一、概述
前面已經(jīng)介紹了核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵（主要是氫鍵)的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性)就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時(shí)，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實(shí)現(xiàn)。使單鏈聚合雙鏈的過程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。
核酸雜交技術(shù)基本上是Hall等1961年的工作開始的，探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。該法很慢、費(fèi)力且不精確，但它開拓了核酸雜交技術(shù)的研究。Bolton等1962年設(shè)計(jì)了第一種簡(jiǎn)單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復(fù)性，但能與其它互補(bǔ)核酸序列雜交。典型的反應(yīng)是用放射性標(biāo)記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過夜，然后將膠置于柱中進(jìn)行漂洗，去除游離探針，在高溫、低鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。該法尤其適用于過量探針的飽和雜交實(shí)驗(yàn)。60年代末，Britten等設(shè)計(jì)了另一種分析細(xì)胞基因組的方法。該法是研究液相中DNA的復(fù)性以比較不同來源核酸的復(fù)雜度，典型的方法是：從不同生物體（細(xì)菌、酵母、魚和哺乳動(dòng)物等)內(nèi)分離DNA，用水壓器剪切成長(zhǎng)約450核苷酸（nt)的片段。剪切的DNA液（含0.12mol/L磷酸鹽緩沖液或0.18mol/l Na+)，經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60℃，在此溫度孵育過程中，測(cè)定溶液一定時(shí)間內(nèi)的UV260nm的吸光度（減色效應(yīng))來監(jiān)測(cè)互補(bǔ)鏈的復(fù)性程度。通常該實(shí)驗(yàn)可比較不同來源生物DNA的復(fù)性速率，并可建立序列復(fù)雜度與動(dòng)力學(xué)復(fù)雜度間的關(guān)系。
60年代中期Nygaard 等的研究為應(yīng)用標(biāo)記DNA或RNA探針檢測(cè)固定在硝酸纖維素（NC)膜上的DNA序列奠定了基礎(chǔ)。如Brown等應(yīng)用這一技術(shù)評(píng)估了爪蟾rRNA基因的拷貝數(shù)。RNA在代謝過程中被3H尿嘧啶標(biāo)記，并在過量的情況下與膜上固定的基因組DNA雜交，繼而用RNase處理，消化非特異性結(jié)合的RNA。漂洗后計(jì)數(shù)以測(cè)定雜交探針的量。通過計(jì)算與已知量DNA雜交的RNA量即可評(píng)估rRNA基因數(shù)。由于當(dāng)時(shí)缺乏特異探針，這種方法不能用于研究其它特異基因的表達(dá)，這些早期過量探針膜雜交試驗(yàn)實(shí)際上是現(xiàn)代膜雜交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
進(jìn)入70年代早期，許多重要的發(fā)展促進(jìn)了核酸雜交技術(shù)的進(jìn)展。例如，對(duì)特異基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析和對(duì)動(dòng)力學(xué)雜交實(shí)驗(yàn)又有興趣。固相化的Poly U –Sepharose和寡（dT)-纖維素使人們能從總RNA中分離Poly A+ RNA。用mRNA的經(jīng)純化技術(shù)可從網(wǎng)織紅細(xì)胞總RNA中制備α-和β-珠蛋白mRNA混合物。這些珠蛋白mRNA首次被用于合成特異的探針以分析珠蛋白基因的表達(dá)。由于制備cDNA探針很繁瑣，所獲得cDNA的長(zhǎng)度和純度也不穩(wěn)定。所以尋求新的探針來源是使分子雜交技術(shù)進(jìn)一步推廣的基礎(chǔ)。
70年代末期到80年代早期，分子生物學(xué)技術(shù)有了突破性進(jìn)展，限制性內(nèi)切酶的發(fā)展和應(yīng)用使分子克隆成為可能。各種載體系統(tǒng)的誕生，尤其是質(zhì)粒和噬菌體DAN載體的構(gòu)建，使特異性DNA探針的來源變得十分豐富。人們可以從基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)中獲得特定基因克隆，只需培養(yǎng)細(xì)菌，便可提取大量的探針DNA。迄今為止，已克隆和定性了許多特異DNA探針。
