第一節(jié) 生物能學(xué)的幾個概念
一、 化學(xué)反應(yīng)中的自由能變化及其意義
1、 化學(xué)反應(yīng)中的自由能
自由能：在一個體系中，能夠用來做有用功的那一部分能量稱自由能，用符號G表示。
在恒溫、恒壓下進行的化學(xué)反應(yīng)，其產(chǎn)生有用功的能力可以用反應(yīng)前后自由能的變化來衡量。
自由能的變化：△G = G 產(chǎn)物 — G反應(yīng)物 = △H _ T△S
△G 代表體系的自由能變化，△H代表體系的焓變化，T代表體系的絕對溫度，△S代表體系的熵變化。
焓與熵都是體系的狀態(tài)函數(shù)。
焓代表體系的內(nèi)能與壓力P*體積V之和：H = U + P*V dH = dU + P*dV + V*dP
熵代表體系中能量的分散程度，也就是體系的無序程度：△S = dQ／T ，△S = △S體系+△S環(huán)境 ，只有△S≥0，過程才能自發(fā)進行。
2、 △G是判斷一個過程能否自發(fā)進行的根據(jù)
△G<0，反應(yīng)能自發(fā)進行，能做有用功。
△G>0，反應(yīng)不能自發(fā)進行，必須供給能量。
△G=0，反應(yīng)處于平衡狀態(tài)。
一個放熱反應(yīng)(或吸熱反應(yīng))的總熱量的變化（△H)，不能作為此反應(yīng)能否自發(fā)進行的判據(jù)，只有自由能的變化才是唯一準(zhǔn)確的指標(biāo)。
△G<0僅是反應(yīng)能自發(fā)進行的必要條件，有的反應(yīng)還需催化劑才能進行，催化劑（酶)只能催化自由能變化為負(fù)值的反應(yīng)，如果一個反應(yīng)的自由能變化為正值，酶也無能為力。
當(dāng)△G為正值時，反應(yīng)體系為吸能反應(yīng)，此時只有與放能反應(yīng)相偶聯(lián)，反應(yīng)才能進行。
二、 標(biāo)準(zhǔn)自由能變化及其與化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的關(guān)系
aA+bB → cC+dD
標(biāo)準(zhǔn)自由內(nèi)能變化：在規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件下的自由能變化，用△G°表示。
標(biāo)準(zhǔn)條件：25℃，參加反應(yīng)的物質(zhì)的濃度都是1mol∕L（氣體則是1大氣壓)。若同時定義pH =7.0，則標(biāo)準(zhǔn)自由能變化用△G°′表示。
對于一個溶液中的化學(xué)反應(yīng)：
aA bB → cC + dD
當(dāng)反應(yīng)達到平衡時，△G = 0
K/是化學(xué)反應(yīng)的平衡常數(shù)，因此，△G°/ 也是一個常數(shù)。
常見物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)生成自由能△G°′已經(jīng)列在各種化學(xué)手冊中，可以根據(jù)△G°′= -RT lnK的公式求出平衡常數(shù)K′。
P15 舉例說明如何用K/求出△G o / 和△G
從例子可以看出△G o / 和△G實際上是兩個不同條件下的自由能變化值。
（1) △G o /是標(biāo)準(zhǔn)條件下的自由能變化，既反應(yīng)物A、B、C、D的起始濃度都為1mol/L，溫度為25℃，pH=7.0時的△G。每一個化學(xué)反應(yīng)都有其特定的標(biāo)準(zhǔn)自由能變化（既△G o /)，是一個固定值，
△G是任意給定條件下的自由能變化，它是反應(yīng)物A、B、C、D的起始濃度、溫度、pH的狀態(tài)函數(shù)，在一個自發(fā)進行的化學(xué)反應(yīng)中，自由能總是在降低，△G總是負(fù)值，隨著反應(yīng)向平衡點的趨近，△G的絕對值逐漸縮小，直到為0。
（2) 從△G o / = -RT lnK/，可以求出K/及△G o /，根據(jù)△G o /、△G 與K/可以判斷任何條件下反應(yīng)進行的方向及程度。
三、 自由能變化的可加和性。
在偶聯(lián)的幾個化學(xué)反應(yīng)中，自由能的總變化等于每一步反應(yīng)自由能變化的總和。
例如：Glc+ATP→G—6—P+ADP（總反應(yīng))
第一步，Glc+Pi→G—6—P+H2O,此反應(yīng)不能自發(fā)進行。
第二步，ATP+H2O→ADP+Pi
總反應(yīng)：Glc+ATP→G—6—P+ADP.
