發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp)至今已有十多年，在這十多年期間對(duì)Hp的研究進(jìn)展飛速，已從細(xì)胞水平逐漸深入到分子水平�，F(xiàn)在認(rèn)為Hp是胃炎，消化性潰瘍的主要致病因素，而且與胃癌有密切關(guān)系。Hp本身的螺形，鞭毛結(jié)構(gòu)及其分泌的細(xì)菌毒素，空泡毒素，尿素酶，粘蛋白酶，過(guò)氧化氫酶，磷脂酶，熱休克蛋白，低分子趨化性蛋白質(zhì)粘附素等都與其致病相關(guān)。診斷Hp感染已從傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)，免疫學(xué)手段發(fā)展到分子生物學(xué)方法，尤其是通過(guò)分析Hp核酸，已清楚Hp的部分核苷酸序列，這為聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)用于Hp研究創(chuàng)造了條件。本文就近年有關(guān)PCR在Hp研究中的應(yīng)用作一綜述。
1 PCR原理
PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特DNA片段的技術(shù)，有關(guān)它的原理許多文獻(xiàn)已有詳細(xì)介紹，這里只作簡(jiǎn)述PCR的每次擴(kuò)增循環(huán)包括三步，第1步為變性，在高溫下把雙鏈靶DNA拆開(kāi)；第2步，在較低的溫度下使引物與靶DNA互補(bǔ)；第3步在中間溫度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延長(zhǎng)，典型的PCR包括30～50循環(huán)，如此重復(fù)循環(huán)，使被擴(kuò)增的靶核苷酸以幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增，在PCR操作中，有幾點(diǎn)必須考慮。①選擇引物長(zhǎng)度以15～30個(gè)堿基為宜，太短特異性不佳，太長(zhǎng)不增加特異性而合成費(fèi)用增加。②引物中應(yīng)盡量避免單高重復(fù)的核苷酸結(jié)構(gòu)，同時(shí)還要考慮引物本身的物理特性，避免經(jīng)物自身退火。③反應(yīng)的退火溫度慎重選擇，溫度高可提高特異性，但敏感性隆低，溫度低則反之。
2 引物選擇
2.1 尿素酶基因核苷酸
Hp分泌大量的尿素酶，該酶是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物對(duì)Hp產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要抗原，可能是Hp的重要致病因子之一，因此許多學(xué)者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作為引物。Clayton等報(bào)告了Hp尿素酶基因（ureA和tureB)的核苷酸序列，篩選到ureA和tureB兩個(gè)亞單位，并測(cè)得了它們的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸順序?yàn)橐飳?duì)的有：Clayton采用一對(duì)18個(gè)堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導(dǎo)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物為411個(gè)堿基對(duì)。其他學(xué)者都是以Clayton報(bào)告的Hp尿素酶基因的部分核苷酸序列為依據(jù)而設(shè)計(jì)PCR的引物。Courcoux等選擇尿一紗酶C基因中的一段294bp作PCR反應(yīng)。
2.2 16S rRNA核苷酸順序
所有細(xì)菌的rRNAs根據(jù)其大小分為三種：含120個(gè)核苷酸的5s rRNA；含1600個(gè)核苷酸的16S rRNA及含3000個(gè)核苷酸的23S rRNA。分析細(xì)菌16s rRNA現(xiàn)已作為細(xì)菌分類的一個(gè)指標(biāo)。大量研究證明，Hp的部分16s rRNA與彎曲菌屬細(xì)菌顯著不同，目前采用以16S rRNA部分核苷酸順序?yàn)橐锏闹饕蠬o等，采用一對(duì)20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導(dǎo)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物為109個(gè)堿基對(duì)。有些學(xué)者用PCR拉增Hp及與其相類似微生物的16s rRNA，以此來(lái)識(shí)別H.pylori，H.mustelac和 H.canis。
