儀器分析-電子教材:第十二章其它儀器分析方法簡介

第十二章 其它儀器分析方法簡介

第一節(jié)  電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法

一、概述

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (inductively coupledplasma atomic emission spectroscopy ) 是以電感耦合等離子體作為原子化裝置和激發(fā)光源的原子發(fā)射光譜分析法。簡稱為ICP或ICP-AES。

等離子體是一種由自由電子、離子、中性原子與分子所組成的在總體上呈中性的電離氣體，利用高頻振蕩電流耦合導電氣體，形成外觀類似火焰的高溫電子和離子平衡的電離氣體，稱為電感耦合等離子體（ICP)。目前，用ICP作光源，激發(fā)樣品中各種元素的原子或離子進行元素的定性或定量分析，已得到了廣泛的應用。

利用電感耦合高頻等離子體（ICP)作為原子發(fā)射光譜的激發(fā)光源始于上世紀60年代。Greenfield 及Fassel首先發(fā)表了用ICP作為激發(fā)光源，進行原子發(fā)射光譜分析的研究成果。1975年世界上第一臺ICP-AES商品發(fā)射光譜儀問世，由于其線性范圍寬、具有多元素同時或順序測定的能力、分析速度快、化學干擾少等優(yōu)點，廣泛地用于地質(zhì)、冶金、機械等領域。但對某些元素來說其檢測限不如石墨爐原子吸收法，使其在醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)境、生命科學以及生物材料等方面的應用推廣受到一定的限制。九十年代以來，ICP-AES的研究取得顯著成績。如水平(端視)ICP-AES的出現(xiàn)，中階梯光柵與固體檢測器的結(jié)合使用，使ICP—AES法的檢測限得到很大改善，一些元素的檢測限甚至低于石墨爐原子吸收法，從而成為多元素痕量分析主要方法。ICP-AES在衛(wèi)生檢驗中應用廣泛，如美國已將ICP-AES法作為水與廢水分析的標準分析法。

二、ICP-AES的基本原理

（一)ICP的形成

ICP焰炬裝置由高頻發(fā)生器和感應線圈、炬管和工作氣體三部分組成。炬管的結(jié)構(gòu)如圖12-1所示。高頻發(fā)生器的作用是產(chǎn)生高頻磁場以供給等離子體能量。應用最廣泛的是利用石英晶體壓電效應產(chǎn)生高頻振蕩的發(fā)生器，其頻率和功率輸出穩(wěn)定性高。頻率多為27~50 MHz，最大輸出功率通常是2~4kW。感應線圈由高頻電源耦合供電，當高頻電流通過感應線圈時，產(chǎn)生垂直于線圈平面的高頻磁場。采用特斯拉（Tesla)線圈放電“引燃”氬氣，使之發(fā)生部分電離。電離產(chǎn)生的離子和電子在高頻磁場和由電磁感應而產(chǎn)生的高頻電場的共同作用下作形成渦流，并在運動中與氬氣原子相互碰撞，使它們進一步電離，使電子和離子的密度急速增大，在炬管口形成等離子體。強大的感應電流產(chǎn)生高溫，瞬間使氬氣形成溫度可達10000K的等離子焰炬。炬管是由三個同軸的石英管組合而成(圖12-1)，三個管內(nèi)均通入氬氣，外管通入氬氣用以冷卻炬管壁，并使等離子體炬離開炬管口，以免燒壞炬管，同時也起穩(wěn)定等離子體炬的作用；中間管通入氬氣用以點燃和維持等離子體炬；而內(nèi)管通入的氬氣作為載氣，用以攜帶試樣進入等離子體炬。工作氣體一般要求不與樣品組分發(fā)生化學反應、不因分子離解而消耗能量、譜線簡單并具有良好的激發(fā)性能。因此常采用氬氣

圖12-1  ICP炬管的結(jié)構(gòu)示意圖

（二)ICP發(fā)射光譜的產(chǎn)生

用ICP-AES法測定樣品時，常用溶液進樣、氣化進樣和固體進樣等方法將待測試樣導入ICP裝置，并通過炬管的內(nèi)管被載氣帶入等離子體炬中。試樣中各組分在高溫熱能的作用下，被原子化，能量足夠高時原子中的電子會脫離原子核的束縛力，電離成為離子。同時原子、離子外層的電子吸收外界能量，從能級最低的基態(tài)躍遷到較高能級的激發(fā)態(tài)上。處于激發(fā)態(tài)的原子、離子是十分不穩(wěn)定的，它會在極短的時間內(nèi)從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)或其它較低的能級，并以輻射的形式釋放出多余的能量，經(jīng)光柵或棱鏡分光后，得到的光譜線，分別稱為中性原子線和離子線。各種元素各自具有一定波長的特征譜線，由于光譜線的強度正比于試樣中待測原子的濃度，所以可以通過測量其強度進行定量分析。圖12-2表示試液進入ICP焰后的變化過程

圖12-2試液進入ICP焰后的變化過程

三、ICP-AES的儀器裝置

  ICP-AES的儀器裝置主要由ICP激發(fā)光源、進樣系統(tǒng)、分光系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，儀器組成的方框示意圖及儀器裝置示意圖如圖12-3、12-4所示。

圖 12-3 ICP-AES 儀器組成示意圖

圖 12-4 ICP-AES的儀器裝置示意圖

ICP激發(fā)光源主要由高頻發(fā)生器和感應線圈、繞有感應線圈的炬管和供氣系統(tǒng)三部分組成。供氣系統(tǒng)由氬氣鋼瓶、壓力和流量調(diào)節(jié)控制裝置構(gòu)成，為炬管的各管路提供壓力和流量穩(wěn)定的氬氣氣流。高頻發(fā)生器可產(chǎn)生較高頻率和較大功率的高頻振蕩電流。高頻振蕩電流的電能通過銅管制成的感應線圈耦合到炬管中的氬氣，產(chǎn)生等離子體炬。銅管內(nèi)要通水冷卻。繞有銅管感應線圈的炬管置于具有高頻防護功能的炬室內(nèi)，點燃等離子體炬前，關(guān)好炬室門，通過門上的觀察窗觀察火炬的點燃情況。

在作ICP-AES測定時，試樣由進樣系統(tǒng)導入，進樣方式有溶液進樣、氣化進樣和固體進樣，可選擇手動進樣或自動進樣。固體進樣可免去樣品預處理過程，不使用溶劑，空白值低，有利于降低檢測限。但樣品粒度要求較高，進樣穩(wěn)定性較差，基體干擾較大。氣化進樣使待測元素生成氣態(tài)物質(zhì)，從而與絕大部分基體分離，降低基體對測定的影響，檢測限得到很大的改善，特別適于能生成易揮發(fā)氣體的元素測定。溶液進樣是ICP-AES最常用的進樣方式，樣品溶液被吸入進樣系統(tǒng)后，由霧化器在霧化室中將試樣霧化，霧化形成的氣溶膠由載氣導入等離子體火炬中，大的霧滴則由廢液管排出。溶液進樣具有進樣速率穩(wěn)定，基體影響小，標準與樣品易匹配等優(yōu)點，已廣泛應用于各個領域ICP-AES分析。

試樣中的各種元素原子在等離子體炬中經(jīng)高溫激發(fā)，發(fā)射出具有各自特征的電磁波，經(jīng)分光系統(tǒng)作色散處理后，形成特征譜線。ICP-AES中的分光系統(tǒng)一般采用各種光柵為色散元件，如最新的分光系統(tǒng)是采用大面積全息光柵等。經(jīng)光柵分光后的譜線進入檢測系統(tǒng)，將光信號轉(zhuǎn)換成了相應的電信號。不同類型的ICP-AES儀器所配置的光電檢測系統(tǒng)有所不同，以單狹縫、單個光電倍增管作光電檢測器的儀器稱為單道掃描型光譜儀，其優(yōu)點是結(jié)構(gòu)簡單，可根據(jù)需要任意選定元素和特征譜線進行測定，缺點是一次只能檢測一條譜線，對于多組分待測，檢測速度較慢。按波長順序設置多個出口狹縫，每一個狹縫對應某一條特征譜線和一支光電倍增管，可同時測定多個元素，采用這種檢測方式的儀器稱為多道型光譜儀。多道型光譜儀的優(yōu)勢是檢測速度快，但由于通道的數(shù)目受光電倍增管的體積和儀器空間所限制，不可能太多；同時通道是預先確定的，一旦確定，很難更改，使靈活性受到很大限制。近年來，推出了全譜直讀型ICP-AES儀器。這種類型儀器的光電檢測系統(tǒng)采用了先進的新型光學多道檢測器，如二極管陣列電荷轉(zhuǎn)移裝置（CTD)、電荷耦合器件(CCD)以及電荷注入裝置（CID)等光電檢測器，可將從紫外到可見區(qū)域的全部波長范圍的譜線同時檢測并轉(zhuǎn)換成電信號，產(chǎn)生的電信號由計算機處理轉(zhuǎn)換為相應的濃度，能在35秒鐘內(nèi)測定73個元素。

四、ICP-AES的應用和展望

自從第一代ICP-AES儀器在70年代初問世以來，ICP-AES已經(jīng)過了30多年的理論及應用研究，成為科學界公認的理想的元素分析方法。由于早期ICP-AES方法對某些元素如砷、硒、鉛的檢測限明顯不如石墨爐原子吸收光譜法，因而限制了其在各個領域的應用與推廣。自90年代以來，ICP-AES儀器不斷改進，其檢出限得到改善，且價格大幅降低。目前已在醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)保、科研、生物材料及臨床分析等各個領域得到了越來越廣泛的應用。

在食品衛(wèi)生分析中，Pb、As、Cu、Hg等多種元素為國標規(guī)定所必須分析的元素，由于ICP-AES具有可進行多元素同時測定、簡便、快速、準確等優(yōu)點，克服了原子吸收法測定繁瑣、費時的缺點，因而在食品分析中應用廣泛。但由于食品樣品的復雜性，基體效應和光譜干擾嚴重。因此消除光譜干擾．降低基體的影響成為ICP—AES分析必須關(guān)注的課題。

在環(huán)境衛(wèi)生分析中，環(huán)境樣品中痕量元素的分析尤其是環(huán)境中有毒、有害元素的分析一直是衛(wèi)生檢驗工作者所關(guān)注的課題。水質(zhì)分析中一般水樣可在加入穩(wěn)定劑后，直接測定。對于含鹽高的水樣，需要經(jīng)過樣品預處理，如采用配位萃取等方法將待測元素分離富集后測定；對于含有機物多的水樣需在測定前用硝酸和高氯酸將有機物分解后測定；對于各種沉積物、粉塵及煤灰等固體樣品的分析，可采用固體進樣技術(shù)或?qū)�樣品�?jīng)過分解和制備后，進樣測定。

在生物材料檢驗中，由干樣品復雜，直接用ICP-AES分析的樣品有限。近年來，隨著電熱蒸發(fā)(ETV)技術(shù)、流動注射(FI)技術(shù)以及化學蒸氣發(fā)生(CVG)技術(shù)的應用，使ICP-AES的進樣系統(tǒng)有了很大的改善，提高了分析靈敏度，ICP-AES在生物材料和臨床分析領域的應用也得到推廣。毒物分析是衛(wèi)生檢驗的一項十分重要的內(nèi)容。傳統(tǒng)的毒物分析往往根據(jù)目視判斷是否是陽性或陰性。由于實際毒物樣品的復雜性，因此容易導致假象，得出錯誤的結(jié)論。ICP-AES作為一種常規(guī)的分析技術(shù)，對金屬元索具有良好的選擇性。因此將ICP-AES應用于毒物分析具有準確、快速的優(yōu)點。

為了進一步提高分析測定的靈敏度，消除基體影響和譜線干擾，近年來，相繼出現(xiàn)了一些將ICP與其它一些分析手段聯(lián)用的技術(shù)，并推出了新的儀器裝置，例如電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)、電感耦合等離子體原子熒光光譜儀(ICP-AFS)、傅里葉變換等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-FT)、色譜-ICP-AES等，其中應用最成熟和最廣泛的儀器裝置是ICP-MS，由于質(zhì)譜儀的測定靈敏度比原子發(fā)射光譜儀更高，同時可克服譜線干擾等一些原子發(fā)射光譜的缺點，ICP-MS對大多數(shù)元素測定檢測限可比ICP-AES低1～2個數(shù)量級，具有高靈敏度、高選擇性、線性范圍寬等優(yōu)點，也可作多元素同時測定。ICP-MS已被一些發(fā)達國家列為無機元素的常規(guī)分析手段之一。  

  （高希寶)

第二節(jié) 流動注射分析法

流動注射分析法 (flow injection analysis, FIA) 是丹麥學者Ruzicka和Hansen于1975年首次提出的，是一種溶液快速連續(xù)分析技術(shù)。與建立在平衡體系基礎上的分析方法不同，F(xiàn)IA是把試樣溶液直接以“試樣塞”的形式注入管道內(nèi)試劑流中，在物理和化學非平衡動態(tài)條件下進行測定的分析方法。該法具有分析速度快、分析精度高、儀器設備簡單、操作方便和試樣用量少等優(yōu)點，易于自動化，已在衛(wèi)生檢驗、環(huán)境保護和臨床醫(yī)學等領域得到廣泛應用。

一、流動注射分析法的基本原理

(一) 流動注射分析的基本流程

流動注射分析裝置如圖12-5a所示，包括：蠕動泵（P)，用于驅(qū)動載流流動；樣品注入閥，用于可重現(xiàn)地將一定體積的樣品（S)注入載流；混合反應器（L)，樣品在其中分散并與載流中試劑反應，生成可檢測的產(chǎn)物；檢測器（D)，用于檢測反應產(chǎn)物，產(chǎn)生響應信號；記錄儀，用于記錄響應信號隨時間的變化曲線。