因此，一個熱力學(xué)上不能進行的反應(yīng)，可與其它反應(yīng)偶聯(lián)，驅(qū)動整個反應(yīng)進行。此類反應(yīng)在生物體內(nèi)是很普遍的。
四、 高能磷酸化合物
高能化合物：水解時釋放5000卡/mol及以上自由能的化合物。
高能磷酸化合物：水解每摩爾磷酸基能釋放5000cal以上能量的磷酸化合物。
P21 表10-2 某些磷酸化合物水解時的標(biāo)準(zhǔn)自由能變化。
（一) 高能化合物的類型 P18—19
1、 磷氧鍵型。
（1)、 �；姿峄衔铩�
3—磷酸甘油酸磷酸，乙酰磷酸，氨甲酰磷酸，�；佘账�，氨酰腺苷酸。
（2)、 焦磷酸化合物。
無機焦磷酸，ATP，ADP
（3)、 烯醇式磷酸化合物。
磷酸烯醇式丙酮酸。
2、 氮磷鍵型。
磷酸肌酸，磷酸精氨酸。
3、 硫酯鍵型。
3’一磷酸腺苷一5’一磷酰硫酸，�；�輔酶A。
4、 甲硫鍵型。
S一腺苷甲硫氨酸。
（二) ATP的特殊的作用。
1、 是細胞內(nèi)產(chǎn)能反應(yīng)和需能反應(yīng)的化學(xué)偶聯(lián)劑。
2、 在磷酸基轉(zhuǎn)移中的作用 。
Glc進入血液中，唯一出路是磷酸化。G-6-P是Glc的一種活化形式。已糖激酶催化：Glc+ATP→G-6-P+ADP。
3一磷酸甘油是甘油的活化形式，能參與脂肪合成。甘油激酶：甘油+ATP→3一磷酸甘油+ADP。
（三) 磷酸肌酸、磷酸精氨酸的儲能作用 P23
磷酸肌酸是易興奮組織（如肌肉、腦、神經(jīng))唯一的能起暫時儲能作用的物質(zhì)。
磷酸精氨酸是無脊椎動物肌肉中的儲能物質(zhì)
第二節(jié) 生物氧化、氧化電子傳遞鏈和氧化磷酸化作用
一、 生物氧化的概念和特點。
糖，脂，蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)在細胞中進行氧化分解，生成CO2，H2O并釋放出能量，這個過程稱生物氧化。
生物氧化是需氧細胞呼吸代謝過程中的一系列氧化還原作用，又稱細胞氧化或細胞呼吸。
特點：反應(yīng)條件溫和，多步反應(yīng)，逐步放能。
生物氧化在活細胞中進行，pH中性，反應(yīng)條件溫和，一系列酶和電子傳遞體參與氧化過程，逐步氧化，逐步釋放能量，轉(zhuǎn)化成ATP。
真核細胞，生物氧化多在線粒體內(nèi)進行，在不含線粒體的原核細胞中，生物氧化在細胞膜上進行。
圖示 ：生物氧化的三階段
第一階段：多糖，脂，蛋白質(zhì)等分解為構(gòu)造單位——單糖、甘油與脂肪酸、氨基酸，該階段幾乎不釋放化學(xué)能。
第二階段：構(gòu)造單位經(jīng)糖酵解、脂肪酸β氧化、氨基酸氧化等各自的降解途徑分解為丙酮酸、乙酰CoA等少數(shù)幾種共同的中間代謝物物，這些共同的中間代謝物在不同種類物質(zhì)的代謝間起著樞紐作用。該階段釋放少量的能量。
第三階段：丙酮酸、乙酰CoA等經(jīng)過三羧酸循環(huán)徹底氧化為CO2、H2O。釋放大量的能量。