2.3 編碼Hp特6kD蛋白質(zhì)的核苷酸
O'Toole等報(bào)告Hp提取物中大量的26000蛋白質(zhì)，作者提出此蛋白質(zhì)是Hp特異蛋白質(zhì)，并分析編碼該蛋白質(zhì)核苷酸序列。Hammar等以此為依據(jù)，設(shè)計(jì)一對(duì)23個(gè)堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導(dǎo)拉增后的DNA產(chǎn)物為298個(gè)堿基對(duì)。
2.4 其它
Valentine等從基因庫(kù)中選出1.9kd的DNA片段作為探針，與19株Hp反應(yīng)都為陽(yáng)性，與32種306株其它細(xì)菌均無(wú)反應(yīng)，其特異性為98.7％，假陽(yáng)性是由于載體污染。由此作者從1.9kdDNA中的已知288個(gè)堿基片段中選出一對(duì)20個(gè)寡核苷酸鏈為引物，其特異引導(dǎo)擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物為203個(gè)堿基對(duì)。
縱觀不同學(xué)者選出的引物，這些引物都能特異地以Hp的DNA為模板，擴(kuò)增Hp的部分核苷酸，而不引導(dǎo)擴(kuò)增其它細(xì)菌的核苷酸。
3 應(yīng)用
3.1 臨床診斷
自從成功分離出Hp以來(lái)，由于Hp感染在臨床上的重要性，迫切需要一個(gè)快速敏感檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)本的方法，學(xué)者們?cè)诓粩嗵剿鞲鞣N診斷Hp感染的方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法由于細(xì)菌生長(zhǎng)要求高，死亡或菌量過(guò)少，則常規(guī)方法難以檢出，其它方法如同位素標(biāo)記的二氧化碳呼氣試驗(yàn)，費(fèi)用貴，快速尿素酶試驗(yàn)由于制劑標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，消化道其它一些細(xì)菌也產(chǎn)生尿素酶，使該方法的特異性受到影響，檢測(cè)抗Hp抗體方法簡(jiǎn)易，但很難區(qū)分是否為近期感染，隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，最近有些實(shí)驗(yàn)室采用PCR技術(shù)診斷Hp感染，取得滿意結(jié)果，Ho等采用16s rRNA的部分核苷酸序列為引物，其引物不引導(dǎo)拉增與Hp的16S rRNA十分相近的H.cinaedi，H.mustelac，H.hepaticus和產(chǎn)生琥珀酸沃林氏菌。檢測(cè)10份已知Hp陽(yáng)性的病理切片都為陽(yáng)性，另外4份胃粘膜活檢標(biāo)本符合已知結(jié)果并且能檢測(cè)到不能培養(yǎng)的Hp圓球體的DNA，進(jìn)一步測(cè)試從豬，狒狒和猴胃中分離的細(xì)菌，并用內(nèi)部探針與擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物雜交，提示從這些動(dòng)物中分離的細(xì)菌都為Hp。Engstrand等選用的16s rRNA引物順序與Ho者不同，作者采用了反向轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，先利用反轉(zhuǎn)錄酶合成RNA，然后再擴(kuò)增cDNA。其敏感性比常規(guī)PCR提高25～50倍，可檢測(cè)到2個(gè)細(xì)菌，檢測(cè)15份標(biāo)本，14份標(biāo)本與呼氣試驗(yàn)和培養(yǎng)相同，該方法的特異性為100％，Nguycn等用該方示檢測(cè)口腔齒斑標(biāo)本，18例Hp陽(yáng)性病人中有7例陽(yáng)性，7例未感染Hp病人中，口齒斑未測(cè)到Hp，該結(jié)果提示口腔很可能是Hp除胃以外體內(nèi)另一居留地，這也可能是有些病人抗Hp治療后復(fù)發(fā)的原因之一。Clayton等采用urcA基因的部分核苷酸序列為引物，與50株已知Hp反應(yīng)全部為陽(yáng)性，與產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌，空腸彎曲菌，結(jié)腸彎曲菌及螺旋菌屬（Helicobacter)中另一產(chǎn)尿素酶的細(xì)菌H.mustelae反應(yīng)都為陰性。作者除了直接檢測(cè)胃粘膜外還檢測(cè)了石蠟包埋病理切片，效果較理想。