 適合于種內(nèi)或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析；慢速進(jìn)化的基因（如rDNA及其產(chǎn)物rRNA)適合于遠(yuǎn)緣種類或高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育。

7、基因打靶技術(shù)

基因打靶（gene targeting)通常是指用含已知序列的 DNA片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源 DNA導(dǎo)入技術(shù)�；�因打靶的技術(shù)要點(diǎn)如下：基因打靶載體的構(gòu)建，把目的基因和調(diào)控序列等與內(nèi)源靶序列同源的序列都重組到帶標(biāo)記基因的載體上；打靶載體的導(dǎo)入，用電穿孔和顯微注射等方法將打靶載體導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)；同源重組子的篩選，用選擇性培養(yǎng)基篩選打靶重組陽性細(xì)胞；將重組陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并進(jìn)行性狀觀察和分子生物學(xué)檢測。基因打靶技術(shù)在寄生蟲學(xué)研究中有如下應(yīng)用：寄生蟲基因功能的研究、抗寄生蟲藥物的研究、抗寄生蟲免疫的研究和抗寄生蟲疫苗的研究。

基因打靶有如下特點(diǎn)：基因打靶能把外源基因引入染色體DNA的特定片斷上，在設(shè)計(jì)合理的情況下基因打靶可對(duì)宿主細(xì)胞染色體基因進(jìn)行精細(xì)的改造；基因打靶后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體DNA的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制�；�因打靶也還存在著不足，表現(xiàn)為打靶命中率低；外源基因?qū)�入�?xì)胞核內(nèi)的難度比較大；易受非同源重組隨機(jī)插入的干擾；靶細(xì)胞染色體如有缺失，則在缺失部分打靶是無效的。

第八節(jié) 蜱螨的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究

一、蜱螨基因組學(xué)研究

隨著人類基因組計(jì)劃（HGP)的開展，人體寄生蟲基因組研究也受到了廣泛的重視，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達(dá)序列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是從細(xì)胞中mRNA的角度來考慮的，從DNA-mRNA-蛋白質(zhì)，存在三個(gè)層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控（Transcriptional control)，翻譯水平調(diào)控（Translational control)，翻譯后水平調(diào)控（Post-translational control)，其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。1993年美國人類基因組研究中心對(duì) HGP作了修訂，修訂后的HGP將模式生物基因組列入了HGP的內(nèi)容，認(rèn)為通過對(duì)較為簡單的模式生物基因組的研究，可為人類基因的功能鑒定提供線索，并可從簡單的基因組分析入手建立技術(shù)積累經(jīng)驗(yàn)。人體寄生蟲是一類結(jié)構(gòu)較簡單的單細(xì)胞生物如原蟲或多細(xì)胞生物如蠕蟲，是研究模式生物較理想的材料。因此，人體寄生蟲基因組計(jì)劃也已成為人類基因組計(jì)劃中模式生物基因組研究重要內(nèi)容之一。

所謂基因組計(jì)劃是指對(duì)某個(gè)生物體的全部基因進(jìn)行核苷酸測序，在了解全基因的基礎(chǔ)上，研究每個(gè)基因或數(shù)個(gè)基因間相互作用和功能。人體寄生蟲基因組計(jì)劃的主要內(nèi)容包括基因的發(fā)現(xiàn)（gene discovery)、基因作圖（gene mapping)、基因的功能分析或稱功能基因組學(xué)（functional genomics)和生物信息學(xué)（bioinformatics)研究等。其中，基因序列測定和新基因的發(fā)現(xiàn)是人體寄生蟲基因組計(jì)劃的首要任務(wù)。常用的基因序列有兩種來源：（1)基因組序列掃描（GSSs)標(biāo)簽，由漂浮基因組序列產(chǎn)生（或隨機(jī)克隆或人工細(xì)菌染色體末端序列)；（2)表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs)，由來自寄生蟲生活史的一個(gè)或多個(gè)階段的mRNA表達(dá)產(chǎn)生。

