第二節(jié) DNA的損傷及修復(fù)
DNA的損傷，《羅紀(jì)盛》P428
一些物理化學(xué)因子如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑均可引起DNA損傷，破壞其結(jié)構(gòu)與功能。然而在一定條件下，生物機(jī)體能使這種損傷得到修復(fù)。
紫外線可使DNA分子中同一條鏈上兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體（TT)，兩個(gè)T以共價(jià)鍵形成環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)。CT、CC間也可形成少量二聚體（CT、CC)，使復(fù)制、轉(zhuǎn)錄受阻。
P346圖19-22
細(xì)胞內(nèi)具有一系列起修復(fù)作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復(fù)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已知有4種酶修復(fù)系統(tǒng)：光復(fù)活、切除修復(fù)、重組修復(fù)、SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)，后三種不需要光，又稱(chēng)為暗修復(fù)。
一、 直接修復(fù)
1949年已發(fā)現(xiàn)光復(fù)活現(xiàn)象，可見(jiàn)光（最有效400nm)可激活光復(fù)活酶，此酶能分解由于紫外線形成的嘧啶二聚體。高等哺乳動(dòng)物沒(méi)有此酶。
P347 圖19-23 紫外線損傷的光復(fù)活過(guò)程
A 形成嘧啶二聚體 B. 光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位 C 酶被可見(jiàn)光激活 D. 修復(fù)后釋放酶
二、 切除修復(fù)
P348 圖19-24 DNA損傷的切除修復(fù)過(guò)程
在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。
I、結(jié)構(gòu)缺陷的修復(fù)：
（1)核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA損傷部位，在其附近將其切開(kāi)。
（2)核酸外切酶切除損傷的DNA。
（3)DNA聚合酶修復(fù)。
（4)DNA連接酶連接。
圖
II、無(wú)嘌呤無(wú)嘧啶——堿基缺陷或錯(cuò)配——脫堿基（N-糖苷酶)：
甲基磺酸甲酯可使鳥(niǎo)嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷鍵，造成脫嘌呤作用；酸也能使DNA脫嘌呤。
DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶對(duì)dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP摻入DNA鏈。細(xì)胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脫氨形成次黃嘌呤時(shí)也可以被次黃嘌呤-N-糖苷酶切掉次黃嘌呤。
對(duì)于無(wú)嘌呤無(wú)嘧啶的損傷有兩種修復(fù)方法：
（1) AP核酸內(nèi)切酶切開(kāi)，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修復(fù)，DNA連接酶連接。
（2) 插入酶插入正確堿基三、 重組修復(fù)
P349圖19—25重組修復(fù)的過(guò)程
切除修復(fù)發(fā)生在DNA復(fù)制之前，而當(dāng)DNA發(fā)動(dòng)復(fù)制時(shí)尚未修復(fù)的損傷部位，可以先復(fù)制，再重組修復(fù)。
在重組修復(fù)過(guò)程中，DNA鏈的損傷并未除去。
重組修復(fù)至少需要4種酶組分。
重組基因recA編碼一種分子量為40000的蛋白質(zhì)，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認(rèn)為在DNA重組和重組修復(fù)中均起關(guān)鍵作用。
recB、recC基因分別編碼核酸外切酶V的兩個(gè)亞基。
此外，修復(fù)合成還需要DNA聚合酶和連接酶。
四、 易錯(cuò)修復(fù)和應(yīng)急反應(yīng)（SOS反應(yīng))
誘導(dǎo)修復(fù)是細(xì)胞DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷或DNA復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的一系列誘導(dǎo)性修復(fù)。
SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯(cuò)的修復(fù)（無(wú)差錯(cuò)修復(fù))和傾向差錯(cuò)的修復(fù)。
避免差錯(cuò)的修復(fù)：SOS反應(yīng)能誘導(dǎo)光復(fù)活切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而加強(qiáng)光復(fù)活切除修復(fù)和重組修復(fù)的能力，這屬于避免差錯(cuò)的修復(fù)。
傾向差錯(cuò)的修復(fù)：SOS反應(yīng)還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，可是卻帶來(lái)了高的突變率，這屬于傾向差錯(cuò)的修復(fù)。
SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SOS反應(yīng)的最初發(fā)動(dòng)因子。在有單鏈DNA和ATP存在時(shí)，RecA蛋白被激活而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌體的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd)許多基因的阻遏物，當(dāng)它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表達(dá)其中包括紫外線損傷的修復(fù)基因uvrA、uvrB、uvrC（分別編碼核酸內(nèi)切酶的亞基)以及recA和lexA基因本身，還有單鏈結(jié)合蛋白基因ssb，與λ噬菌體DNA整合有關(guān)的基因himA、與誘變作用有關(guān)的基因umuDC，與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F(xiàn)等。
SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在極為不利的環(huán)境中求得生存的一種基本功能。
然而癌變有可能也是通過(guò)SOS反應(yīng)造成的，因?yàn)槟芤餝OS反應(yīng)的作用劑通常都具有致癌作用，如X-射線，紫外線，烷化劑，黃曲霉素等，而某些不能致癌的誘變劑并不引起SOS反應(yīng)，如5-溴尿嘧啶。目前，有關(guān)致癌物的一些簡(jiǎn)便檢測(cè)方法就是根據(jù)SOS反應(yīng)原理而設(shè)計(jì)的，既測(cè)定細(xì)菌的SOS反應(yīng)。
第三節(jié) RNA指導(dǎo)的DNA合成（反轉(zhuǎn)錄)
反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription)：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過(guò)程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。
1970年，Temin 和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒)中發(fā)現(xiàn)發(fā)反轉(zhuǎn)錄酶。
致癌RNA病毒是一大類(lèi)能引起鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi)等動(dòng)物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類(lèi)病毒侵染細(xì)胞后并不引起細(xì)胞死亡，卻可以使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)改造后可以作為基因治療的載體。
放線菌素D（抑制以DNA為模板的反應(yīng)，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄)能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，可見(jiàn)致癌RNA病毒的復(fù)制過(guò)程必然涉及DNA。
Bader 用嘌呤霉素（puromycin)來(lái)抑制靜止細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞仍能感染勞氏肉瘤病毒（RSV)，證實(shí)反轉(zhuǎn)錄酶是由反轉(zhuǎn)錄病毒帶入細(xì)胞的，而不是感染后在宿主細(xì)胞中新合成的。
一、 反轉(zhuǎn)錄酶
由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，含有Zn2+，具有三種酶活力。
（1)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力（以RNA為模板，合成一條互補(bǔ)的DNA，形成RNA—DNA雜種分子)。
（2)RNase H酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個(gè)方向起外切酶作用。
（3)DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。
模板：RNA或DNA
以自身病毒類(lèi)型的RNA為模板時(shí)，該酶的反轉(zhuǎn)錄活力最大，但是帶有適當(dāng)引物的任何種類(lèi)的RNA都能作為合成DNA的模板。
引物：RNA或DNA
底物：dNTP
二價(jià)陽(yáng)離子：Mg2+或Mn2+
真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作為反轉(zhuǎn)錄酶的模板，合成cDNA。
二、 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程
所有已知的致癌RNA病毒都含有反轉(zhuǎn)錄酶，因此被稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus)，反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制需要經(jīng)過(guò)一個(gè)DNA中間體（前病毒)。
1、 反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)
P353 圖19-27
（1) 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組通常由兩條相同的（+)RNA鏈組成。5’端附近區(qū)域以氫鍵結(jié)合在一起，全長(zhǎng)7-10Kb。
（2) 每一條RNA鏈的兩端具有相同的序列，形成正向重復(fù)序列。
（3) 5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有polyA，與真核mRNA相似。
（4) 5’端帶有1分子的宿主tRNA，作為反轉(zhuǎn)錄時(shí)的引物。某些鳥(niǎo)類(lèi)反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的是tRNAtrp，鼠類(lèi)是tRNApro
2、 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
當(dāng)致癌RNA病毒侵染宿主細(xì)胞時(shí)，病毒RNA及反轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒自身帶入的反轉(zhuǎn)錄酶使RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA。
（1) 以病毒（+)RNA為模板，合成互補(bǔ)的（-)DNA。
（2) 切除RNA—DNA雜種分子中的RNA。
（3) 以（-)DNA鏈為模板，合成（+)DNA鏈，最后形成兩端帶有LTR（長(zhǎng)末端重復(fù)序列)的雙鏈DNA。
反轉(zhuǎn)錄病毒只有整合到宿主染色體DNA后才能被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)拼接可以產(chǎn)生不同的病毒mRNA。LTR（長(zhǎng)末端重復(fù)序列)對(duì)前病毒DNA整合到宿主染色體DNA以及整合后的轉(zhuǎn)錄均起著重要作用。
反轉(zhuǎn)錄病毒合成的過(guò)程：
圖
缺口的模板（基因組)RNA，在U3旁生成一個(gè)正鏈DNA的合成RNA的引物，而其余的模板RNA被降解。
正鏈DNA合成開(kāi)始，復(fù)制。
圖
3、 反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期