圖12-5  FIA流程和輸出記錄曲線示意圖

FIA分析過程是將一定體積的液體樣品間歇性地注入到一定流速的載流（反應試劑或蒸餾水)中，注入的樣品由載流攜帶以“試樣塞”的形式向前勻速流動。由于對流和分子擴散作用，“試樣塞”被載流分散成具有一定濃度梯度的試樣帶。在反應器中，試樣帶中的被測組分與載流中的試劑發(fā)生化學反應，生成可供檢測的產(chǎn)物，被傳送到檢測器進行檢測。連續(xù)記錄檢測信號（如吸光度、電極電位、熒光強度等)，得到一峰形信號曲線，如圖12-5b所示。一定條件下輸出信號峰的峰高H或峰寬W或峰面積A與被測物濃度有關(guān)，可作為定量分析的依據(jù)。

在FIA中，載流的作用一是推動“試樣塞”進入反應管道及檢測器；二是尾隨試樣帶自動清洗反應管道和檢測器，為下一個試樣的檢測做好準備。FIA系統(tǒng)所獨有的自動、簡單、快速的清洗方式，是其分析速度快的主要原因。

如圖12-5b所示，從注入樣品到峰值出現(xiàn)的時間稱為留存時間，用T表示。在留存時間內(nèi)試樣與載流試劑之間同時發(fā)生了兩個動力學過程。一是試樣在載流中的物理分散過程；二是試樣與試劑發(fā)生化學反應過程。了解這些過程的機制有利于優(yōu)化流路設計，提高采樣頻率，降低消耗，充分利用化學反應，提高靈敏度。

(二) 物理分散過程

注入的試樣除隨載流流動外，在載流中還發(fā)生了“對流”和“分子擴散”兩種物理過程，總稱為分散過程。

1．對流  液體緩慢流過導管時，流體截面各處軸上流速是不相同的，由于層間摩擦力作用，管壁附近部分流速慢，管心部分流速快，自身形成“對流”。對流導致試樣帶形成長長的拖尾（見圖12-6 a)，引起試樣帶之間發(fā)生交叉污染。

2．分子擴散　溶液內(nèi)存在濃度差時，分子從高濃度向低濃度方向的遷移現(xiàn)象稱為分子擴散。由于對流，造成了導管內(nèi)同一截面上試樣分子濃度不同，將發(fā)生徑向分子擴散（圖12-6 b)，試樣帶中B點的分子將向管壁附近擴散，而A點分子將向管中心擴散。這種分子擴散對于對流起了修正作用，因此，試樣在載流中物理分散過程的總結(jié)果如圖12-6 c所示。

圖12-6 FIA中對流與分子擴散示意圖

物理分散程度直接影響信號曲線的峰形。主要影響因素有：載流流速、進樣方式、管徑、留存時間和擴散系數(shù)等。其中影響最大的是載流流速，流速快，對流加大，峰寬增大。但實驗中保持條件相同時，其物理分散過程都是重復的。

3．分散系數(shù)  Ruzicka提出用分散系數(shù)（dispersion coefficient)來描述試樣帶在載流中的物理分散程度，可表示為

（12-1)

式中，D—分散系數(shù)，c₀—分散前樣品溶液原始濃度(mol/L)，c_max—分散后通過檢測器時樣液最高濃度(mol/L)。分散程度可分為三種：D=1～2時，為低分散度；D=3～10時，為中等分散度；D＞10時，為高分散度。分散系數(shù)是FIA系統(tǒng)的重要參數(shù)，應根據(jù)不同的分析目的和檢測方法，選擇不同的分散系數(shù)。

(三) 化學反應過程

絕大多數(shù)FIA是基于化學反應。在反應器中，樣品中待測組分與載流試劑發(fā)生化學反應生成檢測器可響應的反應產(chǎn)物。在留存時間內(nèi)產(chǎn)物濃度愈大，檢測信號愈強。但在FIA中，化學反應過程是進行不完全的或非平衡的，因此動力學因素影響很大。若發(fā)生的反應為

那么在樣品帶中，隨著時間的推移，樣品組分A的濃度、載流試劑R的濃度和反應產(chǎn)物P的濃度均在不斷變化，其變化情況如圖12-7所示�？梢姰a(chǎn)物P的濃度在一定時間后可達到最高點P_max，為了獲取最大靈敏度，一般選用P_max所對應的時間為留存時間T。最佳留存時間需經(jīng)實驗篩選優(yōu)化，一般通過選擇反應器管道長度，改變各種試劑流量來確定，有時甚至采用停流技術(shù)來達到最佳化。

圖12-7組分A、試劑R、產(chǎn)物P的濃度在FIA中的變化曲線

二、流動注射分析的裝置

流動注射分析的裝置一般由載流驅(qū)動系統(tǒng)（蠕動泵)、進樣閥、混合反應器、檢測器和記錄系統(tǒng)組成。

(一)載流驅(qū)動系統(tǒng)

蠕動泵（peristaltic pump)的作用是輸送載流試劑溶液和試樣溶液，是FIA的心臟部件。蠕動泵要求：保持恒定的載流流速，流速不受粘度變化或其他阻力的影響；能瞬時停止和啟動，便于精確控制；泵的內(nèi)體積小，清洗時間短。

常用的多滾筒式蠕動泵工作原理如圖12-8所示，沿著壓板圓周方向轉(zhuǎn)動的一系列滾筒不斷擠壓富有彈性的塑料軟管，當每個滾筒向前滾動時，兩滾筒之間的塑料軟管在兩個擠壓點之間會形成負壓，由此將液體抽吸或提升，使液體在軟管內(nèi)連續(xù)流動。當滾筒的滾動速度一定時，管內(nèi)液體的流動速度也將恒定。

圖12-8蠕動泵工作原理示意圖

蠕動泵可分為單道蠕動泵和多道蠕動泵。多道蠕動泵能夠按各管內(nèi)徑的比例泵出液體，所以也稱為比例泵。蠕動泵的軟管材料大多采用Tygon塑料制成，可用來輸送蒸餾水、稀酸、稀堿溶液等。如果需使用濃酸和有機溶劑作截流時，則應使用Acidflex材料的泵管。

除蠕動泵外，還可以采用柱塞往復泵或高位瓶來輸送液體。

(二) 進樣閥

在FIA中，試樣溶液必須以完整的“試樣塞”形式注入載流中，試樣與試劑間的混合完全由運動中受控制的擴散與對流過程來實現(xiàn)，因此，進樣過程中必須避免試樣與試劑混合。進樣時要求：①注入的試樣應當“嵌入”載流，形成完整的試樣帶；②注入試樣體積重現(xiàn)性好；③進樣器的死體積��；④注入試樣時對載流的流動狀態(tài)干擾小。

目前廣泛使用旋轉(zhuǎn)式進樣閥。該進樣閥有兩個操作位置：采樣位置和進樣位置。其工作原理如圖12-9a所示，由一個帶有定容腔的轉(zhuǎn)子和旁路管道組成，當進樣閥旋轉(zhuǎn)至采樣位置（如圖中垂直方向)時，載流由旁路管道流過，以保持FIA系統(tǒng)載流的連續(xù)流動，而試樣充滿定容腔。當進樣閥旋轉(zhuǎn)至進樣位置（如圖中水平方向)時，因旁路管阻力較大，載流將經(jīng)阻力較小的定容腔流過，同時將一定體積的試樣（S)帶進反應系統(tǒng)。

圖12-9 旋轉(zhuǎn)式進樣閥工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖

進樣閥用有機玻璃和聚四氟乙烯制成，其結(jié)構(gòu)如圖12-9b所示，是由兩個定子（1、3)和一個夾在兩個定子中間的轉(zhuǎn)子（2)所組成，通過中間軸將三者相對固定，其中轉(zhuǎn)子可在一定角度轉(zhuǎn)動。轉(zhuǎn)子上有一個定量孔，當轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)到采樣位置時，試液由上面定子的進樣口（4)注入定量孔，多余的試液從下面定子的出口（5)排出，當轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動到進樣位置后，定量孔與試劑載流接通，試樣被載流帶入反應系統(tǒng)中，完成進樣。

為了滿足各種不同分析要求，現(xiàn)已設計制造出多通道、多功能進樣閥，以及各種自動進樣閥，這些進樣閥的基本原理、作用及注入方式基本相同。

(三)混合反應器(mixing reactor)

注入的試樣在載流中進行控制性的分散，以試樣帶的形式由載流帶入混合反應器，在混合反應器中試樣與載流中某些試劑發(fā)生化學反應，形成可被檢測的物質(zhì)。在FIA中，混合反應器實際上是連接進樣口和檢測器之間的管道，因此又稱為“管式反應器”。

反應器管內(nèi)徑一般為0.4～1.0mm，最常用為0.5mm。管內(nèi)徑過大會增大擴散，使單位時間內(nèi)允許分析的樣品數(shù)減少；管內(nèi)徑過小則易堵塞，系統(tǒng)阻力大。管道長度應根據(jù)分析對象而定，試樣與試劑反應慢者應使用較長的反應器管道，反應快的可使用較短的反應器管道。

管式反應器類型主要有直管反應器、盤管反應器及編織反應器等。盤管反應器又稱反應盤管，將內(nèi)徑為0.3～0.8mm的聚四氟乙烯細管盤繞在外徑為3～5cm的圓筒上而制成，它可以減少“試樣塞”的軸向擴散，從而提高進樣頻率和測定靈敏度。反應盤管應該固定在支持物上，盡量減少幾何形狀的變化，以避免流動狀態(tài)變化，影響方法的精密度。編織反應器是由塑料細管按一定方式編織而成。編織反應器中截流的流動方向是在三維基礎上變化，所以有較強的限制軸向分散的功能，不僅用于反應管，而且還用于采樣環(huán)或傳輸管道。

單珠串反應器的反應管內(nèi)填充有玻璃球（直徑約為反應管內(nèi)徑的60%～80%)。此反應管內(nèi)“試樣塞”的分散程度很小，比同規(guī)格直管反應器小十倍左右。當反應管總長為1.5m左右，內(nèi)徑約為0.6mm時，采用普通蠕動泵作載流動力，其管道內(nèi)可以容納2～3個試樣帶而無交叉污染。

(四)檢測系統(tǒng)

能用于FIA的檢測器種類多，適用于不同的分析目的，這正是FIA適用性強的特點。檢測器要求噪音水平低、線性范圍寬、響應速度快和靈敏度高等。應用最多的是光學檢測器和電化學檢測器。

1．FIA光學檢測器 FIA中光學檢測法常有光度法、熒光法、化學發(fā)光法、火焰原子吸收法和電感偶合等離子體光譜法。后兩種與FIA聯(lián)用時較為方便，只需將通向霧化器的管道與反應器管連接即可。常用的光學檢測器是帶有流通池（流通式液槽)的紫外-可見分光光度計、熒光分光光度計或化學發(fā)光儀。流通池應避免死角，以防止載流試液滯留和截留氣泡，影響方法重現(xiàn)性。通常流通池的光徑為10mm，內(nèi)徑為1.5mm，充液體積為18μl。

快速掃描光電二極管陣列檢測器應用于FIA，與專用計算機聯(lián)用，形成了連續(xù)自動同時測定多組分的分光光度法分析系統(tǒng)，有效拓寬了FIA的應用范圍。

2．電化學檢測器  電化學檢測器應用較多的是離子選擇性電極檢測器，噴流式電極是最早應用于FIA的電極之一。選擇好指示電極與參比電極，將二者插入傾斜一定角度放置的噴流式池內(nèi)，試樣溶液通過導管噴出，先流經(jīng)上方的指示電極，再流到已浸入流出液中的參比電極。調(diào)節(jié)排液管高度來控制流出液液面并保持恒定不變。若同時插入幾種指示電極，可同時測定多種組分，方法簡便快速。

使用離子選擇性電極檢測器時，并未達到穩(wěn)定的電極電位，這須嚴格控制電極表面的試液量及流過的時間在每次測量中都完全一致，才能達到很高的分析精度。選擇使用響應快速的離子選擇性電極，可以提高方法靈敏度，降低檢出限。

(五)記錄系統(tǒng)

流動注射分析中檢測器的輸出信號一般由記錄儀記錄，記錄儀裝有自動記錄和數(shù)字顯示裝置。典型的FIA輸出信號是尖形峰，一般情況下，峰高與待測物濃度成正比，作為定量分析的基礎。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，流動注射分析與計算機技術(shù)聯(lián)用，由計算機進行操作控制，可直接記錄圖譜、收集信息和處理數(shù)據(jù)，使流動注射分析法自動化程度大為提高。

三、流動注射分析法的應用

1.流動注射分光光度法 流動注射分光光度法是FIA應用最廣泛的領域，表12-1為列出了部分應用實例。

表12-1  流動注射分光光度法應用實例

2.流動注射化學發(fā)光法 應用固定化酶填充反應器技術(shù)，結(jié)合化學發(fā)光反應，F(xiàn)IA普遍用于生化檢測。表12-2列舉某些應用實例。這種方法既能保持酶反應的高度選擇性，又能通過將昂貴的生物酶固定化后重復使用，降低成本。

表12-2   固定化酶FIA應用實例

四、流動注射分析法的特點

FIA技術(shù)發(fā)展非常迅速。其特點有：①分析速度快，效率高，一般可達100～200份/h；②精密度高，相對標準偏差在1%左右；③設備簡單，條件較好的實驗室可以自行組裝；④試樣用量少，單次進樣一般為數(shù)微升或數(shù)十微升；⑤自動化程度高，條件控制和數(shù)據(jù)處理都可由計算機完成，可大大減輕勞動強度；⑥適應性強，能與多種檢測技術(shù)結(jié)合；⑦應用廣泛，易于推廣，在衛(wèi)生檢驗、臨床化學分析和環(huán)境科學領域中具有廣闊的應用前景。

（李貴榮)

第三節(jié) 化學發(fā)光分析法

利用化學反應所產(chǎn)生的分子發(fā)光現(xiàn)象建立起來的分析方法稱為化學發(fā)光分析法(chemiluminescenceanalysis)。某些物質(zhì)分子吸收了化學反應產(chǎn)生的化學能而被激發(fā)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，發(fā)射一定波長的光，這種現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。根據(jù)發(fā)射光的特征和強度可對該物質(zhì)進行定性定量分析�；瘜W發(fā)光與光致發(fā)光不同的是，發(fā)光時不需要外輻射源。