在第二、第三階段中，氧化脫下的電子（H—)經(jīng)過一個氧化的電子傳遞過程（氧化電子傳遞鏈)最終傳給O2，并生成ATP，以這種方式生成ATP的作用稱為氧化磷酸化作用，它是一種很重要的將生物氧化和能量生成相偶連的機制。
生物氧化的終產(chǎn)物是CO2和H2O，CO2的形成是通過三羧酸循環(huán)過程，H2O則是在電子傳遞過程的最后階段生成。
二、 氧化電子傳遞過程
生物氧化過程中形成的還原型輔酶（NADH和FADH2)，通過電子傳遞途徑，使其重新氧化，此過程稱為電子傳遞過程。
在電子傳遞過程中，還原型輔酶中的氫以負(fù)質(zhì)子（H — )形式脫下，其電子經(jīng)一系列的電子傳遞體（電子傳遞鏈)轉(zhuǎn)移，最后轉(zhuǎn)移到分子氧上，質(zhì)子和離子型氧結(jié)合生成H2O。
三、 氧化電子傳遞鏈 P57 圖12-2
由NADH到O2的氧化電子傳遞鏈主要包括FMN、輔酶Q（CoQ)、細胞色素b、c1、c、a,a3及一些鐵硫蛋白。
氧化電子傳遞鏈位于原核生物的質(zhì)膜上，真核生物中位于線粒體的內(nèi)膜上。
電子載體的標(biāo)準(zhǔn)勢能△G o /是逐步下降的，電子沿著電勢升高的方向流動。其中有三個部位的勢能落差△G較大，足以形成ATP（ADP磷酸化需要的自由能=7.3Kal/mol.)。這三個部位正好是氧化磷酸化部位。
細胞內(nèi)供能物質(zhì)的徹底氧化產(chǎn)物是CO2、H2O其中CO2主要是在三羥酸循環(huán)中產(chǎn)生，水是在電子傳遞過程的最后階段產(chǎn)生。
四、 電子傳遞鏈的酶和電子載體
呼吸鏈中的電子載體都是和蛋白質(zhì)結(jié)合存在（包括NAD+、FMN、鐵硫中心、細胞色素)。這些蛋白質(zhì)大都是水不溶性的，嵌在線粒體的內(nèi)膜上。
NAD+是許多脫氫酶的輔酶，F(xiàn)MN是NADH脫氫酶的輔酶。
1、 NAD+和NADP+
脫氫酶分別與NAD+或NADP+結(jié)合，催化底物脫氫，這類酶稱為與NAD（P)相關(guān)的脫氫酶，
多數(shù)脫氫酶以NAD+為輔酶，少數(shù)以NADP+為輔酶（如G-6-P脫氫酶)少數(shù)酶能以NAD+或NADP+兩種輔酶（Glu脫氫酶)。
2、 NADH脫氫酶以及其它黃素蛋白酶類
NADH脫氫酶含F(xiàn)MN輔基，鐵-硫中心。
鐵硫中心鐵的價態(tài)變化（Fe3+→Fe2+)可以將電子從FMN輔基上轉(zhuǎn)移到呼吸鏈下一成員輔酶Q上。
含有核黃素輔基的酶還包括琥珀酸脫氫酶、脂酰CoA脫氫酶等。
3、 輔酶Q（泛醌)
電子傳遞鏈上唯一的非蛋白質(zhì)成分。
輔酶Q在線粒體中有兩種存在形式：膜結(jié)合型、游離型。
輔酶Q不僅可以接受FMN上的氫（NADH脫氫酶)，還可以接受線粒體FADH2上的氫（如琥珀酸脫氫酶、脂酰CoA脫氫酶以及其它黃素酶類)。
4、 細胞色素類。
細胞色素類是含鐵的電子傳遞體，鐵原子處于卟啉的結(jié)構(gòu)中心，構(gòu)成血紅素。
細胞色素類是呼吸鏈中將電子從輔酶Q傳遞到O2的專一酶類。
線粒體的電子傳遞鏈至少含有5種不同的細胞色素：b、c、c1、.a、a3.