現(xiàn)今世界范圍內(nèi)不少重要寄生蟲基因組已在研究之中，包括惡性瘧原蟲、曼氏血吸蟲、克氏錐蟲、布氏錐蟲、利什曼原蟲、艾美球蟲、弓形蟲、隱孢子蟲、溶組織內(nèi)阿米巴、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲、日本血吸蟲、馬來絲蟲及其它致病線蟲等。從最初階段網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的建立、作圖、資源的建庫，測序工作以基因發(fā)現(xiàn)為開端，很快發(fā)展到小片段染色體，現(xiàn)在則是整個(gè)成熟基因組階段，蛋白質(zhì)組學(xué)、功能分析、基因操作及微陣列分析都在不同的水平上進(jìn)行。

國外蜱螨基因組中以蜱的基因組研究較多，特別是傳播重要蟲媒病的蜱種，尤以線粒體基因組為多，詳細(xì)信息可從常見文獻(xiàn)檢索網(wǎng)站如Pubmed等上查詢。國內(nèi)蜱螨基因組的研究主要在功能基因組分析，如李朝品、楊慶貴等研究粉塵螨Ⅰ、Ⅱ類抗原（Der f1、Der f2)的cDNA克隆序列之間的差異。

二、蜱螨蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics)是近5年來發(fā)展起來的，2001年的Science雜志已把蛋白質(zhì)組學(xué)列為六大研究熱點(diǎn)之一。在后基因組時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對(duì)象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的策略和范圍

蛋白質(zhì)組學(xué)研究有兩種策略。一種可稱為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)，這種觀點(diǎn)從大規(guī)模、系統(tǒng)性的角度來看待蛋白質(zhì)組學(xué)，也更符合蛋白質(zhì)組學(xué)的本質(zhì)。但是，由于蛋白質(zhì)表達(dá)隨空間和時(shí)間不斷變化，要分析生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)是一個(gè)難以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。另一種策略可稱為“功能法”，即研究不同時(shí)期細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標(biāo)。這種觀點(diǎn)更傾向于把蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究生命現(xiàn)象的手段和方法。

2、蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

蛋白質(zhì)研究技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜而又困難的技術(shù)。不僅氨基酸殘基種類遠(yuǎn)多于核苷酸殘基（20/4)，而且蛋白質(zhì)有著復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化等。蛋白質(zhì)組的研究實(shí)質(zhì)上是在細(xì)胞水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的平行分離和分析，往往要同時(shí)處理成千上萬種蛋白質(zhì)。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。當(dāng)前在國際蛋白質(zhì)組研究技術(shù)平臺(tái)的技術(shù)基礎(chǔ)和發(fā)展趨勢(shì)有以下幾個(gè)方面：

利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量通過雙向凝膠電泳的方法將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開來是一種很有效的手段。它在蛋白質(zhì)組分離技術(shù)中起到了關(guān)鍵作用。如何提高雙向凝膠電泳的分離容量、靈敏度和分辨率以及對(duì)蛋白質(zhì)差異表達(dá)的準(zhǔn)確檢測是目前雙向凝膠電泳技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。國外的主要趨勢(shì)有第一維電泳采用窄pH梯度膠分離以及開發(fā)與雙向凝膠電泳相結(jié)合的高靈敏度蛋白質(zhì)染色技術(shù)，如新型的熒光染色技術(shù)。

質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)。它通過測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量來判別蛋白質(zhì)的種類。當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳－質(zhì)譜技術(shù)，即通過雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行鑒定。對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。一般的質(zhì)譜技術(shù)難以將三者合一，而最近發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)可以同時(shí)達(dá)到以上三個(gè)要求，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確和大規(guī)模的鑒定。

目前，二維色譜（2D-LC)、二維毛細(xì)管電泳（2D-CE)、液相色譜-毛細(xì)管電泳（LC-CE)等新型分離技術(shù)都有補(bǔ)充和取代雙向凝膠電泳之勢(shì)。另一方面以質(zhì)譜技術(shù)為核心，開發(fā)質(zhì)譜鳥槍法（Shot-gun)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS)等新策略直接鑒定全蛋白質(zhì)組混合酶解產(chǎn)物。隨著對(duì)大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究的重視，發(fā)展高通量和高精度的蛋白質(zhì)相互作用檢測技術(shù)也被科學(xué)家所關(guān)注。此外，蛋白質(zhì)芯片的發(fā)展也十分迅速，并已經(jīng)在臨床診斷中得到應(yīng)用。