一、基本原理

（一)化學發(fā)光反應及激發(fā)態(tài)分子的產(chǎn)生

化學發(fā)光反應的產(chǎn)生必須滿足三個條件。第一反應必須是自發(fā)的（⊿G＜0)并放出足夠的能量以產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子。反應放出的能量必須滿足:

其中為化學發(fā)光反應的焓變；為受激分子發(fā)出光的波長。一般≥170~300kJ／mol，才能在可見光范圍觀察到化學發(fā)光。通常氧化還原反應所釋放的能量介于其中，因此，大多數(shù)化學發(fā)光反應為氧化還原反應。第二，必須有利于形成激發(fā)態(tài)分子的反應歷程。第三，激發(fā)態(tài)分子去活化過程必須是以光子發(fā)射釋放能量。

某些化學反應能釋放出足夠的能量使反應的中間體或產(chǎn)物或受體分子由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子釋放出光子，產(chǎn)生化學發(fā)光，其過程可表示如下：

其中A是產(chǎn)生化學發(fā)光的母體反應物，B是參加發(fā)光反應的其它反應物，I是中間體，P是產(chǎn)物，F(xiàn)是受體分子。前兩種反應歷程也表明發(fā)光組分可以是中間體也可是反應產(chǎn)物。第三種反應歷程中F不是化學反應的參加者而是化學反應釋放能量的受體分子，受體分子F獲得能量后處于激發(fā)狀態(tài)然后再釋放出光子，這種情況被稱為增敏化學發(fā)光。

（二)化學發(fā)光強度與濃度的關(guān)系

化學發(fā)光的光量子效率()取決于受激分子的生成效率()和受激分子的發(fā)光效率()，前者為后兩者的乘積。受激分子的生成效率是產(chǎn)生受激分子占母體反應物分子的份額，受激分子的發(fā)光效率則是發(fā)射出的光子數(shù)占受激分子的份額。

化學發(fā)光的光量子效率()定義為：

  (12-2)

式中：N_a為阿伏加德羅常數(shù)。

由式12-2可見，化學發(fā)光的光量子效率一定的情況下，反應體系發(fā)出的光子數(shù)與反應物的量有關(guān)。反應物的量又取決于反應速率，因此，一個化學反應體系的化學發(fā)光的強度依賴于化學發(fā)光的光量子效率和反應動力學。

式12-3給出了t時刻的化學發(fā)光強度與發(fā)光反應速率的關(guān)系：

 (12-3)

式中：為t時刻的發(fā)光強度(光子／秒)；為分析物的反應速率(即化學發(fā)光物母體的消失速率，單位為反應分子數(shù)／秒)；為化學發(fā)光的光量子效率。

在將反應物混合后，由于化學發(fā)光物母體的不斷消耗，化學發(fā)光強度將隨反應時間而衰減，化學發(fā)光強度隨反應物混合時間變化的關(guān)系曲線如圖12-10所示。

圖12-10   化學發(fā)光強度隨反應物混合時間變化的關(guān)系曲線

當化學發(fā)光反應的實驗條件確定時，在一定的濃度范圍內(nèi)，最大發(fā)光強度與待測物的初始濃度成正比，其關(guān)系可表示為：

   （12-4)

式中：C為待測物的濃度(mmol／L)；K在一定實驗條件下是一個常數(shù)；為最大發(fā)光強度。

（三)化學發(fā)光的影響因素

化學發(fā)光的分析性能受所有參與化學反應的組分和發(fā)射組分的發(fā)光特性的影響�？刂苹瘜W反應條件是十分重要的。影響化學發(fā)光的主要因素有化學反應速度、反應試劑混合速度和發(fā)光增敏劑。

1．反應速度  化學發(fā)光強度在一定條件下與化學反應速度成正比。如果反應速度慢，發(fā)生微弱慢發(fā)光，則幾乎測不到光的信號。對同一個反應體系，如果能改變反應條件加快反應速度，發(fā)光能在瞬間完成，就可以測到一個較強的信號，化學發(fā)光分析的靈敏度與反應速度直接相關(guān)。影響反應速度的因素諸如溫度、濃度、pH、競爭反應、共存物質(zhì)的催化或抑制作用等都會影響發(fā)光分析。

2．混合速度  化學發(fā)光的強度在反應開始時逐漸增加，這是由于試劑混合需要一定時間或反應處于誘導期，達到最大值后信號開始下降，這是由于試劑的消耗和化學發(fā)光的光量子效率隨時間改變引起的�；旌纤俣扔绊懟瘜W發(fā)光反應過程動力學，也就影響體系的反應速度，最終影響到化學發(fā)光的強度，因此，在化學發(fā)光分析檢測時必須嚴格控制反應體系的混合速度和混合方式，以確保化學發(fā)光反應體系的穩(wěn)定。

3．發(fā)光敏劑  在化學發(fā)光反應中加入某種發(fā)光增敏劑，可使發(fā)光體系的發(fā)光強度大大增加，且發(fā)光衰減緩慢，增加了發(fā)光檢測的靈敏度和特異性，提高了檢測的穩(wěn)定性。常見的發(fā)光增敏劑有鹵酚類，如對碘苯酚、對溴苯酚等；萘酚類，如-萘酚、-溴--萘酚等；酚代用品，如對碘基苯酚，胺衍生物類，如3-氨基熒蒽，以及6-羥基苯并噻唑衍生物類，如蟲熒光素、脫氫熒光素等。例如用辣根過氧化物酶(HRP)標記生物大分子，H₂O₂作氧化劑，在魯米諾-HRP-H₂O₂體系中加入發(fā)光增強劑對碘苯酚，能使發(fā)光強度增大1000倍以上。

二、化學發(fā)光測量儀器

（一)化學發(fā)光儀的主要部件

化學發(fā)光儀主要由三部分組成：樣品室(即反應室)、檢測系統(tǒng)、信號處理系統(tǒng)，其示意圖見圖12-11。

圖12-11化學發(fā)光儀示意圖

1．樣品室 樣品室也稱流通池，其作用是提供化學發(fā)光物質(zhì)的反應室。樣品室必須置于密封的暗室中，以便有效地隔離任何雜散光，避免對檢測信號產(chǎn)生干擾。樣品室與光電倍增管之間應設有保護光電管陰極的快門，并配有精密的加樣器。加樣器準確與否直接影響到分析結(jié)果，常用的加樣器有間歇加樣器或斷流加樣器和流動注射加樣器（見圖12-12)等。另外樣品室必須便于清洗或更換，以避免樣品檢測時交叉污染。

圖12-12 間歇加樣器和流動注射加樣器

2．檢測系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)主要包括光電倍增管和負高壓電源。。在化學發(fā)光檢測中光電倍增管的測光方式有直流方式和交流方式兩種。交流方式也就是光子計數(shù)法，在檢測微弱光時將是行之有效的方法。光電倍增管必須安裝在干燥并始終處在黑暗的環(huán)境中，否則噪聲及暗電流將驟增。優(yōu)質(zhì)的光電倍增管上附有冷卻室，電磁場屏蔽以及高性能的前置放大器等，大大改善了檢測性能。光電倍增管的工作電壓就是外加在陰極和陽極之間的負高壓，一般在500V—1500V之間。工作電壓通過一個分壓器回路分壓到各倍增極。負高壓電源的穩(wěn)定對光電倍增管增益影響很大，所以要求負高壓電源穩(wěn)定性必須優(yōu)于0.1%。對微弱發(fā)光體系，負高壓電源穩(wěn)定性應達0.05％以上，負高壓越高光電倍增管的增益越大，發(fā)光測量的靈敏度越高。

3．數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 化學發(fā)光儀使用的數(shù)據(jù)處理方式很多。早期的發(fā)光儀采用模擬數(shù)據(jù)在電表上顯示或用記錄儀記錄，隨著計算機技術(shù)的迅速發(fā)展，給儀器的信號處理帶來很大方便，計算機處理內(nèi)容豐富，速度快，結(jié)果準確。

(二) 化學發(fā)光儀的類型

化學發(fā)光儀按檢測器的工作方式可分為二類：直流電壓型發(fā)光儀和交流光子計數(shù)型發(fā)光儀。

1．直流電壓型發(fā)光儀  早期市售液相化學發(fā)光儀多為注射進樣的直流電壓型發(fā)光儀，放大器為直流放大。在樣品室中快速混合樣品和試劑后，測量化學發(fā)光強度隨時間的變化輪廓。定量分析信號可以用峰高，也可以用混合點開始經(jīng)過一個固定延滯時間的積分信號或者整個峰的積分(面積)。該儀器最大的特點是儀器簡單。

2．光子計數(shù)型發(fā)光儀  光子計數(shù)型發(fā)光儀如圖12-13所示，在弱發(fā)光體系中光電倍增管輸出的信號為各個離散的脈沖狀態(tài)，以各脈沖數(shù)作為信號，經(jīng)脈沖高度甄別器將其與噪聲脈沖分離，有很好的穩(wěn)定性和信噪比，因此有較高的靈敏度和重現(xiàn)性，線性范圍寬，特別適合于微弱發(fā)光體系定量分析。

圖 21-13光子計數(shù)型發(fā)光儀示意圖

三、化學發(fā)光分析技術(shù)

（一)化學發(fā)光體系

在化學發(fā)光分析中，發(fā)光體系是一個重要的部分。在不斷的研究與實踐中，人們發(fā)現(xiàn)了許多化學發(fā)光的發(fā)光體系，在生命科學研究領域應用較多體系的有以下幾種。

1．魯米諾發(fā)光體系  魯米諾是最早發(fā)現(xiàn)和應用最多的化學發(fā)光化合物，傳統(tǒng)的魯米諾發(fā)光體系一般由發(fā)光劑(魯米諾、異魯米諾等)、氧化劑和催化劑組成， 其反應機理如下。

2．吖啶類化合物體系  光澤精是第一個被發(fā)現(xiàn)有化學發(fā)光性質(zhì)的吖啶類化合物，現(xiàn)在研究和應用較多的是吖啶類化合物，這類化合物在有Ｈ₂Ｏ₂和ＯＨ^-存在時能迅速產(chǎn)生化學發(fā)光。光澤精的化學發(fā)光機制為：

  3．其它發(fā)光體系  其它類化學發(fā)光體系還有咪唑類，苯酚類化合物、芳基草酸酯類以及1、2－二氧環(huán)乙烷衍生物等，也己廣泛應用于生物學、醫(yī)學研究和臨床實驗診斷工作。

（二)測定條件選擇

在化學發(fā)光分析中影響測定的主要因素有混合方式和混合的時間以及合適的反應條件。

1．混合方式和混合時間

（1)多數(shù)化學發(fā)光反應有較快的動力學速度，化學發(fā)光瞬間消失。對于間歇注樣方式的發(fā)光儀進樣后的混合方式將直接影響測定結(jié)果，采用自動進樣可以獲得更好的重現(xiàn)性�；旌戏绞娇梢岳�用進樣力，也可以借助磁力攪拌或攪拌器加速混合。為了防止信號損失，混合和測定應同時在光電倍增管的窗前進行。

（2)流動注射進樣的混合時間可用混合管到流通池的距離來調(diào)節(jié)，根據(jù)化學發(fā)光體系的反應速度選擇合適的混合管長度。蠕動泵應盡可能均勻，流速恒定，以保證有效地混合并獲得最佳的檢測信號。

2．反應條件的選擇

（1)緩沖溶液的選擇：由于pH值對化學發(fā)光反應的發(fā)光強度影響很大，對不同的發(fā)光體系，通過試驗確定最佳pH范圍，選擇合適的pH緩沖溶液。

（2)發(fā)光反應試劑濃度的選擇：在發(fā)光反應體系和化學發(fā)光的光量子效率一定的情況下，化學發(fā)光的強度取決于化學反應動力學。參與化學發(fā)光反應的試劑是影響化學反應動力學的主要因素，化學發(fā)光強度隨反應試劑的濃度增大而增大，但必須考慮濃度大時的背景干擾和試劑浪費。因此，在滿足分析要求的同時盡可能減少試劑的用量。

（3)試劑純度：所用試劑應純化，以減小化學發(fā)光的背景發(fā)射。

（三)定量分析方法

化學發(fā)光定量分析的依據(jù)是在一定的條件下發(fā)光體系的發(fā)光強度與待測組分的濃度呈線性關(guān)系，其公式為：

常用定量方法有標準曲線法、直接比較法和標準加入法。均適用于化學發(fā)光定量分析，本節(jié)不再贅述。

四、化學發(fā)光分析的特點及應用

（一)化學發(fā)光分析的特點

1．靈敏度高 由于化學發(fā)光過程沒有其它光源產(chǎn)生的雜散光及背景發(fā)射的影響，因此，化學發(fā)光分析靈敏度較高。通常的化學發(fā)光體系，檢測限可達10^-15mol，對于一個具有高量子產(chǎn)率，低本底值的化學發(fā)光劑，檢測限甚至可達10^-18mol－10^-24mol。發(fā)光分析法靈敏度高，使分析單個細胞成為可能。

2．線性范圍寬 化學發(fā)光分析的動態(tài)響應范圍有一個很寬的線性范圍(3～6數(shù)量級)。例如：鉻(Ⅲ)催化魯米諾-過氧化氫化學發(fā)光體系測量鉻(Ⅲ)線性范圍從10^-5-10^-11g／ml。

3．操作簡便、快速  流動注射分析(FIA)以快速、精密、操作簡便，節(jié)省試劑及適應性廣而著稱，將FIA與高靈敏度的化學發(fā)光分析結(jié)合，分析速度可達120～200樣次/小時，操作簡便、快速，在分析監(jiān)測上的應用也愈來愈廣。

4．無放射性 化學發(fā)光分析為免疫分析提供了新的手段，即化學發(fā)光免疫分析法，化學發(fā)光免疫分析法是將化學發(fā)光試劑，酶(催化劑)或者熒光物質(zhì)標記到抗原(抗體)上，通過特異性免疫反應與抗體(抗原)結(jié)合后，用化學發(fā)光反應測定標記物的化學發(fā)光強度，以確定被標記的抗原(抗體)的量，該法以其高靈敏度、無放射性危害，有良好的穩(wěn)定性，其標記的抗原抗體在-20℃可保存半年到一年左右，實用面寬等特點，克服了放射性同位素的所有不足，已成為放射免疫分析最有力的競爭者。