P354 圖19-29
（1) 病毒粒子侵染細(xì)胞，病毒RNA和反轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入細(xì)胞。
（2) RNA被反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA（前病毒)，環(huán)化，進(jìn)入細(xì)胞核。
（3) 反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA整合到宿主染色體DNA中。
（4) 前病毒DNA進(jìn)行復(fù)制，轉(zhuǎn)錄出功能基因、基因組RNA和病毒蛋白。
（5) 基因組RNA和病毒蛋白在胞質(zhì)中組裝成新病毒粒子，轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，通過(guò)出芽方式釋放新病毒粒子。
三、 反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義。
1．反轉(zhuǎn)錄酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在與RNA病毒引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。
2．艾滋病毒（AIDS)
人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV)，也是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，主要感染T4淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。病毒粒子直徑100nm，球狀，粒子外包被兩層脂質(zhì)質(zhì)膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41)，另有兩層衣殼蛋白p24、p18。
HIV基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個(gè)鏈長(zhǎng)9.7kb，RNA 5，端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有PolyA，鏈上結(jié)合有反轉(zhuǎn)錄酶。
3．乙肝病毒
大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原)
核心抗原
雙鏈環(huán)狀DNA
乙肝病毒與反轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別：
P355
4、真核生物正常細(xì)胞內(nèi)也存在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程
真核生物的談色體基因組中存在為數(shù)眾多的逆假基因和逆基因。
逆假基因：無(wú)啟動(dòng)子和內(nèi)含子，但有polyA的殘基，推測(cè)是由mRNA反轉(zhuǎn)錄后整合到基因組中去的。
逆基因：具有啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄功能，無(wú)內(nèi)含子。可能是由于mRNA反轉(zhuǎn)錄后剛好整合到啟動(dòng)子的下游處，或者是帶啟動(dòng)子的RNA序列反轉(zhuǎn)錄后整合到基因組中
第四節(jié) DNA合成技術(shù)
一、 cDNA合成
1、 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
cDNA：以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，去除mRNA，合成的第二鏈。
cDNA文庫(kù)是獲得真核結(jié)構(gòu)基因的最好方法，成熟的mRNA無(wú)內(nèi)含子。
（1)、 真核mRNA的分離純化
特點(diǎn)：含量少，不均一，表達(dá)具有發(fā)育階段性和組織特異性。
總RNA： rRNA 80~85%
mRNA 1~5%
tRNA及其它小分子RNA 10~15%
不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000種mRNA。
分離、純化：
用Oligo dT纖維素柱（親和層析法)，加入總RNA，高鹽洗脫，先流出非mRNA，降低鹽濃度，加入Oligo dA競(jìng)爭(zhēng)，可洗出mRNA 混合物。
免疫法可分離特定的mRNA。
（2)、 cDNA合成（反轉(zhuǎn)錄酶)
A. 自身引物法（S1核酸酶降解法)
圖
Oligo(dT)15-18個(gè)核苷酸
mRNA5’端序列有丟失。
B. 取代合成法（較常用)
圖
Oliyo（dT)與mRNA3’端AAA雜交作為引物，合成第一條DNA鏈。
RNaseH在mRNA上產(chǎn)生多個(gè)切口。
DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase連接，合成出第二條DNA鏈。
T4DNA pol.切去端頭的RNA-DNA雜交鏈。
C. 引物合成法
可以合成全長(zhǎng)cDNA，mRNA的5’端不丟失。
圖
（3)、 cDNA與載體連接
（4)、 重組體的轉(zhuǎn)化
（5)、 擴(kuò)增、保存
2、 獲取特定mRNA的cDNA
（1)免疫法分離特定的mRNA
（2)PCR法
二、 PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))
Polymerase chain Reaction
以目的基因或DNA片段為模板，在引物介導(dǎo)及Taq DNA聚合酶催化下，在體外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。
它能快速、專(zhuān)一地?cái)U(kuò)增所希望得到的目的基因或DNA片段。
1、 反應(yīng)物
（1)模板
單、雙鏈DNA或cDNA都可以作為PCR的模板，若以RNA為起始材料，則須經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，獲得第一條cDNA后才能用于PCR。
（2)Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶是進(jìn)行PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，從水生棲熱菌（Thermus aquaticns VT-1)分離出來(lái)。
Taq DNA聚合酶有很好的熱穩(wěn)定性，92.5℃處理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，錯(cuò)誤摻入核苷酸的比率為1/7500。
