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關(guān)鍵詞：肝干細(xì)胞
肝干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)50年代末，1956年，F(xiàn)arber［1］將肝內(nèi)可能具有分化潛力的細(xì)胞描述為卵圓細(xì)胞，1958年Wilson和Leduc［2］提出肝干細(xì)胞的概念。近年來，人們發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞移植對急慢性肝臟疾病有明確的治療作用，使之成為消化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文對肝干細(xì)胞及干細(xì)胞移植治療肝病的研究進(jìn)展做一綜述。
1 肝干細(xì)胞的來源與分類
根據(jù)肝臟干細(xì)胞起源的不同，可將其分為肝源性肝臟干細(xì)胞和非肝源性肝臟干細(xì)胞，前者包括卵圓細(xì)胞、分化的肝細(xì)胞、胚胎肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，后者則為源于胚胎干細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞及胰腺上皮干細(xì)胞等不同來源的肝臟干細(xì)胞。在特定條件下，造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞均可轉(zhuǎn)化成肝細(xì)胞。
1.1 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞） ES細(xì)胞來源于早期胚胎,具有多項(xiàng)分化潛能,可以在體內(nèi)或體外分化為多種組織細(xì)胞。Hamazaki等［3］在體外成功地將小鼠ES細(xì)胞定向分化為成熟的肝細(xì)胞,該細(xì)胞能表達(dá)AFP、甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、A2抗胰蛋白酶、白蛋白等肝細(xì)胞特征。Hu等［4］則在直接觀察到體外ES細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中體外ES細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為可分泌AFP、ALB的肝細(xì)胞。
1.2 骨髓干細(xì)胞 骨髓中含有的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增生、分化能力。Lagasse等［5］將骨髓組織細(xì)胞移植給致死量放射線照射鼠，發(fā)現(xiàn)在受鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)骨髓造血干細(xì)胞來源的成熟肝細(xì)胞，提示造血干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Theise等［6］將正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠體內(nèi)，應(yīng)用熒光原位雜交方法檢查雌性小鼠肝臟細(xì)胞Y染色體，發(fā)現(xiàn)雌性小鼠肝臟的部分肝細(xì)胞表達(dá)Y染色體，提示骨髓干細(xì)胞在正常肝臟環(huán)境中能分化為肝細(xì)胞。Petersen等［7］將雄性大鼠骨髓干細(xì)胞移植到致死量放射性肝損傷且肝細(xì)胞增生被抑制的雌性大鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該模型大鼠的部分肝臟細(xì)胞表達(dá)Y染色體，提示骨髓干細(xì)胞不僅在正常肝臟環(huán)境能分化為肝細(xì)胞，而且在肝臟某些病理的環(huán)境中也能分化為肝細(xì)胞。
1.3 胰腺上皮干細(xì)胞 胰腺中存在著肝臟前體細(xì)胞。Wang等［8］用野生型E.colilacZ轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺細(xì)胞移植入同系酪氨酸代謝酶基因（FAH）突變的小鼠脾臟,在小鼠脾臟中能檢測到FAH（+）的肝細(xì)胞團(tuán)。從胰腺分離的胰島前體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可分化為肝上皮細(xì)胞，提示在胚胎發(fā)育過程中,一些原始的多能干細(xì)胞保持著未分化狀態(tài)滯留在機(jī)體組織中。胰腺肝臟細(xì)胞同源性的這一特征，為進(jìn)一步的臨床治療提供了又一肝干細(xì)胞來源。
1.4 肝干細(xì)胞