5．價格低廉 根據(jù)化學發(fā)光原理研制和生產(chǎn)的發(fā)光計，結(jié)構(gòu)簡單、操作方便，價格低廉。實驗室也可利用各種分光光度計、液體閃爍儀自行改裝。當然成型的發(fā)光計更為實用。

(二) 化學發(fā)光分析的應用

1．無機物分析  利用金屬離子對化學發(fā)光反應的催化作用或?qū)�化學發(fā)光反應的抑制作用，是無機物化學發(fā)光分析基礎。應用魯米諾發(fā)光體系可以測定的無機物有Cr³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Mo、V、W、U、NO、SO、CN^—等。

2．有機物的測定  有機化合物可以有多種形式參與化學發(fā)光反應，如被測組分作為反應物、催化劑、猝滅劑、能量接受體等參與化學發(fā)光反應。利用化學發(fā)光分析已測定了苊、芘、蒽、苯并芘、苯并蒽、兒茶酚胺、去甲腎上腺素和多巴胺等物質(zhì)。

3．生物醫(yī)學領域研究  將酶促反應與化學發(fā)光反應相偶合，以生物分子作為測定對象，把生物能量轉(zhuǎn)化為化學發(fā)光信號而輸出，通常稱為化學發(fā)光生物傳感器。該方法利用酶法分析的特效性克服了化學發(fā)光分析選擇性差的不足，從而使它兼有化學發(fā)光分析的靈敏性和酶法分析的專屬性。這類傳感器中以檢測H₂O₂的為主。許多酶能催化底物氧化或還原并產(chǎn)生或消耗H₂O₂， 將這些酶固定化作為接受器，辣根過氧化物酶作為換能器，己廣泛應用于生物樣品中葡萄糖、脲酸、乳酸、膽固醇、氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、膽堿、乙酰膽堿、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤等測定。

化學發(fā)光免疫分析法將是化學發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合而建立的一類新方法。它同時具有化學發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。該方法是用化學發(fā)光反應的試劑(可以是發(fā)光劑或催化劑等)標記抗原或抗體，標記后的抗原和抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應和理化步驟(如離心分離，洗滌等)，最后以測定發(fā)光強度形式測定待測物的含量。化學發(fā)光免疫分析法廣泛用于臨床上腫瘤標志物(如：甲胎蛋白、癌胚抗原等)、甲狀腺功能(如甲狀腺素、游離甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸等)、生殖內(nèi)分泌激素(如催乳素、黃體生成素、卵泡刺激激素等)、糖尿病標志物(如胰島素、血清C肽等)以及皮質(zhì)醇、總lgE、生長激素（GH)等檢測。

（康維鈞  李珊)

第四節(jié)  毛細管電泳分析法

毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)，又稱高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是一類以毛細管為分離通道，高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。毛細管電泳興起于20世紀八十年代，是電泳和現(xiàn)代色譜相結(jié)合的產(chǎn)物，是分析科學中繼高效液相色譜之后的又一重大進展，它的出現(xiàn)使分析科學得以從微升水平進入納升水平。毛細管電泳不僅用于小分子物質(zhì)分離測定，而且可以解決大分子物質(zhì)分離分析難題，甚至使單細胞、單分子分析成為可能。

一、毛細管電泳基本概念和原理

（一)毛細管電泳分析系統(tǒng)

毛細管電泳系統(tǒng)的流程示意圖見圖12-14。毛細管內(nèi)通常充以緩沖溶液或者凝膠高分子溶液，管的兩端插入置放有電極的緩沖溶液中。通過一定方式將樣品引入毛細管內(nèi)，然后施加電場對樣品進行分離。分離后的組分由毛細管末端的檢測器予以檢測。檢測信號經(jīng)放大器放大，再由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理后定性、定量。

圖12-14毛細管電泳系統(tǒng)的流程示意圖

（二)基本概念

電泳過程基于離子在電場中的遷移，在適當?shù)臈l件下，不同離子有不同的遷移速率，與色譜相似，其分離過程也是差速過程。毛細管電泳分離模式多樣，分離機制各有所不同，現(xiàn)以毛細管區(qū)帶電泳為代表介紹其基本概念和原理。

1．電泳和淌度 帶電粒子在電場作用下于一定緩沖溶液中向電荷相反的方向定向遷移稱為電泳（electrophoresis)，單位電場下的電泳速度稱為淌度(mobility)。

對于球形離子，在一定介質(zhì)中，淌度m_e大小與離子的半徑r、電荷q及溶液粘度h有關(guān)。推導可得：

電場中離子電泳的遷移速度v_e等于電場強度E和溶質(zhì)淌度m_e的乘積。即：

(12-5)

式12-5表明，當電場強度一定時，不同的離子電泳淌度不同，因而在電場中移動的速度不同。大小相同的離子，所帶電荷越多，遷移速度越快；電荷相同的離子，離子半徑越小，遷移速度越快。這就是區(qū)帶電泳分離不同離子的基礎。

2.電滲  電滲是毛細管中的溶液在外加電場作用下發(fā)生的定向流動的現(xiàn)象。電滲的產(chǎn)生與雙電層有關(guān)，雙電層是由毛細管內(nèi)壁表面產(chǎn)生的在電場作用下也不遷移的離子或帶電基團吸引溶液中相反電荷離子形成。如常用的石英毛細管柱，當pH>3時，由于硅羥基（ºSiOH)的離解，柱內(nèi)表面帶負電荷，這些負電荷吸引溶液中的正電荷離子，使其聚集在自己的周圍形成雙電層。固液界面存在的雙電層使得靠近管壁的溶液層中形成高出溶液本體的“自由”正離子，它們在電場中向陰極遷移，遷移中通過碰撞等作用給溶劑分子施加單向的推力，使之同向運動，因而整個毛細管柱內(nèi)的溶液形成一個圓筒形的塞流，即如圖12-15所示的電滲流(electroosmotic flow，EOF)。

圖12-15電滲流示意圖

常用的毛細管管材中，除石英和玻璃外，一些有機材料如聚四氟乙烯由于殘留羧基，其表面也帶負電荷，結(jié)果都產(chǎn)生指向陰極的電滲，因而通常情況下電滲流從陽極流向陰極。毛細管內(nèi)電滲流的速度可用電滲速度n_EOF表示，單位電場強度下的電滲速度稱為電滲淌度(m_EOF)， 它們和電場強度E關(guān)系如下：

 (12-6)

計算公式與電泳的淌度公式近似，顯然，電滲可看成電泳的特殊形式。由此可見，離子在毛細管電泳中同時受電泳和電滲的作用而遷移，離子遷移的速度應當是兩種速度的矢量和，見式12-7：

(12-7)

在毛細管電泳中，電滲速度約比電泳速度大一個數(shù)量級，所以能使所有樣品組分同向泳動。正離子電泳方向與電滲流方向一致，流出速度最快；中性分子隨電滲流遷移，彼此不能分離；負離子電泳方向與電滲流方向相反，流出速度最慢，因此，在檢測器可依次檢測到陽離子、中性分子和陰離子。

由電場驅(qū)動產(chǎn)生的毛細管電滲流與高效液相色譜中由泵壓產(chǎn)生的液流不同，它為平頭塞狀，不會引起樣品區(qū)帶展寬，而高效液相色譜為拋物狀流形(見圖12-16)。故毛細管電泳具有高柱效和高分離效能。

圖12-16電滲流與HPLC流形比較示意圖

在毛細管電泳中，電滲流對分離效率有重要影響，對不同分離模式的毛細管電泳有不同的影響，有的須強化，有的須盡可能地克服，或須調(diào)節(jié)其大小使其更有利于組分的分離。影響電滲流的因素有多種，如緩沖液的離子強度、介質(zhì)粘度、介質(zhì)pH、溫度、有機改性劑、表面活性劑、中性親水高聚物及管壁的涂漬等。

3．毛細管的總長度和有效長度  毛細管柱的實際長度為毛細管的總長度，從進樣點到檢測點的毛細管長度，稱為毛細管的有效長度(effective length)。用柱上光度檢測，則毛細管有效長度一般比總長度短5~10cm。用柱后檢測，其有效長度與總長度相等。遷移時間和淌度由有效長度確定，電場強度由總長度確定。

4．遷移時間 一種溶質(zhì)從進樣點遷移至檢測點所需時間稱為遷移時間(migration time)，相當于色譜分析中的保留時間t_R ，它等于從進樣點到檢測點的距離（l)除以遷移速度（v_e)：

  (12-8)

式中，L— 毛細管總長度，V— 外加電壓。

（三)譜帶展寬和分離效率

毛細管電泳與色譜均為分離分析方法，分離過程均為差速遷移，在功能和結(jié)果顯示上非常相似，因此可用與色譜相似的理論和方法來描述，如色譜中的塔板理論和速率理論、保留值、分離度等均可用于毛細管電泳中，但由于兩種方法的分離原理不同，在應用時須注意它們的差別。

1．柱效能指標

毛細管電泳的柱效能指標可用色譜理論塔板數(shù)n和塔板高度H表示：

式中， —半峰寬。

對于柱上檢測的毛細管電泳來說，記錄器上顯示峰最高點時，溶質(zhì)尚未流出毛細管柱，與色譜法中在柱后檢測有區(qū)別，因此，用遷移時間代替色譜法中的保留時間，用毛細管的有效長度代替色譜柱的總長度。

毛細管電泳的理論板數(shù)n還可以表示為下式：

（12－9)

式中，D —溶質(zhì)的擴散系數(shù)。

由上式可見，提高毛細管兩端電壓，增加毛細管有效長度有利于提高分離效率。擴散系數(shù)小的分子分離效率高，大分子物質(zhì)較小分子物質(zhì)擴散系數(shù)小，所以毛細管電泳適合蛋白質(zhì)、DNA等大分子物質(zhì)。

2．譜帶展寬

毛細管電泳譜帶展寬與柱內(nèi)溶液和溶質(zhì)本身有關(guān)，也與進樣和檢測等柱外因素有關(guān)。

(1) 縱向擴散：溶質(zhì)在毛細管內(nèi)沿遷移方向的擴散稱為縱向擴散。縱向擴散程度可由下式表示：

 (12-10)

式中，s —標準偏差。

在高電場下，縱向擴散由溶質(zhì)的遷移時間和擴散系數(shù)所決定。溶質(zhì)在毛細管中停留的時間越短，擴散越小；擴散系數(shù)小的大分子(如蛋白質(zhì)、DNA等)比小分子的區(qū)帶分散程度低。

(2) 焦耳熱和溫度梯度：電流通過毛細管柱時產(chǎn)生的熱稱為焦耳熱。電壓升高將使功率增大、溫度上升。由于毛細管壁的散熱使得毛細管中心溫度高于管壁溫度，在毛細管內(nèi)徑向產(chǎn)生溫度梯度而引起緩沖溶液的粘度差異從而破壞平頭塞狀溶質(zhì)區(qū)帶，造成峰擴張。為減小峰擴張，采用細內(nèi)徑、粗外徑的毛細管，管外涂低熱導率的聚酰亞胺，適當降低外加電壓，減少緩沖溶液的濃度及對毛細管恒溫等措施可以減少溫度梯度效應，從而提高柱效能。

(3) 進樣塞長度：在進樣過程中，如果樣品塞長度超過因擴散造成的區(qū)帶分散，柱效能降低。進樣長度一般為毛細管總長度的1％~2％。

(4)吸附：吸附是指毛細管壁對溶質(zhì)粒子的作用。由于毛細管壁帶有負電荷，吸引陽離子溶質(zhì)，尤其是對大分子的吸附更強烈。吸附對組分峰的擴張及分離影響很大，應盡可能抑制。在盡可能低的pH下分析、增加緩沖溶液的濃度、使用添加劑或?qū)γ�細管壁改性處理，可以減少或消除管壁上的電荷而抑制吸附。

(5)電分散作用：樣品區(qū)帶和緩沖溶液的電導差異可以引起各區(qū)帶中電場強度的變化，從而導致峰形畸變，這種現(xiàn)象稱為電分散作用。對于含有淌度范圍寬的溶質(zhì)樣品，畸變則特別明顯，只有通過緩沖溶液與樣品的電導之間的匹配才能消除電分散作用。

3．分離度  是指將淌度相近的組分分開的能力，同色譜法，在電泳圖上讀出兩相鄰峰的遷移時間和它們的峰寬（W)，按下式計算：

下標1，2代表相鄰兩物質(zhì)，分離度與柱效的關(guān)系有如下關(guān)系式：

（12－11)

式中，—相鄰兩組分淌度均值

上式表明，毛細管電泳的分離度正比于兩組分的淌度差，還與外加電壓、有效柱長與總柱長比等因素有關(guān)。

由于毛細管電泳樣品區(qū)帶非常窄，不同溶質(zhì)微小的淌度差異足以實現(xiàn)完全分離，因而毛細管電泳的分離度很高。

二、毛細管電泳的分離模式

根據(jù)毛細管內(nèi)分離介質(zhì)和分離原理不同可以將毛細管電泳分為毛細管區(qū)帶電泳(capillary zoneelectrophoresis，CZE)、毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF)、毛細管等速電泳(capillary isotachorphoresis，CITP)、膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC) 、無膠篩分毛細管電泳（capillary non-gel seivingelectrophoresis, NGCE)、親和毛細管電泳（affinity capillaryelectrophoresis, ACE)、毛細管凝膠電泳(capillary gelelectrophoresis，CGE)、和毛細管電色譜（capillary electrochromatography, CEC)等多種分離模式，CGE和CEC的毛細管內(nèi)有填充物，前幾種模式毛細管內(nèi)為自由溶液，以下簡單介紹幾種主要分離模式。

（一)毛細管區(qū)帶電泳（CZE)

毛細管區(qū)帶電泳是在電場作用下，溶質(zhì)在毛細管內(nèi)以不同速率遷移形成分立的區(qū)帶而達到分離的電泳技術(shù)。CZE的分離機理是基于樣品組分荷質(zhì)比間的差異，毛細管內(nèi)為緩沖溶液，組分因荷質(zhì)比不同而得到分離。