細胞色素b有兩種存在形式：b562、b566
細胞色素c是唯一可溶性的細胞色素，同源性很強，可作為生物系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的一個指標(biāo)。
細胞色素a、a3是以復(fù)合物的形式存在，又稱細胞色素氧化酶，將電子從細胞色素c傳到分子O2 。
五、 電子傳遞抑制劑
阻斷呼吸鏈中某一部位的電子傳遞。
1、 魚藤酮、安密妥、殺粉蝶菌素
都可阻斷電子由NADH向CoQ傳遞。
2、 抗霉素A
抑制電子從細胞色素b向細胞色素c1傳遞
3、 氰化物、硫化氫、疊氮化物、CO等。
阻斷電子從細胞色素aa3 向O2傳遞
六、 氧化磷酸化作用
氧化磷酸化作用：電子沿著氧化電子傳遞鏈傳遞的過程中所伴隨的將ADP磷酸化為ATP的作用，或者說是ATP的生成與氧化電子傳遞鏈相偶聯(lián)的磷酸化作用。
底物水平磷酸化作用：是指ATP的形成直接與一個代謝中間物（如PEP)上的磷酸基團轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)的作用。糖酵解中1,3-二磷酸甘油酸，磷酸烯醇丙酮酸。
1、 方程式：
NADP+H++3ADP+3Pi+1/2O2 → NAD++3H2O+3ATP
三個ATP的形成獲取了呼吸鏈中電子由NADH傳遞至氧所產(chǎn)生的全部自由能的42%。（21.9/52.7×100%)。
2、 幾個概念：
（1)、 P/O比
一對電子通過呼吸鏈傳至氧所產(chǎn)生的ATP的分子數(shù)。NADH→3ATP，F(xiàn)ADH2→2ATP
（2)、 ATP生成部位：
三個部位由三個酶復(fù)合體催化：
部位Ⅰ：NADP與CoQ之間，NADH脫氫酶。
部位Ⅱ：CoQ與CytC之間，CytC還原酶。
部位Ⅲ：Cyta與O2之間，CytC氧化酶。
（3)、 呼吸控制
ADP作為關(guān)鍵物質(zhì)，對氧化磷酸化的調(diào)節(jié)作用稱為呼吸控制。
（4)、 解偶聯(lián)劑，（2.4—硝基苯酚)
電子傳遞過程和ATP形成過程相分離，電子傳遞仍可進行，但不能形成ATP。
（5)、 氧化磷酸化抑制劑：
抑制O2的利用和ATP的形成。
七、 氧化磷酸化的偶聯(lián)機理
P71圖12—4，跨膜質(zhì)子移動示意圖
（一) 化學(xué)滲透假說
第十三章 DNA的復(fù)制和修復(fù)
生物體的遺傳信息儲存在DNA中，并通過DNA的復(fù)制由親代傳給子代。在子代的生長發(fā)育中遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。
1958年，F(xiàn).Crick提出中心法則：
（1)以原DNA分子為模板，合成出相同DNA分子的過程。
（2)以某一段DNA分子為模板，合成出與其序列對應(yīng)的RNA分子的過程。
（3)以mRNA為模板，根據(jù)三聯(lián)密碼規(guī)則，合成對應(yīng)蛋白質(zhì)的過程。
中心法則揭示了生物體內(nèi)遺傳信息的傳遞方向。
圖
DNA生物合成有兩種方式：DNA復(fù)制和反轉(zhuǎn)錄
DNA體內(nèi)復(fù)制涉及：原核、真核生物的染色體、細菌質(zhì)粒（環(huán)狀，雙鏈)、真核細胞器DNA（線粒體、葉綠體)、病毒（雙鏈，環(huán)狀)
DNA的體外復(fù)制：分子克隆。
第一節(jié) DNA的復(fù)制
一、 DNA半保留復(fù)制
1953年，Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時就推測DNA可能按照半保留機制進行自我復(fù)制。
P321 圖191 Watson和Crick提出的DNA雙螺旋復(fù)制模型
在復(fù)制過程中，首先親代雙鏈解開，然后每條鏈作為模板，在其上合成互補的子代鏈，結(jié)果新形成的兩個子代DNA與親代DNA分子的堿基順序完全一樣，而且每個子代DNA分子中有一條鏈完全來自親代DNA，另一條是新合成的。
1958年，Meselson和Stahl用15N標(biāo)記E.coli. DNA，證明了DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制。
P322 圖19-2 DNA的半保留復(fù)制。
1963年，Cairns用放射自顯影法，在顯微鏡下首次觀察到完整的正在復(fù)制的E. coli. 染色體DNA。
P323 圖 19-3
3H-脫氧胸苷標(biāo)記E.coli. DNA ，經(jīng)過將近兩代時間，用溶菌酶消化細胞壁，將E.coli. DNA轉(zhuǎn)至膜上，干燥，壓感光膠片，3H放出β粒子，還原銀，在光學(xué)顯微鏡下觀察。用這種方法證明了大腸桿菌染色體DNA是一個環(huán)狀分子，并以半保留的形式進行復(fù)制。