臺(tái)灣學(xué)者設(shè)計(jì)了重疊PCR。作者選用了兩對(duì)以尿素酶基因的部分核苷酸序列為引物，當(dāng)?shù)谝粚?duì)引物的PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)，將其拉擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物再進(jìn)行第2對(duì)引物的PCR循環(huán)，其敏感可提高100倍，而無(wú)假陽(yáng)性。作者分析了兩例擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物的部分核苷酸序列，在183個(gè)堿基對(duì)中與已報(bào)道的尿素酶基因序列有98％的同源性。Hammar等采用了編碼Hp特異蛋白質(zhì)的部分核苷酸序列為引物，27例胃粘膜標(biāo)本中，19例PCR陽(yáng)性，而在所有PCR陽(yáng)性標(biāo)本中只有15例培養(yǎng)陽(yáng)性，另外唾液杯本有9例陽(yáng)性。Valcntinc等還檢測(cè)了胃液標(biāo)本，在13例胃粘膜活檢陽(yáng)性標(biāo)本中，有11例胃液標(biāo)本陽(yáng)性，而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即操作，對(duì)那些不易做胃鏡的病人和兒童可能是一個(gè)比較易被接受的檢測(cè)方法。Zwet等檢測(cè)了24例Hp感染病人的糞便標(biāo)本，12例于胃鏡檢后進(jìn)行，另外12例于奧美拉唑治療2周后進(jìn)行，24例Hp感染陽(yáng)性者糞便經(jīng)PCR檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)有Hp的DNA存在，因此得出結(jié)論，在發(fā)達(dá)國(guó)家中，Hp經(jīng)糞一口途徑播的發(fā)生率非常低，Levinsteir等也得到同樣的結(jié)果。
3.2 流行病行學(xué)研究
目前開(kāi)展周密細(xì)致的Hp流行病學(xué)研究還有一定的困難，如Hp感染的傳播途徑，Hp治療后病人復(fù)轉(zhuǎn)陽(yáng)性是復(fù)發(fā)還是再感染等等，主要是缺乏準(zhǔn)確可靠，方便，易于重復(fù)的細(xì)菌學(xué)分型方法。Hp的生物學(xué)分型，血表學(xué)分型方法都有報(bào)道，但效果不理想。在分子平上，Hp全菌可溶性蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上表明很大的一致性；用核酸內(nèi)切酶酶切HpDNA的指紋法顯示很大的差異性，但是其酶切圖譜復(fù)雜結(jié)果較難解釋。PCR作為流行病研究的工具，其敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他方法，因而有利于確定細(xì)菌感染的來(lái)源和途徑，如檢查環(huán)境或動(dòng)物傳染源。目前PCR技術(shù)用于Hp流行病學(xué)研究有：
3.2.1 酶切PCR擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物
最早由Langenberg等報(bào)告了用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶分析Hp全基因的差異，Clayton等用各種核酸內(nèi)切酶酶不同Hp引物引導(dǎo)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了Sau3A，Hac Ⅲ，MspⅠ和Alu Ⅰ效果較好，17株Hp都有其特異的指紋圖。36例抗Hp治療前后調(diào)查結(jié)果顯示：抗Hp治療失敗是由于細(xì)菌持續(xù)感染，F(xiàn)oxall用核酸內(nèi)切酶Hac Ⅲ酶切PCR擴(kuò)增后的部分尿素酶內(nèi)切酶基因DNA，22株臨床標(biāo)本有10種圖譜，其中2種圖譜分別包括5株和6株細(xì)菌。Tonodatsu等用Hac Ⅲ酶切PCR擴(kuò)增后的部分悄素酶β基因，用Southern blot分析98株Hp得出：不同菌株即使經(jīng)過(guò)保藏和多次傳代后，其Southern blot圖譜仍無(wú)改變，因此認(rèn)為用尿素酶基因作為DNA指紋法的探針可用于Hp感染的流行病學(xué)示蹤方面。Moorc等用核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ內(nèi)切PCR擴(kuò)增后的部分尿素酶基因DNA，把21株細(xì)菌又可分為4組；如用核酸內(nèi)切酶Alu Ⅰ和Pvu Ⅰ酶切，21株細(xì)菌又可分為15組，用核酶內(nèi)切酶Sau3A內(nèi)切同組的Hp基因DNA，其酶切圖譜截然不同，提示不是相同株，比較抗Hp治療后細(xì)菌酶切圖譜，2例病人相同，1例病人不同，表明前者在治療前后感染兩種細(xì)菌，用核酸內(nèi)酶酶切PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物，其圖譜比酶切細(xì)菌其因DNA圖譜簡(jiǎn)單，易于分析，而且前者可直接采用胃粘膜標(biāo)本處理，易于操作。