CZE是毛細管電泳中最簡單、使用最早、也是應用最廣泛的一種分離模式，通常被認為是其它分離模式的母體。其特征是用同一種緩沖液充滿整個系統(tǒng)，緩沖液里通常會添加一些添加劑來調(diào)整分離效果。其在氨基酸、多肽、陰陽離子、有機化合物對映體分析以及蛋白質(zhì)的純度鑒定、變體篩選和構(gòu)象分析等方面有廣泛的用途。

（二)毛細管等電聚焦(CIEF) 

毛細管等電聚焦是利用蛋白質(zhì)或多肽物質(zhì)等電點（pI)的不同而實現(xiàn)分離的毛細管電泳技術(shù)。陰、陽電極槽分別灌入堿性與酸性溶液，把兩性電解質(zhì)和蛋白質(zhì)樣品的混合溶液壓入毛細管內(nèi)，當加上電壓后，在電場作用下形成一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度，蛋白質(zhì)順著這一梯度遷移到等電點位置，失去電荷而停止遷移，產(chǎn)生一個非常窄的區(qū)帶，這個過程稱為等電聚焦 ( isoelectricfocusing )。不同的蛋白質(zhì)等電點不同，則聚焦在不同的位置而達到分離。蛋白質(zhì)若進入不同于等電點的pH區(qū)域內(nèi)，就會帶上電荷，在電場力作用下又會遷移到pH等于等電點的位置，所以蛋白質(zhì)總能聚焦在很窄的區(qū)帶內(nèi)。等電聚焦過程可以利用系統(tǒng)電流來指示，當完成聚焦達到穩(wěn)定狀態(tài)后，系統(tǒng)電流指示為零。然后通過從毛細管一端施加壓力或在一個電極槽中加入鹽的方法移動溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)，使已聚焦的蛋白質(zhì)或多肽區(qū)帶通過檢測器而被檢測。

CIEF具有極高的分辨率，等電點差異小于0.01 pH單位的兩種蛋白質(zhì)也可以得到分離，其在蛋白質(zhì)pI值的測定、異構(gòu)體的分離等蛋白質(zhì)分析中有很好的應用前景。

（三)膠束電動毛細管色譜(MECC)

膠束電動毛細管色譜是在緩沖液中加入高于膠束臨界濃度的表面活性劑進行修飾的分離技術(shù)。在膠束臨界濃度以上，表面活性劑（陰、陽及兩性離子表面活性劑)分子間的疏水基團聚集在一起形成外層親水而內(nèi)層疏水的膠束，內(nèi)層疏水部分可以結(jié)合或容納疏水組分（如中性分子)，外層親水部分是帶電荷的基團，電場作用下，整個膠束也因電泳作用而以與周圍介質(zhì)不同的速度遷移。在此，膠束相當于液相色譜中的固定相，因其是移動的，所以被稱為準固定相(quasi—stationary phase)，而緩沖溶液為流動相。電泳和色譜相結(jié)合使MECC分離具有顯著特點，不僅可以分離離子型組分，中性組分因和膠束結(jié)合而帶電荷也可被分離。各組分基于與膠束作用強弱，即和準固定相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。

膠束電動毛細管色譜已廣泛應用于氨基酸、肽類、維生素、有機化合物和環(huán)境污染物等的分離分析。此外，在表面活性劑中加入手性中心則可用于手性化合物的分離。

（四)毛細管凝膠電泳(CGE)和無膠篩分毛細管電泳（NGCE)

毛細管凝膠電泳是以裝在毛細管內(nèi)的凝膠作為支持物的區(qū)帶電泳技術(shù)。凝膠是由顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和凝聚在其中的溶劑所組成的物質(zhì)，具有分子篩的作用，對溶質(zhì)的電泳遷移過程有阻礙作用，分子越大，所受阻礙越大，遷移速度越慢。因而根據(jù)被測組分的荷質(zhì)比和分子體積不同而進行分離。

CGE中常用的聚合物有凝膠和線型聚合物兩大類，其中凝膠有共價交聯(lián)型(如交聯(lián)聚丙烯酰胺)和氫鍵型(如瓊脂)，以前者使用最為廣泛。CGE柱制備較困難，柱壽命短，隨后發(fā)展出“無膠篩分”技術(shù)，用線性非交聯(lián)的親水性聚合物代替高黏度的交聯(lián)聚合物，如線性聚丙烯酰胺、甲基纖維素、聚乙烯醇等物質(zhì)，當溶解于水且達到一定濃度即形成動態(tài)網(wǎng)絡，從而起到分子篩作用，按分子大小分離各組分，此即NGCE分離基礎。NGCE方法簡單、方便，但分離能力較CGE差。

目前，CGE和NGCE在分子生物學和蛋白質(zhì)化學研究等方面有較好的應用，如核苷酸純度分析、特征基因分析、PCR擴增產(chǎn)物分析、DNA限制性片斷分析、蛋白質(zhì)分離分析等。

三、毛細管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)

毛細管電泳儀包括進樣、分離、檢測和數(shù)據(jù)處理等部分。其基本結(jié)構(gòu)如圖12-14所示。

（一)進樣系統(tǒng)

由于毛細管內(nèi)徑十分細小，進樣體積只有納升級，所以不能使用液相色譜法的進樣方式，采用無死體積進樣方法，讓毛細管直接與樣品接觸，借重力、電場力或其它作用力使樣品流入毛細管。目前商品儀器最常用的進樣方法有靜壓力進樣和電動進樣。靜壓力進樣可通過在毛細管進樣端加壓，或在檢測端抽真空，也可采用虹吸作用進樣。電動進樣是在加電壓的條件下，樣品組分由電遷移和電滲流進人毛細管中。此外，還有擴散進樣，利用濃差擴散原理將樣品分子引入毛細管。

（二)分離系統(tǒng) 

分離系統(tǒng)由毛細管、恒溫系統(tǒng)、高壓電源和緩沖液瓶等組成。毛細管長一般10~100cm、內(nèi)徑25～100mm，管材可以是聚四氟乙烯、玻璃和石英，石英以其雜質(zhì)少、非氫鍵吸附少等優(yōu)點被作為主要使用的材料。在其外壁涂覆聚酰亞胺以增強彈性和減小散熱性。溫度對溶液粘度有影響，從而引起遷移時間變化，所以，毛細管電泳系統(tǒng)需在恒溫條件下使用，常用空氣恒溫或液體恒溫方法，恒溫精度可達±0.1℃。為獲得遷移時間的高度重現(xiàn)性，須使電壓穩(wěn)定在±0.1％。

（三)檢測系統(tǒng)

由于毛細管內(nèi)徑細小和溶質(zhì)區(qū)帶體積極微，所以對檢測器靈敏度的要求很高。毛細管電泳的檢測器最常用的是紫外檢測器，一般采用柱上檢測（on-column detection),也可以柱后檢測。紫外檢測器有固定波長、可變波長、二極管陣列和波長掃描等檢測方式，其中，后兩種檢測方式均可提供時間～波長～吸光度值三維圖譜，有利于定性和峰的純度檢測等。紫外吸收檢測器靈敏度一般為10^-5～10^-9mol／L，其通用性強，可適合大多數(shù)有機物的檢測。其它還有熒光檢測器、激光誘導熒光(Laser induced Fluorescence，LIF)檢測器、電化學檢測器、質(zhì)譜檢測器等。其中激光誘導熒光檢測器不僅靈敏度高，而且選擇性好。其靈敏度高達10^-11～10^-16mol／L，可檢出單細胞和單分子，但被測物質(zhì)須先用熒光試劑標記或染色。質(zhì)譜檢測器還可提供被測組分分子結(jié)構(gòu)等信息。

（四)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 

毛細管電泳儀的數(shù)據(jù)記錄、圖譜形式和數(shù)據(jù)處理方法與色譜儀基本相同。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)多采用電子計算機及專用軟件對分析過程進行實時記錄，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后通過顯示器或打印機輸出分析結(jié)果。

四、毛細管電泳的應用

毛細管電泳技術(shù)具有分離效率高、速度快、靈敏、樣品用量少、成本低、易于自動化和應用范圍非常廣泛的特點。特別是近年來毛細管電泳芯片技術(shù)的發(fā)展，更拓展了它的應用范圍。以下舉例說明其應用。

1．幾種農(nóng)藥的毛細管電泳分離測定  有機磷農(nóng)藥是膽堿酯酶抑制劑, 對人體具有較高的毒性, 因此對它們進行有效快速分析具有重要意義。克百威、水胺硫磷、甲基對硫磷和對硫磷這4 種農(nóng)藥，除了克百威外均難溶于水, 其中甲基對硫磷和對硫磷又為電中性有機磷農(nóng)藥，使用毛細管區(qū)帶電泳方式難以使其分離, 需采用膠束電動色譜法，加入膠束（十二烷基硫酸鈉)增溶, 并使中性化合物的溶質(zhì)在水相和膠束相間分配系數(shù)不同而得到分離。分離譜圖見圖12-17。

圖12-17  土壤中4種農(nóng)藥的毛細管電泳分離圖譜

2．有機酸的測定   有機酸測定在食品、生化、環(huán)境等領域具有重要意義。傳統(tǒng)的離子色譜法通常只能分離測定C2～C4 二元羧酸. 而GC/ MS 法測定雖然十分有效,但是需要繁瑣的樣品衍生化預處理過程， 毛細管電泳為測定有機酸提供了新的技術(shù)選擇。圖12-18是C1~C8正構(gòu)羧酸毛細管電泳色譜圖。

圖12-18　毛細管電泳分離8種有機酸的圖譜

1.甲酸，2. 乙酸，3. 丙酸， 4. 丁酸，5. 戊酸，6. 己酸，7.庚酸，8. 辛酸

 (康學軍)

第五節(jié)　質(zhì)譜法及其聯(lián)用技術(shù)

一、概述

質(zhì)譜法（mass spectrometry, MS)是將被測物質(zhì)離子化，并按離子的質(zhì)荷比大小進行分離，測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。

1906年英國物理學家J.J.Thomoson發(fā)明了質(zhì)譜，起初只是作為無機化學中研究同位素的分析工具。20世紀40年代以后質(zhì)譜開始用于有機化合物的分析，發(fā)展成為有機質(zhì)譜。60年代出現(xiàn)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，使質(zhì)譜儀的應用領域發(fā)生了巨大的變化，開始成為有機物分析的重要儀器。80年代后，由于軟離子化技術(shù)相繼問世及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的發(fā)展，使質(zhì)譜的應用拓展到分析高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定樣品的范圍，應用到生物大分子研究，發(fā)展成為生物質(zhì)譜，并迅速成為現(xiàn)代分析化學最前沿的領域之一。

質(zhì)譜法具有分析速度快、靈敏度高及可以提供樣品分子的相對分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點，已成為生物和生物化學、食品化學、毒物學、藥物學、醫(yī)學等領域進行分析和科學研究的有力手段，特別是在蛋白質(zhì)組學研究方面發(fā)揮著巨大的作用。

二、有機質(zhì)譜

（一)有機質(zhì)譜原理

將氣態(tài)的樣品分子置于高真空中，在高速電子流或強電場的作用下，失去外層電子而生成分子離子（molecular ion)，或化學鍵斷裂生成不同質(zhì)量的碎片離子（fragment ion)。分子離子是指失去一個電子而帶正電荷的分子（用表示，或簡寫為)；碎片離子是指分子中某些化學鍵斷裂而生成的質(zhì)量較小的帶正電荷的離子。這些離子在質(zhì)量分析器中按質(zhì)荷比大小順序分開，經(jīng)檢測器檢測，可得到化合物的質(zhì)譜圖。根據(jù)質(zhì)譜圖中峰的位置進行定性分析，峰的強度進行定量分析，以此獲得化合物的分子量及其它有關(guān)結(jié)構(gòu)信息。

常見的質(zhì)譜圖是經(jīng)計算機處理的棒圖（bar graph)，圖中每一個棒（每一條線段)代表一種質(zhì)量的離子。圖12-19是毒鼠強的質(zhì)譜圖。橫坐標表示離子的質(zhì)荷比，縱坐標表示離子的相對強度（或稱為相對豐度)。

圖12-19　毒鼠強的質(zhì)譜圖

目前，已建立了十幾萬至幾十萬個有機化合物標準質(zhì)譜圖的數(shù)據(jù)庫。分析一個未知物，得到質(zhì)譜圖后，可以通過計算機進行譜庫檢索，查得該質(zhì)譜圖對應的化合物，方便、快捷、省力。但如果數(shù)據(jù)庫中沒有此化合物，或得到的樣品的質(zhì)譜圖有其它干擾組分，檢索結(jié)果會出錯，此時必須輔助其他定性方法才能確定化合物的結(jié)構(gòu)信息。

（二)有機質(zhì)譜儀

質(zhì)譜儀類型各不相同，但儀器的組成都基本相同。電離裝置：將樣品分子電離為離子；分析裝置：使不同質(zhì)荷比的離子分開；檢測器：將離子流轉(zhuǎn)變成電信號。為了獲得良好的分析質(zhì)量，必須避免離子損失，因此凡有樣品分子及離子存在和通過的地方，必須處于真空狀態(tài)。

質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)如圖12-20所示。

圖12-20　質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖

1. 真空系統(tǒng)　高真空系統(tǒng)是使質(zhì)譜儀正常工作的保障系統(tǒng)。質(zhì)譜儀的樣品導入系統(tǒng)、電離源（離子源)、質(zhì)量分析器、檢測器等主要部件均需在真空狀態(tài)下工作，電離源真空度應達1.3×10^－4～1.3×10^－5Pa，質(zhì)量分析器中真空度應達1.3×10^－6Pa。其目的是為了避免電離源燈絲損壞、離子散射、離子與殘余氣體分子碰撞引起能量變化、本底增高、副反應過多。一般質(zhì)譜儀采用機械泵預抽真空后，再用擴散泵連續(xù)運行保持真空狀態(tài)，新型質(zhì)譜儀可用分子泵以獲得更高的真空度。

