三、利用ISHH技術(shù)對腫瘤或癌前組織的細胞間期染色體鋪片進行研究
�。ㄒ�)基本原理
在惡性的或癌前病變的組織，染色體組含量與結(jié)構(gòu)的畸變在部分病例中與疾病的預(yù)后相一致。由于染色體基因的變化可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與進展，利用一些技術(shù)預(yù)測這些遺傳物質(zhì)的變化可為惡性腫瘤的檢測及了解其進展和預(yù)后提供資料。流式細胞計（FCM)和染色體組型，即核型分析（karyothping analyses)等技術(shù)曾被用于這個領(lǐng)域的研究。FCM可測定腫瘤細胞DNA的含量，但它不能顯示特異性染色體的結(jié)構(gòu)異常，而且對微量的DNA含量改變難以檢測。核型分析可以顯示染色體結(jié)構(gòu)和含量的變化，但要分析腫瘤細胞的核型只有在細胞培養(yǎng)以后。細胞培養(yǎng)時細胞的高度分裂指數(shù)和細胞的生長會導(dǎo)致染色體物質(zhì)的丟失，而且核型分析不能顯示特異性DNA探針的原位雜交技術(shù)，能夠檢測在細胞分裂間期細胞核內(nèi)染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常變化。因此，這項技術(shù)又被稱為“間期細胞遺傳學分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA)。間期細胞遺傳學的基本原理是利用合成的特異性DNA探針，標記以同位素、生物素、地高辛或熒光素，對外周血、腫瘤細胞或癌前組織的離散培養(yǎng)細胞的染色體鋪片或切片進行DNA-DNA原位雜交，其雜交定位以熒光法、放射自顯影或免疫組化法顯示。目前ICA已廣泛應(yīng)用于生前診斷、腫瘤組織活檢材料的診斷和基因異常的診斷。在腫瘤細胞方面，在乳腺癌，神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、睪丸腫瘤，婦科腫瘤和膀胱腫瘤等均有實驗報告。現(xiàn)已能提供的DNA探針有染色體1，7，8，9，10，15，16，17，18和性染色體X、Y，以及識別一些染色體特征性部位如著絲點（centromeric region)、染色體端極區(qū)（telomere region)的特異性重復(fù)靶核苷序列和隨體的DNA探針，多數(shù)為合成的寡核苷酸探針，在應(yīng)用上采取ISHH和FCM以及免疫組化相結(jié)合（有時還結(jié)合核型分析)的綜合研究法（圖21-2)，也可用多種標記物顯示不同顏色或不同標記在一張切片上同時顯示多個染色體的結(jié)構(gòu)或DNA含量異常，如異硫氰酸熒光素（FITC)和羅丹明200結(jié)合，前者顯示黃綠色，后者顯示紅色，ABC-DAB顯示法與地高辛-堿性磷酸酶系統(tǒng)相結(jié)合，前者反應(yīng)物為棕色，后者為紫藍色。這種聯(lián)合應(yīng)用法又叫多靶點原位雜交法（multiple-target ISH)。
圖21-2 腫瘤組織處理流程圖
�。ǘ�)本操作方法
1．玻片與組織前處理
（1)腫瘤細胞混懸液的制備：新鮮的從活檢或外科手術(shù)或尸檢獲得的材料建議按圖21-2的流程處理進行綜合研究。用以制作細胞混懸液的組織在處理前可保存于液氮內(nèi)。組織塊在玻皿中切碎或用細胞打碎機打碎，用100μm孔直徑的尼龍網(wǎng)過濾器濾過，固定在70%乙醇，-20℃，如保存于-39℃可保存數(shù)月至數(shù)年。
�。�2)分離的細胞由于表面有細胞質(zhì)的覆蓋，在熒光顯微鏡下會顯示強烈的自動熒光，從而掩蓋了ISHH的信號�？刹扇∠铝袃煞N方法移除覆蓋的細胞質(zhì)；
�、僖掖脊潭ê蟮募毎�，應(yīng)用以前在新鮮制備的甲醇/醋酸（3：1)固定液內(nèi)0℃，5min。滴2～3滴固定后的細胞混懸液于涂有粘附劑的載片上，空氣干燥，然后快速浸入70%醋酸內(nèi)10～60s。應(yīng)用蒸餾水洗，在100%乙醇內(nèi)脫水，空氣干燥。