1.4.1 肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cell） 表現(xiàn)為核大而胞質(zhì)小并具有特殊的細(xì)胞標(biāo)記,細(xì)胞表面高度表達(dá)OV-6、白蛋白、CK等,形態(tài)呈卵圓形。卵圓細(xì)胞來自終末小膽管Hering管細(xì)胞,其數(shù)量與肝損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)。在成年動(dòng)物肝臟內(nèi)肝卵圓細(xì)胞含量非常少,通常情況無法檢測到。
1.4.2 肝小細(xì)胞 與肝卵圓細(xì)胞類似,多在嚴(yán)重肝損傷的情況下,可觀察到肝小細(xì)胞增殖，該細(xì)胞直徑為9~12μm的小型單個(gè)核細(xì)胞,呈鋪路石樣增殖,其性質(zhì)介于肝細(xì)胞與肝管上皮細(xì)胞之間。在急性病毒性肝炎、暴發(fā)性肝衰竭恢復(fù)期、慢性肝炎及肝硬化患者的肝組織中可以觀察到這種細(xì)胞。
2 各種干細(xì)胞分離方法
2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法 骨髓干細(xì)胞主要有兩大類，一類是造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells,HSCs），它是血細(xì)胞的起源細(xì)胞，另一類是骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）。骨髓中MSCs的含量很低，約為0.001%~0.01%，因此應(yīng)用MSCs前，需對其進(jìn)行分離及體外培養(yǎng)擴(kuò)增。目前常用的分離方法為貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分離法，其中流式細(xì)胞儀分選是目前分離骨髓干細(xì)胞的最常用方法之一。
2.2 肝干細(xì)胞的分離方法 目前分選、純化肝干細(xì)胞的方法有密度梯度離心、流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合免疫熒光標(biāo)記單克隆技術(shù)、免疫磁珠分選技術(shù)等,其中密度梯度離心無需特殊儀器及抗體，操作過程簡單，可減少復(fù)雜操作對細(xì)胞活性的損傷，采用protease E選擇性破壞肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞［9］，20μm濾膜濾過清除體積較大細(xì)胞，后經(jīng)Percoll密度梯度離心獲得高產(chǎn)量及活性率的肝干細(xì)胞。
3 急性肝損傷肝干細(xì)胞的激活與增殖
干細(xì)胞在肝損傷時(shí)具有分化增殖為肝細(xì)胞的能力，但給予正常及受損傷的動(dòng)物干細(xì)胞治療時(shí)，發(fā)現(xiàn)只在受損傷的動(dòng)物觀察到干細(xì)胞的分化與增殖，正常動(dòng)物肝臟組織并無外源性干細(xì)胞生長跡象。說明細(xì)胞對于生長信號(hào)的反應(yīng)因損傷的程度大小而異。正常肝臟中，肝干細(xì)胞處于休眠期，不分裂增生，當(dāng)肝干細(xì)胞被激活后，必須在適宜的微環(huán)境中才能分化成熟。當(dāng)部分肝細(xì)胞死亡和（或）暴露于有毒性物質(zhì)時(shí)，卵圓細(xì)胞開始增生、分化為肝細(xì)胞，補(bǔ)充丟失或死亡的細(xì)胞。此外，造血干細(xì)胞只能在肝臟中分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。肝干細(xì)胞的擴(kuò)增和分化是一個(gè)復(fù)雜過程，在該過程中，肝臟微環(huán)境和多種細(xì)胞因子、分化因子的表達(dá)起重要作用。Thorgeirsson等經(jīng)過一系列研究認(rèn)為參與肝干細(xì)胞增生和分化的因子包括干細(xì)胞因子及其受體c-kit系統(tǒng)、干擾素γ，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）。另外，還包括與肝臟再生有關(guān)的生長因子:表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）和成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）家族等。國內(nèi)姚鵬等［10］報(bào)道HGF,表EGF、FGP能促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的增生、分化，TGF-β能誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞的凋亡，而TNP-α、IL-6對骨髓干細(xì)胞的生長無明顯影響。目前很難確定促進(jìn)和誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化及擴(kuò)增的關(guān)鍵因素，這也是影響肝干細(xì)胞臨床應(yīng)用的一個(gè)難題。