（3)引物
引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，它由寡核苷酸組成，15-30個(gè)b
（4)核苷酸dNTP
dNTP的濃度50-200umul/L。
（5)鎂離子Mg2+
2、 PCR原理
圖
變性 95℃
復(fù)性 55℃
延伸 72℃
第十四章 RNA的生物合成
RNA的生物合成包括轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制。
轉(zhuǎn)錄（transcription)：以一段DNA的遺傳信息為模板，在RNA聚合酶作用下，合成出對(duì)應(yīng)的RNA的過(guò)程，或在DNA指導(dǎo)下合成RNA。
轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA
除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)RNA分子都來(lái)自DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)錄研究的主要問(wèn)題
①RNA聚合酶 ②轉(zhuǎn)錄過(guò)程 ③轉(zhuǎn)錄后加工 ④轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
①~③是基本內(nèi)容，④是目前研究的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。
轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同：
相同：要有模板，新鏈延伸方向5’→3’，堿基的加入嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。
相異：①?gòu)?fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引物。
②轉(zhuǎn)錄時(shí)，模板DNA的信息全保留，復(fù)制時(shí)模板信息是半保留。
③轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，無(wú)5’→3’及3’→5’外切活性。
轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。
基因表達(dá)的終產(chǎn)物：①RNA ②蛋白質(zhì)
轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及兩個(gè)方面
①RNA合成的酶學(xué)過(guò)程
②RNA合成的起始信號(hào)和終止信號(hào)，即DNA分子上的特定序列。
DNA正鏈：與mRNA序列相同的DNA鏈。
負(fù)鏈：與正鏈互補(bǔ)的DNA鏈。
轉(zhuǎn)錄單位的起點(diǎn)核苷酸為+1，起點(diǎn)右邊為下游（轉(zhuǎn)錄區(qū))，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)左側(cè)為上游，用負(fù)數(shù)表示：-1，-2，-3。
第一節(jié) DNA指導(dǎo)的RNA合成（轉(zhuǎn)錄)
RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱(chēng)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以是一個(gè)基因（真核)，也可以是多個(gè)基因（原核)。
基因的轉(zhuǎn)錄是有選擇性的，細(xì)胞不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和細(xì)胞環(huán)境條件的改變，將轉(zhuǎn)錄不同的基因。
轉(zhuǎn)錄的起始由DNA上的啟動(dòng)子區(qū)控制，轉(zhuǎn)錄的終止由DNA上的終止子控制，轉(zhuǎn)錄是通過(guò)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
一、 RNA聚合酶
RNA合成的基本特征
①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP)
②RNA鏈生長(zhǎng)方向：5’→3’
③不需引物
④需DNA模板
反應(yīng)：
1、 E.coli RNA聚合酶（原核)
E.coli和其它原核細(xì)胞一樣，只有一種RNA聚合酶，合成各種RNA（mRNA、tRNA、rRNA)。
一個(gè)E.coli細(xì)胞中約有7000個(gè)RNA聚合酶分子，在任一時(shí)刻，大部分聚合酶（5000左右)正在參與RNA的合成，具體數(shù)量依生長(zhǎng)條件而定。
E.coli RNA聚合酶全酶|（holoenzyme)分子量46萬(wàn)Da，由六個(gè)亞基組成，α2ββ’ σω，另有兩個(gè)Zn2+。
無(wú)σ亞基的酶叫核心酶，核心酶只能使已開(kāi)始合成的RNA鏈延長(zhǎng)，而不具備起始合成活性，加入σ亞基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亞基稱(chēng)為起始因子。
E.coli RNA聚合酶各亞基的大小與功能：
亞基 亞基數(shù) 分子量（KD) 基因 功能 m.gydjdsj.org.cn
β’ 1 160 rpoC 與模板DNA結(jié)合
β 1 150 rpoB 與核苷酸結(jié)合，起始和催化部位。
σ 1 70 rpoD 起始識(shí)別因子
α 2 37 rpoA 與DNA上啟動(dòng)子結(jié)合
ω 1 9 ---- 不詳
不同的細(xì)菌，β’、β、α亞基分子量變化不大，σ亞基分子量變化較大，44KD~92KD。
σ亞基的功能：核心酶在DNA上滑動(dòng)，σ亞基能增加酶與DNA啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)，增加停留時(shí)間，使聚合酶迅速找到啟動(dòng)子并與之結(jié)合，σ亞基本身無(wú)催化活性。
不同的σ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子，從而表達(dá)不同的基因。
不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亞基有所差別，這決定了原核基因表達(dá)的選擇性。
RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)部分解開(kāi)，轉(zhuǎn)錄后DNA仍然保持雙鏈的結(jié)構(gòu)。