2. 樣品導入系統(tǒng)　由于質(zhì)譜儀的電離源、質(zhì)量分析器安裝在真空腔里，樣品只有通過特定的方法和途徑才能被導入到電離源，并被離子化，然后被引入質(zhì)量分析器進行質(zhì)量分析。完成樣品導入任務的部件統(tǒng)稱為樣品導入系統(tǒng)。將樣品導入電離源的方法決定于樣品的物理性質(zhì)，如熔點、蒸汽壓等，樣品導入方式可分為直接法和間接法m.gydjdsj.org.cn/yaoshi/。

（1)直接法：適合于揮發(fā)性較低、熱穩(wěn)定性好的樣品。將揮發(fā)性較低的單組分樣品（固體或液體)直接裝在探針上，將探針送入真空腔，進入電離源內(nèi)，然后給探針通大電流加熱，使探針的溫度急劇上升(一般不超過400℃)。樣品分子受熱后揮發(fā)形成蒸汽，被電離源離子化。直接法是最常用的進樣方法，所需樣品量很少，一般只需要幾納克樣品。

（2)間接法：目前質(zhì)譜樣品導入系統(tǒng)發(fā)展較快的是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的接口技術(shù)，用以將色譜流出物導入質(zhì)譜，經(jīng)離子化后供質(zhì)譜分析。這種進樣系統(tǒng)的研究熱點之一是質(zhì)譜和色譜之間的接口技術(shù)，將在下面的內(nèi)容中介紹。

3. 電離源　又稱離子源。電離源的功能是將樣品導入系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉(zhuǎn)化成離子。目前質(zhì)譜儀中，有多種電離源可供選擇，如電子轟擊電離源、化學電離源、大氣壓化學電離源、電噴霧電離源及基體輔助激光解吸電離源等。

（1)電子轟擊電離源（electron impact, EI)：氣化后的樣品分子進入離子化室后，受到由鎢或錸燈絲（標準工作條件下燈絲被加以70eV的固定電壓)發(fā)射并加速的高能電子流的轟擊，生成分子離子和碎片離子。由于被電離的分子主要生成正離子和少量負離子，因此質(zhì)譜法主要研究陽離子。在電離源中推斥極的作用下陽離子進入加速區(qū)被加速，并被聚集成離子流引入質(zhì)量分析器，而陰離子和中性碎片等則被真空抽出系統(tǒng)。電子轟擊質(zhì)譜能提供有機化合物最豐富的結(jié)構(gòu)信息，有較好的重現(xiàn)性，其裂解規(guī)律的研究也最為完善，已經(jīng)建立了數(shù)萬種有機化合物的標準譜圖庫可供檢索。其缺點在于不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的樣品。

（2)化學電離源（chemical ionization, CI)：有些化合物穩(wěn)定性差，用EI方式不易得到分子離子，因而不能用質(zhì)譜法測定分子量。確定這些化合物的分子量可以采用CI電離方式。EI和CI在結(jié)構(gòu)上主體部件大致相同，主要差別是CI源工作過程中要引進一種反應氣體。樣品分子在受到電子轟擊前，被一種反應氣如甲烷、異丁烷等稀釋，稀釋比例約為。反應氣在高能電子流的轟擊下首先電離，生成分子離子（一次離子)，和反應氣分子進一步作用，生成高度活性的反應離子（二級離子)，再與樣品分子發(fā)生離子-分子反應，通過質(zhì)子交換使樣品分子電離�；瘜W電離通常得到準分子離子，如果樣品分子的質(zhì)子親和勢大于反應氣的質(zhì)子親和勢，則生成，反之則生成。由CI得到的質(zhì)譜不是標準質(zhì)譜，故不能進行庫檢索；與EI一樣，不適用于難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物的分析。

4. 質(zhì)量分析器　是將離子源中生成的各種離子按質(zhì)荷比進行分離的裝置。質(zhì)量分析器的兩個主要性能指標是質(zhì)荷比的范圍（質(zhì)量范圍)和分辨率，各類質(zhì)譜儀的主要差別在于質(zhì)量分析器，常用的有磁分析器、四極桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器及飛行時間質(zhì)量分析器等。

（1)磁分析器：又分為單聚焦質(zhì)量分析器（single focusing massanalyzer)和雙聚焦質(zhì)量分析器（double focusing mass analyzer)。在離子源中產(chǎn)生的離子被電場加速后進入入射狹縫，垂直射入扇形磁場中，偏轉(zhuǎn)后穿過出射狹縫，再聚焦于收集器。離子偏轉(zhuǎn)的曲率半徑與離子質(zhì)量、離子電荷、磁場強度、加速電壓有關(guān)。離子的質(zhì)荷比與各參數(shù)的關(guān)系可表示為：

　　　　　　　 　   （12-12)

由上式可知，進行質(zhì)譜分析時，在一定的、條件下，不同的離子，其運動半徑不同，凡是不能符合式（12-10)要求的離子，不能穿過出射狹縫，符合的離子才能聚焦于出射狹縫處，實現(xiàn)方向聚焦，最后到達檢測器。這種磁分析器稱為單聚焦質(zhì)量分析器，結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，但分辨率很低。為了消除離子能量分散對分辨率的影響，雙聚焦質(zhì)量分析器在入射狹縫與扇形磁場之間增加一個扇形電場（靜電分析器)，只有動能與運動半徑相匹配的離子才能通過靜電分析器實現(xiàn)能量聚焦，然后再進行方向聚焦，經(jīng)過雙聚焦后，分辨率大大提高。

（2)四極桿質(zhì)量分析器（quadrupole mass analyzer)：由四根平行的、對稱放置的棒狀電極（長0.1～0.3m)組成。相對兩根電極加電壓，另兩根電極加電壓-，其中為射頻電壓，為直流電壓。結(jié)構(gòu)如圖12-21所示。當離子束進入電極包圍的空間后，受到交、直流疊加電場的作用而波動前進。對于給定的直流和射頻電壓，特定質(zhì)荷比的離子能夠作穩(wěn)定運動通過電場區(qū)到達收集器產(chǎn)生信號，這些離子稱為共振離子；其他質(zhì)荷比的離子在運動過程中與電極碰撞而被真空泵抽出系統(tǒng)，這些離子稱為非共振離子。若使直流和射頻電壓振幅按不同比率改變或通過改變射頻頻率則可實現(xiàn)質(zhì)量掃描，使不同質(zhì)荷比的離子依次到達檢測器。四極質(zhì)量分析器的優(yōu)點是分析速度極快，最適合與色譜儀聯(lián)用，且結(jié)構(gòu)簡單、自動化程度高。

圖12-21　四極桿質(zhì)量分析器

5. 檢測器　檢測器通常為光電倍增器或電子倍增器，由質(zhì)量分析器來的離子流打到電子倍增器上產(chǎn)生電信號，采集的信號經(jīng)放大并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，計算機進行處理后得到質(zhì)譜圖。質(zhì)譜離子的多少用豐度（abundance)表示，即具有某質(zhì)荷比離子的數(shù)量。由于某個具體離子的“數(shù)量”無法測定，所以一般用相對豐度表示其強度，最強的峰叫基峰（base peak)，其他離子的豐度用相對于基峰的百分數(shù)表示。在質(zhì)譜儀測定的質(zhì)量范圍內(nèi)，由離子的質(zhì)荷比和其相對豐度構(gòu)成質(zhì)譜圖。

三、生物質(zhì)譜

隨著生命科學及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，為了解決有關(guān)生物活性物質(zhì)的分析問題而發(fā)展了生物質(zhì)譜。它的發(fā)展強有力地推動了人類基因組計劃及后基因組計劃的實施。生物質(zhì)譜是目前有機質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的研究領域，為質(zhì)譜研究的前沿課題，大大推進了有機質(zhì)譜分析理論和技術(shù)的發(fā)展。

生物質(zhì)譜主要用于解決兩方面的分析問題：精確測量生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸和糖類等的分子量，并提供它們的分子結(jié)構(gòu)信息；對存在于生命復雜體系中的微量或痕量小分子生物活性物質(zhì)進行定性或定量分析。

近幾年來用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離質(zhì)譜技術(shù)研究得最多、應用得最廣泛的主要有二種：電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization massspectrometry, MALDI-MS)。

（一)電噴霧電離質(zhì)譜

電噴霧電離是一種“軟”電離技術(shù)，1988年美國科學家John Fenn教授領導的研究組報道了他們運用電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS)首次成功地進行蛋白質(zhì)分析，從此揭開了ESI-MS用于生物大分子研究的序幕。

ESI-MS既可分析大分子也可分析小分子。對于分子量在1000Da（道爾頓，)以下的小分子，會產(chǎn)生或離子，選擇相應的正離子或負離子形式進行檢測，就可得到分子量。而分子量高達20,000Da的大分子在ESI-MS中生成一系列多電荷離子，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)能夠得到樣品的分子量。ESI-MS通過多電荷離子已能測出分子量達133,000Da的蛋白質(zhì)或分子量達200,000Da的糖蛋白。ESI一般用于四級桿質(zhì)譜儀，也可用在磁質(zhì)譜儀上。ESI-MS可進行蛋白質(zhì)構(gòu)象分析、酶反應中間體分析、酶抑制劑機理分析、共價或非共價復合體分析等。HPLC與ESI-MS聯(lián)用可進行蛋白質(zhì)序列分析。

（二)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜

1988年Tanaka和Hillenkamp兩個研究組分別提出使用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS)進行生物大分子分析�；�質(zhì)輔助激光解吸電離源（MALDI)通常與飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用，也可與四級桿質(zhì)譜儀及磁質(zhì)譜儀聯(lián)用。MALDI-MS分析蛋白質(zhì)的關(guān)鍵是選擇合適的基質(zhì)，首先基質(zhì)必須在蛋白質(zhì)溶劑中有好的溶解性，其次必須能強烈吸收入射的激光，以使能量沉積在基質(zhì)中而非分析物上。另外在固相體系中能分離和包圍被分析分子而不形成共價鍵。

MALDI譜圖中單電荷分子離子峰占絕對多數(shù)，碎片離子極少，成為混合物分析的理想手段。MALDI-TOF-MS非常適用于一維或二維電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品及它們酶解后產(chǎn)生的多肽混合物，后者所得質(zhì)譜圖結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索，對鑒定蛋白質(zhì)和蛋白組學研究非常重要。

四、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法

（一)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)概述

聯(lián)用技術(shù)指兩種或兩種以上的分析技術(shù)在線結(jié)合，重新組合成一種以實現(xiàn)更快速、更有效地分離和分析的技術(shù)。最常用的聯(lián)用技術(shù)是色譜與質(zhì)譜聯(lián)用。色譜是一種很好的分離手段，可以將復雜的混合物中的各個組分分離開，但它的定性、定結(jié)構(gòu)的能力較差；質(zhì)譜對未知化合物的結(jié)構(gòu)有很強的鑒別能力。在這種聯(lián)用系統(tǒng)中，色譜儀相當于將純物質(zhì)輸入質(zhì)譜儀的進樣裝置，而質(zhì)譜儀相當于色譜分離產(chǎn)物的檢測器。兩種儀器通過“接口”（interface)直接聯(lián)接起來，接口要協(xié)調(diào)前后兩種儀器的輸出和輸入間的矛盾，使之相互匹配，因此它是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中的關(guān)鍵裝置。

利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可獲得多種定性定量信息，如總離子流色譜圖（total ion current chromatogram, TIC)、選擇性離子檢測（selected ion monitoring, SIM)、質(zhì)量色譜圖（mass chromatogram, MC)和質(zhì)譜圖等。

TIC是總離子流強度隨時間變化的色譜圖，其縱坐標為總離子流的強度（每個質(zhì)譜的所有離子強度的加和)，橫坐標為時間，以色譜保留時間和質(zhì)譜圖雙重因素對待測物質(zhì)定性后再定量。此圖的外形和由一般色譜儀得到的色譜圖是一樣的，只是以質(zhì)譜儀為檢測器，同樣給出保留值、峰高和峰面積。

SIM指選擇質(zhì)譜圖中能表征待測成分的一個或幾個質(zhì)譜峰進行測定的方法。選擇一個質(zhì)譜峰稱為單離子檢測（SID)，選擇幾個質(zhì)譜峰稱為多離子檢測（MID)。SID適合于復雜混合物某一痕量組分的測定，MID即全掃描工作方式，適用于未知化合物的定性和定量分析，而對目標化合物的尋找應采用多離子檢測。

MC是先用全掃描方式進行離子流檢測，得到總離子流色譜圖，然后對某個特征離子進行計算機處理得到色譜圖。

（二)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

　　氣質(zhì)聯(lián)用儀是分析儀器中較早實現(xiàn)聯(lián)用技術(shù)的儀器，由氣相色譜儀、接口、質(zhì)譜儀組成。氣相色譜儀分離樣品中各組分，接口把氣相色譜流出的各組分送入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜儀對接口依次引入的各組分進行分析，計算機系統(tǒng)交互式地控制氣相色譜、接口和質(zhì)譜儀，進行數(shù)據(jù)采集和處理，是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)的中央控制單元。

1. 儀器接口　理想的GC-MS聯(lián)用儀的接口是既能除去全部載氣，又能把待測物無損失地從氣相色譜儀傳輸?shù)劫|(zhì)譜儀的裝置。常用的接口有直接導入型（direct coupling)、開口分流型（open-split coupling)和噴射式分子分離器接口。

　　（1)直接導入型接口：內(nèi)徑0.25～0.32㎜的毛細管色譜柱插入一根金屬毛細管中（深入1～2㎜)，金屬毛細管直接引入質(zhì)譜儀的離子源，載氣和待測物一起從氣相色譜柱流出立即進入離子源的作用場。待測物成為帶電粒子在電場作用下加速向質(zhì)量分析器運動，而載氣被真空泵抽走。這種接口方式是最常用的一種技術(shù)。

（2)開口分流型接口：氣相色譜柱的一段插入接口，其出口正對著另一毛細管，該毛細管稱為限流毛細管，將色譜柱洗脫物的一部分定量引入質(zhì)譜儀的離子源。這種接口結(jié)構(gòu)簡單，但不適用于填充柱。

（3)噴射式分子分離器接口：氣體在噴射過程中不同質(zhì)量的分子具有不同的動量，動量大的分子沿噴射方向運動，進入質(zhì)譜儀，動量小的分子偏離噴射方向，被真空泵抽走。這種接口適用于各種流量的氣相色譜柱。