4 干細(xì)胞移植治療急慢性肝臟疾病
肝干細(xì)胞的移植方法較多，常用方法包括腹腔移植、脾移植、門靜脈移植、肝動(dòng)脈移植等。目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行較廣泛，各種途徑的移植應(yīng)用于急慢性肝病的治療，而臨床上主要以肝動(dòng)脈方式移植最為常用。
4.1 腹腔內(nèi)移植 腹腔是干細(xì)胞移植最方便易行的治療方法，但由于其有效的作用主要是通過肝臟受損傷時(shí)干細(xì)胞提供的細(xì)胞因子的作用，而并非腹腔內(nèi)干細(xì)胞的增殖與分化的作用。且受腹腔內(nèi)干細(xì)胞分化、增殖條件的限制，基本無臨床應(yīng)用前景。
4.2 脾內(nèi)移植 Shi Z等［11］經(jīng)脾臟進(jìn)行胚胎干細(xì)胞移植治療Wilson’s病模型鼠，移植后第2、4周，在肝內(nèi)可見胚胎干細(xì)胞來源的干細(xì)胞增殖。說明脾臟內(nèi)移植的胚胎干細(xì)胞有分化為成熟肝細(xì)胞的能力。蘇娟等［12］采用人胎肝干細(xì)胞在小鼠腹腔及脾內(nèi)移植，移植后觀察結(jié)果證明了胎肝干細(xì)胞能在損傷肝臟中增殖并分化為肝細(xì)胞。移植在脾臟的干細(xì)胞雖然能在短期內(nèi)達(dá)到改善肝功能的目的，但由于其不能在脾臟內(nèi)形成有效的肝小葉等排泌結(jié)構(gòu)，其依賴于脾臟內(nèi)干細(xì)胞的分化，長期效果主要是來源于由脾臟回流到肝臟的干細(xì)胞的分化增殖。
4.3 門靜脈或肝內(nèi)移植 理論上肝臟本身是肝細(xì)胞移植的最佳器官，因?yàn)殚T脈內(nèi)含高濃度的嗜肝細(xì)胞因子和局部生長因子。Lagasse等［5］將純化正常小鼠的骨髓造血干細(xì)胞（HBSC）經(jīng)靜脈移植給有代謝性肝病（酪氨酸血癥Ⅰ型）的小鼠，發(fā)現(xiàn)能逆轉(zhuǎn)后者的肝功能、延長其壽命。Akushida T等［13］通過門靜脈進(jìn)行干細(xì)胞移植治療Wilson’s病模型小鼠，移植后14天，肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞，而腹腔內(nèi)移植則無此發(fā)現(xiàn)。Fan TX等［14］在此途徑進(jìn)行干細(xì)胞移植時(shí)也有類似發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可經(jīng)肝臟種植于脾及骨髓中。經(jīng)門靜脈移植的多篇文獻(xiàn)顯示，干細(xì)胞可在不改變器官微結(jié)構(gòu)的情況下與受體肝實(shí)質(zhì)相融合。但臨床應(yīng)用中，移植后門靜脈及肝小靜脈血栓形成是影響其廣泛應(yīng)用的又一障礙。
4.4 肝動(dòng)脈移植 姚鵬等［15］采取患者自體骨髓分離純化骨髓干細(xì)胞，行肝動(dòng)脈方式移植入肝臟中治療慢性肝功能衰竭。結(jié)果自體骨髓干細(xì)胞移植治療8周后，移植組患者臨床癥狀、肝功能和凝血機(jī)制明顯改善。張強(qiáng)等［16］報(bào)道同樣方法經(jīng)肝動(dòng)脈自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化患者，結(jié)果20例患者中14例有效，6例無效，收到良好短期療效。由于臨床工作只是起步階段，但有效的臨床結(jié)果令人鼓舞。
5 肝干細(xì)胞移植治療肝病的展望
隨著肝干細(xì)胞研究的深入，以下問題的解決，可能會(huì)推動(dòng)干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用：（1）自體干細(xì)胞分離方法的簡化和體外擴(kuò)增速度的加快，是決定其用于治療急性肝病的重要因素；（2）加強(qiáng)對干細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)制的研究，防止向腫瘤細(xì)胞分化；（3）移植途徑的簡單化，經(jīng)皮經(jīng)肝的門靜脈移植可能是治療肝病的最簡單的有效方法，如何預(yù)防移植后血栓的形成是一個(gè)較重要的課題；（4）進(jìn)一步研究與干細(xì)胞嗜肝特性相關(guān)因子，最終達(dá)到經(jīng)外周血進(jìn)行干細(xì)胞移植治療肝病的目的；（5）開展干細(xì)胞基因修飾后移植治療遺傳性疾病及其他基因異常疾病的研究。
總之，肝干細(xì)胞移植治療急慢性肝病治療的基礎(chǔ)與臨床研究均較活躍，隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入與廣泛的臨床應(yīng)用，在不遠(yuǎn)的將來，干細(xì)胞移植治療將給患者帶來更大的福音。
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