�。ǘ�)抗體血酸還原法（Stathis and Fabrikanos 1958)
�。�1)將在4℃預(yù)冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/l K2CO31.5ml、雙蒸水25ml混勻。
（2)在攪拌下加入1ml 0.7%抗壞血酸水溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色。
�。�3)加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止。膠體金顆粒直徑為8～13nm。
�。ㄈ�)檸檬酸三鈉還原法（Frens 1973)
此方法是由Frens在1973年創(chuàng)立的，制備程序很簡單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7～10min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒的膠體金制備詳見表5-2。
表5-2 檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關(guān)系
| 0.01%的HAuCl4（ml) | 1%檸檬酸三鈉(ml) | 直徑（ml) |
| 100 | 5.0 | 10.0 |
| 100 | 4.0 | 15.0 |
| 100 | 1.5 | 25.0 |
| 100 | 1.0 | 50.0 |
| 100 | 0.75 | 60.0 |
| 100 | 0.60 | 70.0 |
| 100 | 0.42 | 98.0 |
| 100 | 0.32 | 147.0 |
| 100 | 0.25 | 160 |
按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來。許多研究證明用該法制備膠體金時金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數(shù)，基本的規(guī)律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。
�。ㄋ�)鞣酸—檸檬酸三鈉還原法（Slot與Gueeze1985年)
該法是以1982年Muhlpfordt法為基礎(chǔ)，1985年Slot與Geuze對該法進(jìn)行了改良，特點是通過改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，而且顆粒的直徑均勻一致，很適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見表5-3。
表5-3 鞣酸—檸檬酸三鈉還原法
| A 液 | B 液 | |||||
| 直徑（nm) | 1%檸檬酸鈉（ml) | 0.1mol/L K2CO3ml | 1%鞣酸（ml) | H2O（ml) | 1%HAuCl4（ml) | H2O（ml) |
| 3.3 | 4 | 0.2 | 4 | 11.8 | 1 | 79 |
| 5 | 4 | 0.2 | 0.7 | 15.1 | 1 | 79 |
| 10 | 4 | 0.025 | 0.1 | 15.875 | 1 | 79 |
| 15 | 4 | 0.0025 | 0.01 | 15.987 | 1 | 79 |
操作步驟：
�。�1)根據(jù)所需要的膠體金顆粒分別配制A液和B液。
�。�2)將配制好的A、B兩液在水浴內(nèi)加熱到60℃，并通過控溫裝置使溫度保持穩(wěn)定。
（3)在電磁攪拌器上攪拌A液迅速加入B液，繼續(xù)加熱直至膠體金變成葡萄酒色，時間大約7～10min。在A、B兩液混合后可見溶液立即變成藍(lán)色，大約1～3min就變成紅色。
用鞣酸—檸檬酸三鈉還原法，檸檬酸三鈉主要為還原劑，而鞣酸則有雙重作用，一是還原作用，二是保護(hù)作用，控制“晶核”的形成過程，也就是說鞣酸的用量多少決定膠體金顆粒的大小形成，因此改變鞣酸的用量就可以改變膠體金的顆粒大小，達(dá)到制備不同直徑顆粒的膠體金之目的。