3、蜱螨蛋白質(zhì)組的研究進(jìn)展

蜱螨蛋白質(zhì)組的研究尚處于起步階段，研究內(nèi)容較少。Madden RD等（2004)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析蜱的唾液分泌物，蜱的唾液是一類含有生物活性分子的復(fù)雜混合物，這些混合物包括能夠調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)以利于扁虱進(jìn)食的蛋白質(zhì)。由于蜱的唾液獲得量有限，因此用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)化學(xué)方法分析唾液中的蛋白受到了阻礙。最近，在二維凝膠電泳、質(zhì)譜分析、以及生物信息學(xué)方面取得的一些進(jìn)步，為分析少量蛋白質(zhì)樣本提供新的工具。用這些方法分析了取自花蜱美國種和斑點(diǎn)種唾液中的蛋白質(zhì)。通過注射多巴胺和茶堿誘導(dǎo)蜱分泌唾液。在用二維凝膠電泳分析唾液中的蛋白質(zhì)之前，必須現(xiàn)對(duì)唾液進(jìn)行脫鹽濃縮。比較一維和二維凝膠電泳圖，發(fā)現(xiàn)唾液中的主要構(gòu)成蛋白并沒有在二維凝膠電泳中出現(xiàn)。通過對(duì)唾液中的這種主要構(gòu)成蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這種蛋白與兩種蜱血淋巴中的主要構(gòu)成蛋白是相同的。雖然兩種蜱唾液的一維和二維凝膠電泳獲得的蛋白輪廓相似，但是在A maculatum 的電泳圖中出現(xiàn)了高濃度的低分子量蛋白。MALDI-TOF質(zhì)譜分析和western blot分析表明，在兩種蜱唾液中除了含量最豐富的分子量為95 kDa的蛋白外，其余探測到的所有蛋白均和宿主具有同源性。

Lai R等（2004)聯(lián)合應(yīng)用差別表達(dá)基因負(fù)向抑制雜交法和蛋白質(zhì)組學(xué)兩種方法從花蜱Hebraeum種的硬蜱中的血淋巴中鑒定出兩種非陽離子防衛(wèi)素樣的抗菌肽，命名為花蜱防衛(wèi)素肽1和花蜱防衛(wèi)素肽2。從蜱的synganglia（中樞神經(jīng)系統(tǒng))的差別表達(dá)cDNA文庫中分離出編碼這兩種防衛(wèi)素樣抗菌肽的每個(gè)cDNA克隆。從每個(gè)cDNA序列推導(dǎo)出預(yù)期蛋白含有92個(gè)氨基酸殘基。從已進(jìn)食過的雌蜱的血淋巴中純化出花蜱防衛(wèi)素肽2。純化的肽顯示了針對(duì)革蘭氏染色陰性和陽性細(xì)菌的抗菌活性�；�蜱防衛(wèi)素肽1則進(jìn)一步通過使用蛋白晶片捕獲裝置來鑒定。這種裝置主要是由SELDI-TOF（表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間)MS。通過對(duì)差別表達(dá)蛋白的篩選，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)食后的4天內(nèi)，花蜱防衛(wèi)素肽1的表達(dá)是正調(diào)節(jié)的。此發(fā)現(xiàn)首次提供了兩種防衛(wèi)素樣的抗菌肽和相應(yīng)的cDNA序列，這些抗菌肽在陰離子領(lǐng)域是特別新穎的。同時(shí)，對(duì)于研究差別表達(dá)蛋白特別是對(duì)于那些無法獲得基因組序列信息的機(jī)體，負(fù)向抑制雜交和蛋白輪廓的聯(lián)合應(yīng)用是一種有效的方法。