由于固相化學(xué)技術(shù)和核酸自動(dòng)合成儀的誕生，現(xiàn)在可常規(guī)制備18～100個(gè)堿基的寡核苷酸探針。應(yīng)用限制酶和Southern印跡技術(shù)，用數(shù)微克DNA就可分析特異基因。特異DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印跡和Northern印跡來測(cè)定，與以前的技術(shù)相比，大大提高了雜交水平和可信度。
盡管取得了上述重大進(jìn)展，但分子雜交技術(shù)在臨床實(shí)用中仍存在不少問題，必須提高檢測(cè)單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質(zhì)代替放射性同位素標(biāo)記探針以及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和縮短雜交時(shí)間，這樣，就需要在以下三方面著手研究：第一，完善非放射性標(biāo)記探針；第二，靶序列和探針的擴(kuò)增以及信號(hào)的放大；第三，發(fā)展簡(jiǎn)單的雜交方式，只有這樣，才能使DNA探針實(shí)驗(yàn)做到簡(jiǎn)便、快速、低廉和安全。
二、探針-靶反應(yīng)
從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)。抗原-抗體、外源凝集素-碳水化合物、親和素-生物素、受體-配基（ligand)以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針-靶分子反應(yīng)。蛋白質(zhì)探針（如抗體)與特異靶分子是通過混合力（疏水、離子和氫鍵)的作用在少數(shù)特異位點(diǎn)上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長(zhǎng)短不同，通過氫鍵在幾十、幾百甚至上千個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合。因?yàn)橛袡C(jī)溶液可降低雜交體的穩(wěn)定性，所以，疏水反應(yīng)對(duì)互補(bǔ)核酸鏈的結(jié)合也有一定的作用，但對(duì)其特異性影響甚微。
核苷酸經(jīng)某一原子、功能基團(tuán)或長(zhǎng)側(cè)鏈修飾后仍可能進(jìn)行堿基配對(duì)，這取決于修飾的部位和修飾的性質(zhì)。這一特性有助于理解非放射性核酸探針標(biāo)記物的設(shè)計(jì)和125I與DNA探針的化學(xué)結(jié)合。能與核酸結(jié)合的單一原子有銀、溴和碘等，這些元素可與嘧啶（胸腺嘧啶除外)環(huán)的C-5位或嘌呤環(huán)的C-8位反應(yīng)而不影響氫鍵的形成。溴亦可與胸腺嘧啶的C-6位結(jié)合。而胞嘧啶的C-4和腺嘌呤的N-6就不能被修飾，否則會(huì)影響堿基配對(duì)，盡管C的N-4位和A的N-6位參與了氫鍵形成，但它們也是標(biāo)記位點(diǎn)。這是因?yàn)闃?biāo)記的探針每1kb只摻入10～30個(gè)修飾堿基，即僅4%～12%的單個(gè)堿基被修飾的類似物取代了。盡管摻入位點(diǎn)處的堿基配對(duì)較弱或不存在，但對(duì)整個(gè)雜交分子的穩(wěn)定性影響很小。防止氫鍵破壞的一種方法就是修飾探針，即探針克隆入M13載體中，只修飾載體區(qū)而不修飾插入片段。當(dāng)用放射性同位素32P和35S標(biāo)記核酸時(shí)，由于同位素是摻入核酸骨架的磷酸二脂鍵中，因此堿基未發(fā)生任何修飾。在5’端的磷酸基團(tuán)上可進(jìn)行化學(xué)修飾，這是標(biāo)記寡核苷酸探針的有效方法。因?yàn)檫@種方法是在一個(gè)探針分子上標(biāo)記一個(gè)檢測(cè)的基團(tuán)，所以，對(duì)長(zhǎng)的克隆探針不適用。
此外，還可利用修飾的堿基來增加雜交的穩(wěn)定性和特異性。2-氫基腺嘌呤可替代寡核苷酸探針中的腺嘌呤通過形成3個(gè)氫鍵以增加雜交體的穩(wěn)定性。另外，在G-C豐富的RNA探針中，可用次黃嘌呤代替鳥嘌呤以獲得特異的雜交。因?yàn)榇吸S嘌呤和鳥嘌呤間只形成2個(gè)氫鍵，有效地降低了雜交體的Tm值，這樣，Tm值與雜交溫度更接近，雜交的嚴(yán)格性就增加了，因此，也就增加了特異性。
很顯然，結(jié)合位點(diǎn)的不同和可檢測(cè)基團(tuán)與檢測(cè)系統(tǒng)的不同，可派生出很多核酸探針標(biāo)記方法。這是由核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)所決定的。只有在對(duì)核酸分子的探針-靶反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)有了深入了解之后，才能更好地理解后面的章 節(jié) 內(nèi)容。