�、趹�(yīng)用胃蛋白酶蛋白水解作用。加5μl細胞混懸液于載片上，空氣干燥30min或在80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500單位/mg蛋白質(zhì)，Sigma,USA)應(yīng)用0.01mol/L HCl稀釋至50～400μg/ml，10min 37℃；再用0.03% H2O2和PBS漂洗，以4%多聚甲醛固定，0℃，5min；載片脫水，空氣干燥，在80℃加熱變性30min。這個方法較①更好，能移除蛋白質(zhì)、暴露核DNA和有助于探針的穿透，最重要的能較好的保持形態(tài)學的結(jié)構(gòu)，以利于ISHH的熒光信號的顯示。應(yīng)用①法，細胞經(jīng)常呈扁盤狀，而且細胞質(zhì)的自動熒光未完全消失，影響ISHH熒光信號的顯示，但實驗表明，必須嚴格掌握胃蛋白酶的濃度，過低，由于細胞質(zhì)的覆蓋，基因拷貝數(shù)會減低，而過高濃度的胃蛋白酶會導(dǎo)致過度消化影響細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。醫(yī)學.全在.線www.med126.com
�。�3)組織切片處理
�、倮鋬銮衅呵衅�5μm，放置有粘附劑的載片上，空氣干燥，固定在4%多聚甲醛-PBS溶液，0℃，15min。固定后以PBS和0.01n HCl漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用0.01N HCl配制)，37℃，30min，PBS漂洗2×5min，在4%多聚甲醛內(nèi)固定15min（0℃)，PBS洗2×5min，系列等級乙醇脫水，空氣干燥。雜交前，在80℃加熱30min使之變性。
�、谑炃衅呵衅�5μm，漂洗在40℃溫水中，撈片于有粘附劑的載片上，空氣干燥，56℃加熱1～16h，二甲苯脫蠟2×3min甲醇沖洗2×5min。應(yīng)用1%H2O2（用甲醇配)溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。以甲醇沖洗，空氣干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml,用0.2n HCl配)37℃ 30min。消化后，載片以PBS沖洗。在雜交前，載片孵育于1%甘氨酸溶液-PBS中15min，以PBS沖洗和系列酒精脫水，空氣干燥。載片在80℃孵育30min使之變性。
2．雜交 本實驗的雜交液略區(qū)別于其它實驗，否則染色體1號和18號的DNA探針不僅結(jié)合1號和18號染色體，還會同時結(jié)合染色體9，6，13，21。雜交液配方：
甲酰胺 60%（V/V，2×SSC配，pH5.0)
鯡魚精子DNA 1μg/μl
余與一般雜交液配制相同
對多靶點ISHH，須另加入1mmol/L KCN入雜交液，每張載片加5μl的含特異性DNA探針（2.5ng/μl)的雜交液，以蓋片覆蓋，四周用橡皮泥封固，先在80℃熱板上5～10min使DNA變性，細胞混懸液制片變性時間只需2.5min，然后在37℃雜交，孵育過夜。
3．雜交后漂洗同本節(jié)�。ǘ�)雜交后漂洗步驟。
4．顯示步驟根據(jù)標記物的種類（同位素、熒光素、生物素或地高辛)分別進行顯示（與第二十章 中敘述相同)。
5．結(jié)果在光鏡下可見染色體結(jié)構(gòu)的改變，如在膀胱腫瘤細胞，其DNA含量經(jīng)FCM顯示高于正常組織1倍，在雙靶ISHH顯示載片上，可見腫瘤細胞間期核內(nèi)，1號染色體為3倍體，而18號染色體為2倍體。在腫瘤細胞內(nèi)應(yīng)用雙重靶點或多重靶點ISHH技術(shù)可見細胞間期核內(nèi)多個染色體的眾多畸變相。
ISHH技術(shù)作為一項快速與敏感的偵檢細胞間期細胞核內(nèi)染色體畸變的新技術(shù)，可結(jié)合病理材料的常規(guī)組織切片、免疫組化染色和FCM等對病檢材料做出早期的、準確的診斷，并對腫瘤的預(yù)后與進展等有所了解。本技術(shù)成功的關(guān)鍵在于具有特異性的DNA探針和ISHH的偵檢程序，比如染色體的拷貝數(shù)與腫瘤細胞前處理的方法有關(guān)，如移除蛋白質(zhì)不徹底，就會使偵檢到的染色體拷貝數(shù)減少。又如在切片上進行細胞間期染色體的ISHH時，常見到一些細胞核碎片呈不同形狀的斑點狀（在涂片上不會出現(xiàn)此種圖像)。對ISHH所獲得資料的分析，須經(jīng)過反復(fù)的實踐，比如模糊的或分裂的斑點可以是非整倍體（aneuoploidy)的假陽性反應(yīng)，產(chǎn)生于細胞周期的G2期。