DNA的半保留復(fù)制可以說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過多代復(fù)制，DNA的多核苷酸鏈仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。
二、 復(fù)制起點、單位和方向
DNA的復(fù)制是在起始階段進行控制的，一旦復(fù)制起始，它就會繼續(xù)下去直到整個復(fù)制子完成復(fù)制。
1、 復(fù)制起點
復(fù)制起點是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序列。有時，兩條鏈的復(fù)制起點并不總是在同一點上（如D環(huán)復(fù)制)。
在一個完整的細胞周期中，每一個復(fù)制起點只使用一次，完成一次復(fù)制過程。
多數(shù)生物的復(fù)制起點，都是DNA呼吸作用強烈（甲醛變性實驗)的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富含A.T。
★環(huán)狀DNA復(fù)制起點的確定方法
P325 圖19-6
★復(fù)制起點的克隆和功能分析——重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法
大腸桿菌的復(fù)制起點oriC區(qū)1Kb的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化子中的復(fù)制行為與其染色體一樣，受到嚴(yán)密控制，每個細胞只有1-2個拷貝，用核酸外切酶縮短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能區(qū)，攜帶它的質(zhì)粒依然能夠自我復(fù)制，拷貝數(shù)可以增加到20以上，這說明發(fā)動復(fù)制的序列在245bp的基本功能區(qū)，而決定拷貝數(shù)的序列在基本功能區(qū)之外和1Kb之間。
鼠傷寒沙門氏菌的起點位于一段296bp的DNA片段上，與大腸桿菌的復(fù)制起始區(qū)有86%同源性，而且有些親緣關(guān)系較遠的細菌，其復(fù)制起點在大腸桿菌中亦能起作用。因此，復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)可能是很保守的。
起始序列含有一系列對稱的反向重復(fù)和某些短的成簇的保守序列。
2、 復(fù)制單位
復(fù)制子(Replicon)：Genome能獨立進行復(fù)制的單位，每個復(fù)制子都含有一個復(fù)制起點。
原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個固定的起點開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制后才進行另一條鏈的復(fù)制)。
環(huán)狀DNA的復(fù)制眼象θ，稱θ形復(fù)制。
真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點，因此是多復(fù)制子，每個復(fù)制子約有100-200Kbp。人體細胞平均每個染色體含有1000個復(fù)制子。
病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是單復(fù)制子。
3、 復(fù)制方向
定點起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進行或異速進行)，形成兩個復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個復(fù)制叉。
★用放射自顯影實驗判斷DNA的復(fù)制方向及速度
低放射性3H-脫氧胸苷
高放射性3H-脫氧胸苷
a. 單向
b. 雙向等速 三種結(jié)果圖形
c. 雙向異速
E.coli.的一個溫度敏感株，在42℃時，能使DNA在完成復(fù)制后，不再開始新的復(fù)制過程，而在25℃時復(fù)制功又能能恢復(fù)。
4、 DNA的幾種復(fù)制方式
（1)、 直線雙向復(fù)制
單點，雙向，T7
多點，雙向，真核染色體DNA
（2)、 θ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向或雙向（E .coli.)