2. GC-MS聯(lián)用技術(shù)的應用　GC-MS聯(lián)用在分析檢測和研究的許多領域中起著越來越重要的作用，特別是在許多有機化合物常規(guī)檢測工作中成為一種必備的工具。如致癌物的分析、工廠污水分析、農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留量的分析、獸藥殘留量的分析、食品添加劑分析及保健食品功效成分分析等許多色譜儀無能為力的分析課題，GC-MS分析可以發(fā)揮獨特的作用。

毒鼠強的化學名稱為四甲基二砜四胺，其毒性約為KCN的100倍，氟乙酰胺又名敵蚜胺。毒鼠強和氟乙酰胺造成的嚴重危害已成為近年來社會關(guān)注的熱點問題，對毒鼠強和氟乙酰胺進行同時鑒定具有重要意義。GC-MS同時測定兩種鼠藥的混合物，方法可靠實用，簡單快速。

分別取毒鼠強、氟乙酰胺及其1∶1混合物進行GC-MS測定。混合物溶液的總離子流圖（TIC圖)如圖12-22所示，TIC圖的色譜峰給出氟乙酰胺和毒鼠強的保留時間分別為2.99和12.39min。對樣品進行選擇離子監(jiān)測（SIM)，在12.39min處顯示出所選擇的5個特征離子碎片峰，豐度比與毒鼠強標樣的全掃描圖一致，證明了樣品中毒鼠強的存在。

圖12-22　毒鼠強與氟乙酰胺混合標準品的總離子流圖

（三)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

對于極性強、揮發(fā)性差、分子量大及熱不穩(wěn)定的混合體系，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不適用。但在實際工作中，絕大多數(shù)化合物具有上述特征，而這些物質(zhì)的分離需要采用液相色譜才能完成，因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)得到迅速發(fā)展。

液相色譜-接口-質(zhì)譜儀構(gòu)成LC-MS聯(lián)用儀的三大部分。常見的液相色譜是高壓-液相-分子的體系，而質(zhì)譜是高真空-氣相-離子的體系。因此，LC-MS聯(lián)用需要解決的主要問題是接口問題。

1. 儀器接口　從標準孔徑HPLC柱出口的流出液，先通過一個分離器，流出液被分離，僅有約5%的流出液被引進離子源內(nèi)，剩余部分收集在餾分收集器內(nèi)。當流出液經(jīng)過接口時，接口將承擔起除去溶劑和離子化的功能。

（1)電噴霧接口：帶有樣品的色譜流動相由液相泵輸送到ESI探針，經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛細管流出，給毛細管加數(shù)千伏的高壓，由于高壓和霧化氣的作用，流動相從毛細管頂端流出時，會形成扇狀噴霧，生成帶電液滴，經(jīng)干燥氣除去溶劑后，帶電離子通過毛細管或者小孔直接進入質(zhì)量分析器。

　　（2)大氣壓化學電離接口：色譜流動相帶出的液流被強迫通過一根窄的管路使其得到較高的線速度，給毛細管高溫加熱及霧化氣的作用使液流在脫離管路的時候蒸發(fā)成氣體，通過電暈放電，啟動一系列氣相反應以完成離子化過程。

2. LC-MS聯(lián)用技術(shù)的應用　LC-MS聯(lián)用儀是分析分子量大、極性強的樣品（如蛋白質(zhì)等)不可缺少的分析儀器；而且它已在生物化學（多肽、核酸結(jié)構(gòu)分析)、臨床醫(yī)學（某些疾病診斷)、環(huán)保、中藥研究等領域中得到廣泛的應用。

 （茅力)

第六節(jié)   紅外光譜法

一、概述

紅外光譜法 (infrared spectroscopy, IR)又稱紅外分光光度法。它是利用物質(zhì)對紅外光區(qū)電磁輻射的選擇性吸收來進行結(jié)構(gòu)、定性和定量分析的一種分析方法。

紅外光譜在電磁波譜中位于可見光區(qū)和微波光區(qū)之間，其波長范圍為0.75 ～1000μm。習慣上常根據(jù)能量與可見光區(qū)的接近程度將紅外光區(qū)劃為三個區(qū)域（表12-3)。

表12-3  紅外光譜區(qū)域

通常所說的紅外光譜是指中紅外區(qū)吸收光譜。它是由於物質(zhì)分子吸收該區(qū)的輻射后發(fā)生振動能級和轉(zhuǎn)動能級躍遷引起的。標準紅外吸收光譜圖一般用波長λ或波長的倒數(shù)即波數(shù)為縱坐標，以百分透光度T％為橫坐標來描述，故其吸收峰頂向下，如圖12-24所示。

圖12-23  聚苯乙烯的紅外光譜圖

紅外光譜與紫外光譜都屬于分子吸收光譜，但紅外光譜法有如下特點：

⑴ 紅外光譜依據(jù)樣品在紅外光區(qū)（一般指2.5～25μm波長區(qū)間)吸收譜帶的位置、強度、形狀、個數(shù)，并參照譜帶與溶劑、聚集態(tài)溫度、濃度等的關(guān)系來推測分子的空間構(gòu)型，求化學鍵的力常數(shù)、鍵長和鍵角，推測分子中某種官能團的存在與否，及與其鄰近的基團，從而確定化合物結(jié)構(gòu)。

⑵ 紅外光譜不破壞樣品，并且對任何樣品的存在狀態(tài)都適用，如氣體、液體、可研細的固體或薄膜似的固體都可以用于分析。測定方便，制樣簡單。

⑶ 紅外光譜特征性強。所以人們也常把紅外光譜稱為 “分子指紋光譜”。對于一些同分異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和互變異構(gòu)體，也可以采用紅外光譜進行鑒定。

⑷ 分析時間短。一般在10～30min內(nèi)可完成一個樣品的紅外光譜法分析。如果采用傅里葉變換紅外光譜儀，在1s以內(nèi)就可完成多次掃描。為快速分析提供了十分有用的工具。

二、基本原理

（一)分子的振動

紅外吸收光譜產(chǎn)生于分子振動能級的躍遷，以雙原子分子為例。如果把雙原子分子看成是一根彈簧兩端連著的質(zhì)點(原子)，這兩個原子以平衡點為中心作振幅非常小的周期性振動，即可看成是簡諧振動。根據(jù)虎克(Hooke)定律，雙原子分子的振動頻率可表示為：

 （12-13)

式中，為振動頻率（cm^-1)；c 為光速（cm/s)；k 為化學鍵的力常數(shù)(N/cm)； µ 為折合質(zhì)量（g)。

（12-14)

式中m₁、m₂分別為兩個原子的質(zhì)量。

化學鍵的振動頻率是鍵的強度(用力常數(shù)表示)和折合質(zhì)量的函數(shù)。根據(jù)式（12-11)便可以計算分子的振動頻率。

【例12-1】  計算O-H鍵（力常數(shù)k=7.7×10⁵ g/s²)的振動頻率ν和波數(shù)。

解：

(s^-1)

(cm^-1)

從例可知，與氧原子結(jié)合的氫原子在伸縮振動時振動頻率為1.11×10¹⁴Hz。對不同結(jié)構(gòu)的有機化合物，由于原子對的折合質(zhì)量和力常數(shù)不同，其相應的吸收頻率也各不相同，也就產(chǎn)生了具有自己特征的紅外吸收光譜。

 （二)  紅外吸收光譜產(chǎn)生的條件

分子在發(fā)生振動能級躍遷時，需要一定的能量，這個能量通常由輻射體系的紅外光來供給。由于振動能級是量子化的，因此分子振動只能吸收一定的能量，即吸收與分子振動能級間隔△E_振的能量相應波長的光線。只有當紅外輻射頻率等于振動量子數(shù)的差值與振動頻率的乘積時，才能吸收紅外線，產(chǎn)生紅外光譜。這是紅外吸收光譜產(chǎn)生的第一個條件。  

 紅外吸收光譜產(chǎn)生的第二個條件是分子在振動過程中必須有瞬間偶極矩的改變，也就是前面提到的具有紅外活性的振動。如CO₂分子的ν_as(不對稱伸縮振動)，雖然它的永久偶極矩為零，但在振動過程中，在一個氧原子移向碳原子的同時，另一個氧原子卻背離碳原子運動。因此，電荷分布將發(fā)生周期性的變化，使正負電荷不重合，產(chǎn)生瞬間偶極矩，結(jié)果在2349cm^-1處發(fā)生了吸收，而CO₂分子的ν_s，兩個氧原子同時離開或移向中心碳原子，兩個鍵產(chǎn)生的瞬間偶極矩方向相反，大小相等，分子的正負電荷重合，對于整體而言，偶極矩沒有變化，始終為零，所以該振動不產(chǎn)生紅外吸收。

(三)紅外吸收光譜中常用的幾個術(shù)語

1. 特征峰與相關(guān)峰

紅外光譜的最大特點是具有特征性。復雜分子中存在許多原子基團，各個原子基團（化學鍵)在分子被激發(fā)后，都會產(chǎn)生特征振動。例如CH—NH₂中的NH₂基具有一定的吸收頻率，而很多含有 NH₂基的化合物，在這個頻率附近（3500 ～3100 cm^-1)也出現(xiàn)吸收峰。因此將凡是能用于鑒定原子基團存在并有較高強度的吸收峰，稱為特征峰，其對應的頻率稱為特征頻率。

一個基團除了有特征峰以外，還有很多其它振動形式的吸收峰，習慣上把這些相互依存而又相互可以佐證的吸收峰稱為相關(guān)峰。如CH₃相關(guān)峰有：ν_C-H(as)約2960 cm^-1，ν_C-H(s)（對稱伸縮振動) 約2870 cm^-1，σ_C-H（彎曲振動)約1470 cm^-1，σ_C-H(s) 約1380cm^-1（as表示反對稱，s表示對稱)。用一組相關(guān)峰鑒別基團的存在是個較重要的原則。在一些情況下，因與其它峰重疊或峰強太弱，并非所有的峰都能觀測到，但必須找出主要的相關(guān)峰才能認定基團的存在。

分析紅外圖譜是一件仔細的工作，首先必須熟悉各基團的特征吸收峰，了解它們可能在哪些區(qū)域出現(xiàn)，然后找出對應的相關(guān)峰佐證。

2. 特征區(qū)與指紋區(qū)

波數(shù)在 4000～1330cm^-1（波長為 2.5～7.5μm)區(qū)間習慣上被稱為特征頻率區(qū)，簡稱特征區(qū)。特征區(qū)吸收峰較疏，容易辨認。各種化合物中的官能團的特征頻率都位于該區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)振動頻率較高，受分子其余部分影響小，因而有明顯的特征性，它可作為官能團定性的主要依據(jù)。在這個區(qū)域中主要有ν_O-H、ν_N-H、ν_C=C-H、ν_C-H、ν_C=O、ν_C≡C、ν_C≡N、ν_C=C等一些基團的伸縮振動，還包括部分含單鍵基團的面內(nèi)彎曲振動的基頻峰。

波數(shù)在1330～667cm^-1（波長7.5～15μm)的區(qū)域稱為指紋區(qū)。在此區(qū)域中各種官能團的特征頻率具有鮮明的特征性。出現(xiàn)的峰主要是C—X(X=C、N、O)單鍵的伸縮振動及各種彎曲振動。由于這些單鍵的鍵強差別不大，原子質(zhì)量又相近，所以峰帶特別密集，猶如人的指紋，故稱指紋區(qū)。分子結(jié)構(gòu)上的微小變化，都會引起指紋區(qū)光譜的明顯改變，因此在確定有機化物時用途很大。

（四)紅外光譜解析

紅外光譜可用來對化合物作定性鑒定、定量分析和結(jié)構(gòu)分析。所有這些分析都離不開譜圖的解析。所謂譜圖解析就是根據(jù)紅外光譜圖上出現(xiàn)的吸收帶的位置、強度和形狀，利用各種基團特征吸收的知識，確定吸收帶的歸屬，確定分子中所含的基團，結(jié)合其他分析所獲得的信息，作定性鑒定和推測分子結(jié)構(gòu)或立體結(jié)構(gòu)。在進行化合物的鑒定及結(jié)構(gòu)分析時，對圖譜解析經(jīng)常用到直接法、否定法和肯定法。

在用紅外光譜對未知物進行解析之前，根據(jù)其它分析數(shù)據(jù)（如元素分析數(shù)據(jù)、熔點、沸點等)寫出分子式，并根據(jù)分子式計算不飽和度。不飽和度計算的經(jīng)驗公式為：

  （12-15)

式中n₆、n₅、n₄、n₃、n₂、n₁分別代表六價、五價、四價、三價、一價原子的數(shù)目。雙鍵（，)和飽和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的不飽和度為1，三鍵（,)的不飽和度為2，苯環(huán)的不飽和度為4，二價原子如氧、硫等不參加計算。

不同化合物具有不同的紅外光譜，各類化合物的主要官能團及其吸收峰位見表12-4。

表12-4 化合物的主要官能團及其吸收峰位

【例12-2】有一化合物分子式C₇H₆O，其IR光譜圖見圖12-25，試推測結(jié)構(gòu)。

圖12-24化合物C₇H₆O紅外譜圖

  解： ①計算不飽和度：

 ②3060、1600、1585、1500、1460cm^-1的吸收說明有苯環(huán)，結(jié)合在735、685cm^-1的兩個吸收可以認為是單取代苯環(huán)。

③1700cm^-1的強吸收是ν_C＝O，波數(shù)較低，應該有共軛。

④ 2830、2700 cm^-1兩個吸收是醛的特征吸收。

⑤兩個基團：單取代苯環(huán)和—CHO結(jié)合的分子式與C₇H₆O相符，初步判斷該化合物為苯甲醛Ph—CHO。

⑥與苯甲醛標準圖譜對照，圖譜一致，解析結(jié)果正確。

三、紅外光譜儀

紅外光譜儀由光學系統(tǒng)、電學系統(tǒng)、機械系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)組成。圖12-25給出了雙光束紅外光譜儀的概略系統(tǒng)圖。

