一、抗體產生細胞的特點
抗體產生細胞（Antibody – producing cell)即光鏡下所見漿細胞。有的呈圓形，核居中（稱之為淋巴樣漿細胞、幼漿細胞或過渡型漿細胞)，也有的呈橢圓形，核偏于一邊（稱為典型漿細胞)。它們都具有豐富胞漿（HE染色呈紅色)，能產生和分泌各種抗體。一個成熟漿細胞只能分泌一種抗體。胃腸道粘膜中的各種抗體多由局部抗體產生細胞所分泌。一般認為骨髓的多潛能干細胞轉化成細胞表面具有IgM和IgD標記的成熟B淋巴細胞后進入粘膜層或粘膜下層的散在淋巴濾泡或Peyer斑的生發(fā)中心。胃腸腔內抗原通過其靠腔面的M細胞進入粘膜固有層，通過巨噬細胞和樹突狀細胞將抗原加工后傳遞至生發(fā)中心，在轉化生長因子β(β-trans－forming growth factor, TGF-β)、IL-4、IL-5、γ-IFN和抗原刺激下B淋巴細胞增殖并轉移化成細胞表面含IgG、IgA、IgE等特異性B淋巴母細胞，一部分直接分散在固有層，大部分經淋巴細胞再循環(huán)返回胃腸道粘膜，在IL-2和IL-6刺激下轉化成抗體產生細胞，分泌特異抗體，發(fā)揮體液免疫反應。因此測定粘膜中抗體產生細胞的分布對進一步認識局部體液免疫反應與胃腸道疾病的關系有重要意義。
二、雙標記免疫熒光染色
抗體產生細胞胞漿內含有相對多的抗原，故采用直接或間接法免疫細胞化學技術可簡化步驟，節(jié) 省時間，降低成本。為了清除組織間彌散的免疫球蛋白，我們在固定前用PBS浸洗，取得良好的效果。用雙標記免疫熒光技術可以在同一張切片上顯示出兩種不同的抗體產生細胞。
1．組織加工根據研究目的的內窺鏡直視下鉗取胃、小腸或結腸粘膜。將取得的組織立即放入含4℃，pH7.2、0.01mol/l PBS燒杯內攪拌10～18h后直接放入4℃、96%乙醇中固定。在4℃環(huán)境下繼續(xù)脫水和透明，56℃浸蠟和包埋，石蠟塊冰箱保存。組織切片后，37℃溫水展平，載片后干燥，裝干燥盒置于冰箱，可以保存1周左右。4℃脫蠟和脫二甲苯，PBS洗滌后蒸餾水清洗，風干待染。
2．熒光素標記抗體 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocynate, FITC)標記抗體的具體步驟詳見第三章 。在標記絡丹明B200（lissamine rhodamin B200,RB200)時應注意：
（1)PCI5極易吸收水份放出煙霧樣刺激氣體，RB200和丙酮混合后攪拌時也放出有毒的SO2Cl刺激性氣體，故操作時最好在通風櫥內進行。在室外操作時應戴口罩。醫(yī)學.全在.線www.med126.com
�。�2)丙酮極易揮發(fā)，一定要在密閉容器（如帶蓋的青霉素瓶)內攪拌。吸取丙酮時也要動作迅速。
�。�3)在標記過程中，RB200能產生HCl，容易使蛋白變性，必須用較多堿性緩沖液中和。具體步驟是：
�、侔�50mg蛋白需10mg RB200和20mg PCI5的比例分別準確稱取PCl5和RB200，放入青霉瓶內。經橡皮塞穿入玻棒拌混合5min。
�、谟梦芪�0.5ml左右丙酮迅速注入瓶內，繼續(xù)攪拌5min形成紫褐色溶液（A液)。
�、�1份抗血清（含蛋白10～20mg/ml)用等量或2份0.5mol/l p9.5碳酸緩沖液稀釋后在4℃冰箱內用磁力攪拌器邊攪邊加入A液，并用混合液反復沖洗青霉素瓶內的A液，直至干凈為止，然后繼續(xù)攪拌30～60min。
�、芊Q取相當于蛋白半量的活性碳加入混合液內繼續(xù)攪拌60min后，以4000r/min離心30min除去活性碳。
�、萦�30%～50%飽和硫酸銨鹽析1次，去上清液，沉淀物用少量PBS溶解，過G-25層析柱去除硫酸銨即得RB200標記的抗體。
⑥RB200的最大吸收光譜為570。用分光光度計分別測定570nm（RB200)和280nm（蛋白)的讀數，根據Wells表算出F/P克分子比值。
�、咝r高的標記抗體加0.1% NaN3或硫柳汞（0.1%)數滴防腐，分裝放置20℃以下可長期保存，4℃～10℃能保存半年左右。
3．染色步驟染色前進行對照試驗、吸收試驗和抑制試驗，測定抗體的純度和特異性，同時以瓊脂擴散和染色效果確定工作效價。在連續(xù)切片中，用RB200標記的IgG稀釋液分別與FITC標記的IgA和IgM混合（根據染色效價，分別以對方為稀釋液)進行染色。在37℃溫盒內孵育45min，PBS清洗，過一次蒸餾水后風干，50%緩沖甘油封片，在冰箱中可保存10天左右。
4．陽性結果觀察及細胞計數用Olympus熒光顯微鏡觀察。選擇BG12激發(fā)濾板和0515抑制濾板可同時觀察兩種熒光。胞漿豐富、明顯綠色熒光、核不著色的細胞為IgA或IgM產生細胞；胞漿紅色熒光者為IgG產生細胞。少數胞漿黃色熒光的細胞核呈圓形，位于細胞中央，可能這些B淋巴母細胞能產生兩種抗體，也可能是具有共同的輕鏈而引起的交叉反應。如果用α、β、γ、μ、δ等重鏈單抗進行研究，可以進行鑒別。在熒光顯微鏡下數出組織切片中陽性細胞總數（N)，測微器放在目鏡下測出組織切片所占小方格數（P)。測微器小方格邊長為0.5mm,根據物鏡放大倍數（4倍)用公式D=64N/P計算出每平方毫米組織切片中所含細胞數。