（3)、 滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174
（4)、 D環(huán)復(fù)制：線粒體、葉綠體DNA
（5)、 多復(fù)制叉復(fù)制：
第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二輪的復(fù)制。
在E.coli.富營養(yǎng)時，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式。E.coli. DNA的復(fù)制最快可達50Kb/min，完全復(fù)制需40min，富營養(yǎng)時，20min分裂。而真核染色體要6-8小時。
三、 與DNA復(fù)制有關(guān)的酶及蛋白質(zhì)因子
目前已發(fā)現(xiàn)30多種酶及蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制
（一) DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶
DNA生物合成5，→3，，化學(xué)合成3，→5，
1、 DNA聚合反應(yīng)必備的條件
⑴ DNA聚合酶
⑵ DNA模板(反轉(zhuǎn)錄時用RNA模板)
⑶引物 (DNA、RNA或蛋白質(zhì))
⑷ 4種dNTP
⑸ Mg2+
2、 聚合反應(yīng)過程及特點
總反應(yīng)式：
n1dATP DNA pol . dAMP
n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4)PPi
n3dCTP Mg2+ dCMP
n4dTTP dTMP
P329 圖19-10 P330圖19-11
在鏈的延長過程中，鏈的游離3，-羥基，對進入的脫氧核糖核苷三磷酸α磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3，.5，-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。
DNA聚合酶的反應(yīng)特點：
⑴ 以4種dNTP為底物
⑵ 反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)，不能催化游離的dNTP的聚合。
⑶ 反應(yīng)需有引物3，-羥基存在
⑷ 鏈生長方向5， → 3，
⑸ 產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同
3、 由DNA聚合酶催化的幾種DNA聚合類型
P331圖19-12
（1) 發(fā)莢環(huán)結(jié)構(gòu)：加入單鏈DNA作為模板和引物，3＇羥基端回折成引物鏈。
（2) 末端延伸聚合：加入雙鏈DNA作為模板和引物，3’末端突出作為模板。
（3) 分枝型和切口平移型聚合：加入雙鏈DNA，聚合發(fā)生在切口或末端單鏈區(qū)。
（4) 環(huán)形聚合：加入帶引物的環(huán)形DNA作為模板。
4、 E.coli DNA聚合酶
（1)、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell)
單體酶，分子量109Kd，含一個Zn2+，每個細胞中含400個DNA pol.Ⅰ
催化活性：
5， → 3， 聚合活性
3， → 5， 外切活性
5， → 3， 外切活性
用蛋白水解酶將DNA pol.Ⅰ部分水解可得：
大片段（Klenow)，75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。
小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，切除修復(fù))。
Klenow片段的用途：
a 補齊DNA 3，隱縮未端
b. 標(biāo)記DNA片段未端
c．cDNA合成第二鏈
d．d DNA測序
（2)、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell)
單體酶，分子量120Kd
催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)
3，→ 5，外切
可能在DNA的修復(fù)中起某中作用。
（3)、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（復(fù)制酶，10-20 copy/cell)
寡聚酶，全酶由10種共22個亞基組成，α、ε和θ三種亞基組成核心酶。
P334表10-3
DNA pol.Ⅲ是合成新鏈DNA主要的酶，又稱復(fù)制酶(Replicase)
Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于單鏈DNA。
P334 表19-2 E.coli三種DNA聚合酶的性質(zhì)比較
★DNA聚合酶有6個結(jié)合位點
⑴ 模板DNA結(jié)合位點
⑵ 引物結(jié)合位點
⑶ 引物3，-OH位點、反應(yīng)位點
⑷ 底物dNTP結(jié)合位點
⑸ 5， → 3， 外切位點(pol.Ⅱ沒有)
⑹ 3， → 5， 外切位點(校正)
5、 真核生物DNA聚合酶
P334 表19-4 真核生物DNA聚合酶
真核DNA聚合酶一般不具備外切活力，可能由另外的酶在DNA復(fù)制中起校正功能。
⑴ DNA聚合酶α，多亞基，功能與E.coli. pol.Ⅲ類似，是真核DNA復(fù)制酶。
⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。
⑶ DNA聚合酶γ，從線粒體得到，可能與線粒體DNA的復(fù)制有關(guān)。
⑷ DNA聚合酶δ，特點：有3， → 5，外切活力
（二) 引物酶或RNA聚合酶（引發(fā)酶)
細胞內(nèi)，DNA的復(fù)制需要引物（DNA或RNA)，引物酶或RNA聚合酶可合成6-10個堿基的RNA引物。
★DNA復(fù)制為什么要用RNA引物？（為什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？)
P338
⑴從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配
⑵新復(fù)制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對功能難發(fā)揮作用。
（三) 解螺旋酶
大腸桿菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與rep蛋白共同作用，將DNA兩條鏈解開。
解螺旋酶I、II、III沿著模板鏈的5’→3’方向隨著復(fù)制叉的前進而移動，而rep蛋白則在另一條模板鏈上沿3’→5’方向移動。
（四) DNA旋轉(zhuǎn)酶
屬DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進時帶來的扭曲張力。
拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩類：I和II，廣泛存在于原核生物和真核生物。
拓?fù)洚悩?gòu)酶I使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。
拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ使DNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋時需要由ATP供給能量。分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。
（五) 單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)
復(fù)制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈DNA前進，產(chǎn)生單鏈區(qū)，大量的單鏈DNA結(jié)合蛋白與單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和保護單鏈DNA不被核酸酶降解。
（六) DNA連接酶（ligase)
連接雙鏈DNA上的切口。
大腸桿菌連接酶只能在模板上連接DNA缺口。T4DNA ligase即可連接粘性末端的DNA，又可連接平齊末端的雙鏈DNA。
E.coli.和其它細菌的DNA ligase以NAD為能源，動物細胞和噬菌體DNA ligase以ATP為能源。
（七) DNA復(fù)制的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)
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四、 DNA的半不連續(xù)復(fù)制
P336 圖19-15 DNA的半不連續(xù)復(fù)制
DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。
前導(dǎo)鏈：
滯后鏈：
1968年，發(fā)現(xiàn)岡崎片段。長度：
細菌：1Kb-2Kb，相當(dāng)于一個順反子的大小。
真核：100-200bp，約等于一個核小體DNA的長度。
五、 DNA復(fù)制過程（E.coli.)