圖12-25  雙光束紅外光譜儀系統(tǒng)圖

自光源發(fā)出的連續(xù)紅外光對稱地分為兩束，一束通過樣品池，一束通過參比池。這兩束光經(jīng)過半圓形扇形鏡面調(diào)制后進入單色器，再交替地射在檢測器上。當樣品有選擇地吸收特定波長的紅外光后，兩束光強度就有差別，在檢測器上產(chǎn)生與光強差成正比的交流信號電壓。這信號經(jīng)放大后帶動參比光路中的減光器（光楔)使之向減小光強差方向移動，直至兩光束強度相等。與此同時與光楔同步的記錄筆，可描繪出物質(zhì)的吸收情況，得到光譜圖。

四、紅外分光光度法的應用

（一)定性分析

已知物的定性，往往要用標準譜圖作對照。紅外光譜的譜圖可由于譜圖的表示方式、儀器的性能和操作條件的不同而有所差異。但是對于同一種物質(zhì)而言，特征吸收頻率的位置和相對強度的順序是相同的。在實際工作中要注意這個問題。標準圖譜分圖譜集、穿孔卡片兩種。

1. 薩特勒紅外譜圖集

這是一套收集譜圖最多、比較實用的圖集。它收集了棱鏡、光柵光譜和傅里葉變換三代儀器的光譜圖約10多萬張。由美國薩特勒（Sadtler)實驗室編制，于1947年開始出版。它分為化合物標準譜圖和商品譜圖兩大部分。這套譜圖有下列索引：化合物名稱、分子式、官能團等索引，這些光譜圖已經(jīng)數(shù)字化，可用于計算機的檢索。

2. Wyandotte—ASTM穿孔卡片

這是美國試驗材料學會（ASTM)和萬道特(Wyandotte)化學公司在1954年開始出版發(fā)行的穿孔卡片。目前已出版14萬多張。必須用IBM統(tǒng)計分類機和電子計算機檢索。

（二)定量分析

紅外光譜的定量分析不僅可對單組分進行定量分析，還可對多組分樣品進行定量分析。紅外定量分析時樣品不用分離，不受樣品狀態(tài)的限制，氣、固、液體均可以進行分析�？梢詫Ξ悩�(gòu)體、過氧化物和高分子化合物等這些用氣相色譜法難以測定的物質(zhì)進行定量分析。但紅外光譜定量分析靈敏度低、準確度較差，不適于進行微量分析。

（三)紅外吸收光譜新技術(shù)—差示光譜

在光譜分析中，經(jīng)常需要知道兩種光譜之差。例如在溶液光譜中去掉溶劑的光譜，便可得到純?nèi)苜|(zhì)的光譜；在二元混合物中，去掉一個組分的光譜，便可得到另外一個組分的光譜，該光譜稱為差示光譜。

使用差譜技術(shù)，可以不經(jīng)化學分離而直接鑒定出未知混合物的各組分，甚至是微量的組分。而這些微量組分的紅外吸收峰往往被大組分的主體的紅外吸收峰所掩蓋，在一般IR吸收譜圖上很難觀察到。因此差譜技術(shù)在一定程度上解決理化分離所不能解決的問題，稱之為“光譜分離”技術(shù)。

  (李珊，康維鈞)

第七節(jié)  核磁共振波譜法

一、概述

在外磁場的作用下，某些有磁矩的原子核能產(chǎn)生核自旋能級分裂。當用一定頻率的電磁波照射分子時，如果其能量大小恰等于某原子核相鄰兩個核自旋能級的能量差，則原子核將從低自旋能級躍遷至高自旋能級，這種現(xiàn)象稱為核磁共振（nuclear magnetic resonance)。以核磁共振信號強度對照射頻率（或磁場強度)作圖，所得圖譜稱為核磁共振波譜(nuclear magneticresonance spectrum)。利用核磁共振波譜對物質(zhì)進行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析的方法稱為核磁共振波譜法。

二、核磁共振的基本原理

自旋量子數(shù)的原子核有自旋現(xiàn)象。其中的核，核電荷呈球形均勻分布于核表面，如¹H、¹³C、¹⁵N、¹⁹F、³¹P等，它們的核磁共振現(xiàn)象較為簡單，是核磁共振研究的主要對象。目前研究和應用最多的是¹H和¹³C的核磁共振波譜。下面以¹H即質(zhì)子為例介紹核磁共振的基本原理。

原子核由于自旋而具有磁性，質(zhì)子自旋時產(chǎn)生一個微小磁場，就像一個小磁鐵一樣。在外加磁場的作用下，它將有兩種排列方式：一種是其磁場方向與外加磁場方向相同，另一種是其磁場方向與外加磁場方向相反。這兩種排列方式分別相應于它的低能級和高能級。當質(zhì)子吸收能量后，就會從低能級躍遷到高能級，這種能量的吸收和其它吸收光譜一樣也是量子化的。兩個能級的能量差為

 （12-16)

式中，為磁感應強度，單位為T（特斯拉，Tesla)；r為磁旋比，單位為T^1·s^1，每種核都有其特定值，質(zhì)子的r為2.68×10⁸ T^1·s^1；h為普朗克常數(shù)。

用電磁波照射處于外磁場中的質(zhì)子，當電磁波的能量（E = hv₀)恰好等于兩能級的能量差時，自旋核就會吸收能量從低能級躍遷至高能級，這種現(xiàn)象稱為核磁共振。這時

  （12-17)

質(zhì)子發(fā)生核磁共振吸收電磁波的頻率，即共振頻率為

  （12-18)

例如，在外磁場B₀ = 4.69 T的超導磁體中，質(zhì)子的共振頻率為

這個頻率處于電磁波譜的無線電波區(qū)，即射頻區(qū)。

由式12-3可知，要獲得NMR譜，可有兩種方式：一種是固定磁感應強度B₀，連續(xù)改變電磁波頻率v₀進行掃描達到共振條件，稱為掃頻；另一種是固定電磁波頻率v₀，連續(xù)改變磁感應強度B₀進行掃描達到共振條件，稱為掃場。

三、核磁共振波譜儀

核磁共振波譜儀的種類和型號很多，但儀器的結(jié)構(gòu)和組成基本相同，如圖12-1所示，一般由強磁場、磁場掃描發(fā)生器、射頻振蕩器、探頭、射頻接受器和記錄處理系統(tǒng)等組成。其工作原理如下

圖 12-26核磁共振儀結(jié)構(gòu)示意圖

將裝有試樣的樣品管插入處于兩磁極的探頭中央。樣品溶液應為不粘滯液體，固體樣品可用非質(zhì)子溶劑（如CCl₄、CS₂)或氘代溶劑（如D₂O、CDCl₃)溶解配成溶液。測定時，利用高速氣流使樣品管均勻快速旋轉(zhuǎn)，使樣品感受的磁場均勻。繞在磁鐵兩極上的掃描線圈，在磁場掃描發(fā)生器的控制下，可在一定范圍內(nèi)連續(xù)改變磁場強度。射頻振蕩器產(chǎn)生一定頻率的電磁波，以用來激發(fā)核。固定射頻振蕩器產(chǎn)生的電磁波頻率，連續(xù)改變磁場強度進行掃描，當射頻振蕩器發(fā)射的電磁波頻率v₀與磁感應強度B₀之間的關(guān)系符合式12-3時，被測物分子中的質(zhì)子就吸收能量而發(fā)生核磁共振，產(chǎn)生的共振吸收信號和掃場的磁場強度通過射頻接受器送到記錄處理系統(tǒng)，即可獲得核磁共振波譜圖。

四、核磁共振波譜

圖12-2為乙醇的核磁共振波譜圖，從圖上可以得到三方面的信息，即化學位移、積分線以及自旋耦合情況，這些信息對分子結(jié)構(gòu)分析非常重要。

圖12-27 乙醇的核磁共振波譜圖

（a)低分辨 （b)高分辨

1. 化學位移

如果分子中所有質(zhì)子的共振頻率都相同，則根據(jù)式12-3，核磁共振譜圖上就只有一個吸收峰，它對分子結(jié)構(gòu)的分析毫無價值。但實際情況并非如此，從圖12-2（a)可見，圖譜上有三個吸收峰，即出現(xiàn)了三種不同質(zhì)子的核磁共振信號。這是因為質(zhì)子在分子中的位置及環(huán)境不同，其周圍的電子云密度不同的緣故。當質(zhì)子自旋時，其周圍的電子云也隨之轉(zhuǎn)動，在外加磁場作用下發(fā)生環(huán)流，產(chǎn)生一個與外加磁場方向相反的小感應磁場，這時質(zhì)子實際“感覺”到的磁場B比孤立質(zhì)子（也稱裸核)理論所需外加磁感應強度B₀稍有降低（百萬分之幾)，這種現(xiàn)象稱為屏蔽效應。由于屏蔽效應的存在，核磁共振的條件應為

（12-19)

式中，s 稱為屏蔽常數(shù)。

從式12-4可知，質(zhì)子周圍電子云密度越大，屏蔽作用越大，s 越大，質(zhì)子對外界磁場的實際“感覺”越小，要使核外有電子云的核產(chǎn)生核磁共振，外磁場強度必須增大。

質(zhì)子在分子中所處的化學環(huán)境不同，核外電子云密度不同，受到的屏蔽作用就不同。屏蔽作用強，則共振吸收峰將出現(xiàn)在高場，反之，則出現(xiàn)在低場。這種由于質(zhì)子周圍化學環(huán)境不同，其核磁共振頻率發(fā)生位移的現(xiàn)象叫化學位移（chemical shift)。

因為化學位移的數(shù)值極其微小，很難測量其絕對值，并且化學位移的大小與儀器的磁場強度或電磁波頻率有關(guān)，磁場強度或電磁波頻率不同，同一化學環(huán)境質(zhì)子的化學位移也不相同。為了便于比較，一般選用一種參考物質(zhì)作標準，采用相對化學位移d（簡稱化學位移)來表示，其定義為

   （12-20)

或

  （12-21)

式中，、分別為標準物質(zhì)的共振頻率和共振磁感應強度；、分別為樣品的共振頻率和共振磁感應強度；B₀和v₀為儀器的磁感應強度和電磁波頻率。

通常以四甲基硅烷（TMS)作為標準物質(zhì)，并規(guī)定其d 值為0。

影響化學位移的因素主要有相鄰基團的電負性、磁各向異性、雜化效應、氫鍵和溶劑效應等。

2. 積分線

圖12-2（b)中從左到右呈階梯形的曲線稱為積分線。質(zhì)子的核磁共振吸收信號的強度（吸收峰面積)與處于某一化學環(huán)境的質(zhì)子數(shù)目有關(guān)，這是分析化合物分子結(jié)構(gòu)的又一重要信息。吸收信號的強度用吸收峰面積的積分值表示，而積分線的高度則表示積分值的大小。

3. 自旋耦合

圖12-2（b)是乙醇的高分辨核磁共振譜圖，和圖12-2（a)相比，可以看到（a)處甲基上質(zhì)子的共振吸收峰分裂為三重峰，（b)處亞甲基上質(zhì)子的共振吸收峰分裂為四重峰。這種峰的分裂是由于自旋的質(zhì)子之間相互作用引起的。這種作用稱為自旋-自旋耦合（spin-spin coupling)。由于自旋耦合使得相鄰核所需的外磁場強度（或電磁波頻率)發(fā)生更微小的改變，或加強或減弱，在高分辨的NMR譜中會引起共振吸收峰分裂，所以又叫自旋-自旋分裂（spin-spin splitting)。兩個分裂峰之間的距離稱為偶合常數(shù)（couplingconstant)，用J表示，見圖12-3。J值的大小反映了相鄰質(zhì)子之間相互作用的大小。J值的大小與外磁場強度無關(guān)。

圖12-28  質(zhì)子自旋-自旋耦合示意圖

五、核磁共振波譜的應用

核磁共振波譜法是研究分子結(jié)構(gòu)的重要工具之一，在化學、生物、醫(yī)藥衛(wèi)生和臨床等領域應用廣泛。

1. 在分子結(jié)構(gòu)研究方面的應用

核磁共振波譜是研究分子結(jié)構(gòu)的重要工具之一，可用來研究分子的立體結(jié)構(gòu)（構(gòu)型和構(gòu)象)、互變異構(gòu)、反應機理等。綜合核磁共振波譜圖中的各種信息，可以對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進行推斷。從化學位移可以推斷各種質(zhì)子的化學環(huán)境，如鄰近基團的電子效應及空間效應等。從峰的分裂情況和耦合常數(shù)可以推斷鄰近質(zhì)子的數(shù)目和種類。從各組吸收峰的相對積分面積可推斷各類質(zhì)子的比例或個數(shù)。

2. 在定量分析方面的應用

核磁共振波譜中峰的積分線高度與相應的質(zhì)子數(shù)成正比，不僅可用于分子結(jié)構(gòu)分析，而且還可用于定量分析。核磁共振波譜定量的最大優(yōu)點是不需要引進任何校正因子，且不需要化合物的純樣品就可直接測出其濃度。例如英國藥典1988年版中規(guī)定慶大霉素用NMR法測定。更為重要的是，核磁共振在測定混合物中各組份的含量時更顯出其優(yōu)越性，尤其是一些平衡體系中各組分的定量，如酮式和烯醇式共存體系中各組分的定量。但由于儀器價格昂貴等缺點，該法不是常用的定量方法。

3. 在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應用

由于核磁共振可深入物體內(nèi)部，且具有不破壞樣品的特點，因此在原位、在體、實時、無損、活體分析方面有廣泛的應用前景。如活性酶的結(jié)構(gòu)、病變組織與正常組織的鑒別、藥物與受體之間的作用機制等，尤其是以¹HNMR基本原理為基礎發(fā)展起來的磁共振成像（magneticresonance imaging，MRI)，在臨床診斷中既能提供類似X射線斷層掃描（CT)的縱向截面圖，又不產(chǎn)生輻射損傷，已成為許多大醫(yī)院的常規(guī)診斷設備。

除了¹H以外，自然界中還有100多種同位素的核具有磁矩，也可以用NMR方法進行研究。但迄今為止，只研究了其中少數(shù)幾種核的共振行為。

（黃麗英  毋福海)