第四節(jié) 鑒別與結構測定
一、色譜法在黃酮類化合物鑒別中的應用
1.紙色譜(PC)
適用于分離各種天然黃酮類化合物及其苷類的混合物�；旌衔锏蔫b定常采用雙向色譜法。以黃酮苷類為例來說，一般第一向展開采用某種醇性溶劑，如n-BuOH-HAc-H2O(4：1：5上層，BAW)，主要是根據(jù)分配作用原理進行分離。第二向展開溶劑則用水或水溶液，如2%～6%HAc。主要是根據(jù)吸附作用原理進行分離。
黃酮類化合物的苷元中，平面性較強的分子如黃酮、黃酮醇、查耳酮等，用含水類溶劑如3%～5%HAc展開時，幾乎停留在原點不動(Rf<0.02);而非平面性分子如二氫黃酮、二氫黃酮醇、二氫查耳酮等，因親水性較強，故Rf值較大(0.10～0.30)。
黃酮類化合物分子中羥基苷化后，極性即隨之增大，故在醇性展開劑中Rf值相應降低，同一類型苷元，Rf值依次為：苷元>單糖苷>雙糖苷。但在用水或2%～8%HOAc，3%NaCl水溶液或1%HCl展開時，則上列順序將會顛倒，苷元幾乎停留在原點不動，苷類的Rf值可在0.5以上，糖鏈越長，則Rf值越大。
2.硅膠薄層色譜
用于分離與鑒定弱極性的黃酮類化合物較好。分離黃酮苷元常用的展開劑是甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5：4：1)，并可以根據(jù)待分離成分極性的大小適當?shù)卣{整甲苯與甲酸的比例。
3.聚酰胺薄層色譜
適用范圍較廣，特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類。由于聚酰胺對黃酮類化合物吸附能力較強，因而需要用可以破壞其氫鍵締合的溶劑作為展開劑。在大多數(shù)展開劑中含有醇、酸或水。
二、紫外及可見光譜在黃酮類化合物鑒別中的應用
1.測定樣品在甲醇溶液中的UV光譜。
2.測定樣品在甲醇溶液中加入各種診斷試劑后得到的UV及可見光譜。常用的診斷試劑有甲醇鈉(NaOMe)、乙酸鈉(NaOAc)、乙酸鈉-硼酸(NaOAc-H3B03)、三氯化鋁(AlCl3)及三氯化鋁-鹽酸(AlCl3-HCl)等。
3.如樣品為苷類，則可先進行水解，或甲基化后再水解，并測定苷元或其衍生物的UV光譜。各種診斷試劑的詳細配制方法及測定程序可參看有關文獻。
(一)黃酮類化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征
黃酮、黃酮醇等多數(shù)黃酮類化合物，因分子中存在如下所示的桂皮�；氨郊柞；M成的交叉共軛體系，故其甲醇溶液在200～400nm的區(qū)域內(nèi)存在兩個主要的紫外吸收帶，稱為峰帶Ⅰ(300～400nm)及峰帶Ⅱ(220～280nm)。
1.黃酮及黃酮醇類
兩者UV光譜譜形相似，但帶Ⅰ位置不同，可據(jù)此進行分類：黃酮帶Ⅰ<350nm，黃酮醇帶Ⅰ>350nm。
2.查耳酮及橙酮類
共同特征是帶Ⅰ很強，為主峰;而帶Ⅱ則較弱，為次強峰。
3.異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇
這三類化合物中，除有由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ吸收(主峰)外，因B環(huán)不與吡喃酮環(huán)上的羰基共軛(或共軛很弱)，故帶Ⅰ很弱，常在主峰的長波方向處有一肩峰。
根據(jù)主峰的位置，可以區(qū)別異黃酮與二氫黃酮及二氫黃酮醇類。前者在245～270nm，后兩者在270～295nm。
(二)加入診斷試劑后引起的位移及其在結構測定中的意義
三、氫核磁共振在黃酮類化合物結構分析中的應用
(一)A環(huán)質子
1.5,7-二羥基黃酮類化合物
其中，H-6及H-8將分別作為二重峰(J=2.5Hz)，出現(xiàn)在δ5.70～6.90區(qū)域內(nèi)，且H-6信號總是比H-8信號位于較高的磁場區(qū)。當7-OH成苷時，則H-6及H-8信號均向低磁場方向位移。
2.7-羥基黃酮類化合物
A環(huán)上有H-5、H-6、H-8三個芳香質子。
H-5因有C-4位羰基強烈的負屏蔽效應的影響，以及H-6的鄰偶作用，將作為一個二重峰(J=Ca. 9.0Hz)出現(xiàn)在δ8.0左右，位于比其他芳香質子較低的磁場。H-6因有H-5鄰偶(J=Ca. 9.0Hz)及H-8間偶(J=2.5Hz)的作用，將表現(xiàn)為一個雙二重峰。H-8因有H-6的間位偶合作用，故顯現(xiàn)為一個裂距較小的二重峰(J=2.5Hz)。
(二)B環(huán)質子
1.4′-氧取化黃酮類化合物
B環(huán)質子分為H-3′，H-5′和H-2′，H-6′兩組，各以相當于2個氫的雙峰信號((J=8.5Hz)出現(xiàn)在δ6.5～7.9區(qū)域。H-3′，H-5′的化學位移總是比H-2′，H-6′的化學位移值小。
2.3′，4′-二氧取代黃酮類化合物
H-5′為d峰(J=8.5Hz)，出現(xiàn)在δ6.70～7.10處。H-2′(d，J=2.5Hz)和H-6′(dd，J=8.5、2.5Hz)，出現(xiàn)在δ7.20～7.90范圍。
3.3′，4′，5′-三氧取代黃酮類化合物
H-2′及H-6′將作為相當于兩上質子的一個單峰，出現(xiàn)在δ6.50～7.50范圍內(nèi)。
(三)C環(huán)質子
1.黃酮醇類
因為C環(huán)上沒有質子，因此沒有特征峰。
2.黃酮類醫(yī)學全.在.線.提供. m.gydjdsj.org.cn
該類化合物的H-3常常作為一個尖銳的單峰信號出現(xiàn)在δ6.30左右。
3.異黃酮類
異黃酮上的H-2，因正好位于羰基的β位，且通過碳與氧相接，故將作為一個單峰出現(xiàn)在比一般芳香質子較低的磁場區(qū)(δ7.60～7.80)。
4.二氫黃酮及二氫黃酮醇
(1)二氫黃酮
H-2與兩個磁不等同的H-3偶合，故作為一個雙二重峰出現(xiàn)，中心位于δ5.20處。兩個H-3，因有相互偕偶及H-2的鄰偶，將分別作為一個雙二重峰出現(xiàn)，中心位于δ2.80處，但兩組峰常有相互重疊現(xiàn)象。
(2)二氫黃酮醇
在天然存在的二氫黃酮醇中，H-2及H-3多為反式雙直立鍵，故分別作為一個二重峰出現(xiàn)(J=Ca.11.0Hz)。H-2位于δ4.90前后，H-3則位于δ4.30左右，兩者很容易區(qū)分，據(jù)此還可確定C-2及C-3的相對構型，即兩質子互為反式。
(四)糖上的質子
(五)C6-CH3及C8-CH3質子
(六)乙酰氧基的質子
(七)甲氧基上的質子
除若干例外，甲氧基質子信號一般在δ3.50～4.10處出現(xiàn)。