P342 圖19-17 大腸桿菌的復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖
1、 復(fù)制的起始
引發(fā)：當(dāng)DNA的雙螺旋解開后，合成RNA引物的過程。
引發(fā)體：引物合成酶與各種蛋白質(zhì)因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I)構(gòu)成的復(fù)合體，負(fù)責(zé)RNA引物的合成。
引發(fā)體沿著模板鏈5’→3’方向移動（與岡崎片段合成的方向正好相反，而與復(fù)制叉移動的方向相同)，移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。
E.coli.DNA復(fù)制原點ori C，由245bp組成，三組13bp重復(fù)序列（近5，端處)，四組9 bp重復(fù)序列（另一端處)。
圖
大腸桿菌復(fù)制原點起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)：
DNaA 在原點處打開雙螺旋
DNaB 使DNA解旋
DNaC DNaB結(jié)合在原點所需
Hu 刺激起始
引物酶（DNaG) 合成RNA引物
SSB 結(jié)合單鏈DNA
RNA聚合酶 促進DNaA活性
旋轉(zhuǎn)酶 松馳DNA扭曲應(yīng)力
20個DnaA結(jié)合在四組9bp重復(fù)區(qū)，形成起始復(fù)合物，DNA環(huán)繞此復(fù)合物。
三組13bp重復(fù)區(qū)依次變性，產(chǎn)生開放型復(fù)合物。
DnaB（在DnaC協(xié)助下)與開放復(fù)合物結(jié)合，進一步解鏈。
2、 DNA鏈的延長反應(yīng)
前導(dǎo)鏈只需要一個RNA引物，后隨鏈的每一個岡崎片段都需要一個RNA引物，鏈的延長反應(yīng)由DNA pol.Ⅲ催化。
復(fù)制體：在DNA合成的生長點（既復(fù)制叉上)分布著許多與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，它們在DNA的模板鏈形成離散的復(fù)合物，彼此配合進行高度精確的復(fù)制，稱為復(fù)制體。
復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進就合成DNA。
3、 RNA引物的切除及缺口補齊
DNA polⅠ的5， → 3，外切活力，切除RNA引物。
DNApolⅠ的5， → 3，合成活性補齊缺口。
4、 DNA切口的連接
DNA ligase，動物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。
5、 DNA合成的終止
環(huán)狀DNA、線性DNA，復(fù)制叉相遇即終止。
u 小結(jié)：
⑴ DNA解螺旋酶解開雙鏈DNA。
⑵ SSB結(jié)合于DNA單鏈。
⑶ DNA旋轉(zhuǎn)酶引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進時帶來的扭曲張力。
⑷ DNA引物酶(在引發(fā)體中)合成RNA引物。
⑸ DNA pol.Ⅲ在兩條新生鏈上合成DNA。
⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并補上DNA。
⑺ DNA ligase連接一個岡崎片段。
DNA復(fù)制過程中，聚合酶對dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP摻入DNA鏈中，此時，U-糖苷酶、AP內(nèi)切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。
六、 真核生物DNA的復(fù)制 P343
1、 復(fù)制起點和單位
真核生物染色體DNA是多復(fù)制子，有多個復(fù)制起點，可以多點起始，分段進行復(fù)制。每個復(fù)制子大多在100-200bp之間，比細菌染色體DNA（單復(fù)制子)小得多。
★試驗證據(jù)：5-氟脫氧胞苷標(biāo)記
真核生物DNA復(fù)制叉移動的速度此原核的慢，如哺乳動物復(fù)制叉移動的速度每分鐘1-3Kb，細菌每分鐘5Kb。
真核生物染色體全部復(fù)制完成前，起點不再從新開始復(fù)制。而在快速生長的原核生物中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物在快速生長時，可采用更多的復(fù)制起點同時復(fù)制。如黑腹果蠅，早期胚胎細胞中相鄰復(fù)制起點的平均距離為7.9kb，而在培養(yǎng)的成體細胞中，平均距離為40kb，成體細胞只利用一部分復(fù)制起點。