3.2.2 RAPD和RFLP
RAPD技術(shù)是九十年代初由Wilions等最早報(bào)道的，RAPD是random amplificd polymorphicDNA的英文字母縮寫(xiě)，也有文獻(xiàn)稱之為AP（Arbi-trary primer)—PCR。它的原理是采用隨機(jī)選出的單一核苷酸鏈為引物，以靶DNA為模板，在多個(gè)部位引旨擴(kuò)增DNA。PAPD結(jié)果為細(xì)菌株的特異性，故用此主法可區(qū)別同種細(xì)菌的不同株。Akopyanz等報(bào)道用RAPD分析Hp以選擇較短（小于10個(gè)堿基對(duì))的寡核苷酸鏈為引物為佳，一般不超過(guò)11個(gè)堿基對(duì)，并且引種的G＋C百分含量必須大于60％，而小于50％效果不甚理想，作者用RAPD技術(shù)分析了同一醫(yī)院中分離到的60株Hp，每株細(xì)菌的DNA圖譜有很大的差異，追蹤調(diào)查3例治療病人，其治療前后RAPD圖譜完全相同。
RFLP是restriction fragment length polymorphism的英文縮寫(xiě)，它的原理是設(shè)計(jì)一對(duì)（數(shù)對(duì))適當(dāng)?shù)囊�，使擴(kuò)增片段包含某一個(gè)或數(shù)個(gè)多態(tài)性的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。PCR后，用該限制酶酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長(zhǎng)度的變化，即可做出診斷。Owen，F(xiàn)ujimoto等用以PCR為基礎(chǔ)的RFLP比較了尿至少酶基因與rRNA基因圖譜的差別，提示從尿素酶基因圖譜可知：眾多Hp培養(yǎng)物是包含有多種基因亞型的Hp混合物，因此得出結(jié)論，尿素酶基因圖譜完全根除所引起的可靠手段。Nancy等也報(bào)道了用RELP從一個(gè)病人體內(nèi)檢測(cè)出不止一種Hp菌株。
3.3 Hp分子遺傳學(xué)研究
PCR還可用于細(xì)菌的基因分離，克隆，致病因子基因的序列分析等方面的研究。Courcoax等選擇尿素酶C基因中的一段294bp對(duì)38例患者標(biāo)本標(biāo)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物分別測(cè)序，結(jié)果所有標(biāo)本在基因水平上均呈現(xiàn)出多態(tài)性，無(wú)一例核苷酸序列完全相同的標(biāo)本，88％的標(biāo)本，其DNA水平上的改變沒(méi)有影響相應(yīng)的氨基酸序列。認(rèn)為此方法的推廣應(yīng)用或許能夠弄清抗Hp治療4周后再次出現(xiàn)的Hp究竟是復(fù)發(fā)（recrudescence)還是再次感染（reinfection)這個(gè)問(wèn)題，并可用于了解Hp的傳播途徑。
綜上所述，隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)在Hp研究中有很大的前途，它具有高效，特異，敏感，快速，簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，標(biāo)本運(yùn)輸條件不高，甚至可以郵寄，并可作為Hp流行病學(xué)研究的一種工具，但是PCR的高敏感性也可能是它潛在的一個(gè)致命弱點(diǎn)，極少Hp的DNA污染，PCR過(guò)度擴(kuò)增都可導(dǎo)致假陽(yáng)性，因此合理選擇DNA擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，實(shí)驗(yàn)室布局合理，操作小心謹(jǐn)慎，不污染樣品有仔細(xì)設(shè)置對(duì)照等都是不可忽視的因素，通過(guò)這些步聚可以盡可能地克服PCR潛在的缺點(diǎn)，推動(dòng)Hp的研究進(jìn)一步深入到分子水平。
劉岱青 陸德源 張振華
上海第二醫(yī)科大學(xué)（上海 200025)