2、 復(fù)制過程中組蛋白的裝配
核小體的結(jié)構(gòu)（200bp左右)
在真核生物的復(fù)制子上，親代染色體的核小體被逐個打開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代DNA的前導(dǎo)鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，DNA的復(fù)制是半保留的，而組蛋白則是全保留的。
★試驗證據(jù)：環(huán)己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微鏡下觀察
3、 真核生物DNA復(fù)制的終止
端粒：一段DNA序列與蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，是真核細胞染色體末端所特有的結(jié)構(gòu)。
功能：
⑴保證線性DNA的完整復(fù)制
⑵保護染色體末端
⑶決定細胞壽命，胚系細胞含端粒酶，體細胞不表達端粒酶。
端粒（telomeres)分布于線性真核染色體未端。酵母端粒約100bp的重復(fù)序列，形式為：5，（TxGy)n3，(AxCy) n，x和y一般為1—4。
端粒末端的重復(fù)序列，通過端粒酶（telomerase)將其加到染色體末端。
端粒酶含有RNA和蛋白質(zhì)（起DNA聚合酶的作用)兩種組分，RNA分子約159b，含有多個CyAx重復(fù)序列，RNA分子用作端粒TxGy鏈合成的模板。端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，它只合成與酶自身的RNA模板互補的DNA片段。
人類體細胞的端粒長度，隨個體年齡增加而逐漸縮短。細胞每分裂一次，端粒縮短50-200bp，短至1-4Kbp時，細胞就停止分裂。若能重建端粒，則細胞可以永遠分裂。惡性腫瘤細胞端酶表達多。
⑴雜交
圖
⑵聚合
圖
⑶轉(zhuǎn)位再雜交
圖
⑷進一步聚合
圖
⑸非標(biāo)準(zhǔn)GG配對
圖
七、 DNA復(fù)制的調(diào)控
八、 DNA復(fù)制的真實性
《楊岐生》P144
生物體DNA復(fù)制具有高度真實性，復(fù)制107-1011堿基對,只有一個錯誤堿基。
堿基對的自由能通常在4-13KJ/mol，這樣的自由能相當(dāng)于平均參入100個核苷酸就可能出現(xiàn)一次錯配，僅靠Watson-Crick雙螺旋的堿基配對原則，突變率將高達10-2 。
1、 DNA聚合酶對堿基的選擇作用
酶的被動論：不同的核苷酸在聚合位點停留時間不同，正確的dNTP能長時間停留，而參與聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，選擇正確的dNTP摻入引物末端。
酶積極參與理論：DNA聚合酶對正確與錯誤的核苷酸，不僅親和性不同，而且將它們插入DNA引物端的速度也不同。
動力學(xué)校正閱讀：在新的磷酸二酯鍵未形成時，dNTP結(jié)合在酶與模板—引物復(fù)合物的聚合位點上，DNA聚合酶能識別正確與錯誤的dNTP。
DNA聚合酶對底物的識別作用，DNA聚合酶有兩種底物，一種是DNA模板—引物，另一種是dNTP。
DNA聚合酶先識別DNA模板和引物的3，未端，再識別底物dNTP，是一種有序的識別過程。
2、 3，→5，外切活性的校正閱讀
E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可刪除錯誤插入的核苷酸。
缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成時，出現(xiàn)錯誤的幾率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA復(fù)制的真實性，提高1-2個數(shù)量級。
圖
3、 影響DNA合成真實性的因素
⑴高濃度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP)
NMP競爭酶的dNTP結(jié)合位點，抑制3，→5，外切活性。
⑵某一種dNTP濃度銀高,可使引物3，末端離開外切活性中心。
⑶dNTP 一般與二價陽離子結(jié)合成活化形式，Mg2+為主要的二價陽離子。當(dāng)用其它二價陽離子（如Mn2+)代替Mg2+時，會改變酶的主體結(jié)構(gòu)，影響聚合活性和3，→3，外切活性。
4、 為什么用RNA引物
⑴從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配
⑵新復(fù)制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對功能難發(fā)揮作用。
