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關(guān)鍵詞： 核酶；基因治療
摘要：80年代初，由美國科學(xué)家Cech和Altman發(fā)現(xiàn)了核酶（Ribozyme）,隨著人類基因工程研究的深入，部分臨床實驗室工作者和基礎(chǔ)科學(xué)研究人員開始注意到Ribozym在基因治療中的應(yīng)用潛力。近幾年來，人們利用Ribozyme可以特異性地切割靶RNA序列的特點，設(shè)計適合的Ribozyme阻斷特定基因的表達，相繼對艾滋病、腫瘤、生殖系統(tǒng)疾病、肝炎、白血病、移植排斥反應(yīng)等疾病進行了大量研究。試驗結(jié)果表明Ribozyme作為基因治療的一種方法有著廣闊的應(yīng)用前景和極大的臨床實用價值。
Advance in Study of Gene Therapy by Ribozyme
核酶(Ribozyme)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列。迄今，人們發(fā)現(xiàn)的核酶有六種類型，即1類內(nèi)含子、RNaseP、錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶、丁型肝炎核酶及VS核酶，但從結(jié)構(gòu)上看主要分為兩大類［1］：錘頭狀核酶和發(fā)夾狀核酶。錘頭狀核酶長約30個核苷酸，由三個堿基配對的螺旋區(qū)、兩個單鏈區(qū)和膨出的核苷酸構(gòu)成。該酶可分為3個部分，中間是以單鏈形式存在的13個保守核苷酸和螺旋Ⅱ組成的催化核心，兩側(cè)的螺旋Ⅰ/Ⅲ為可變序列，共同組成特異性序列，決定核酶的特異性。發(fā)夾狀核酶切割活性所需最小長度為50個核苷酸，其中15個是必需的。該酶由4個螺旋區(qū)（H）和數(shù)個環(huán)狀區(qū)（J）組成 。螺旋Ⅰ、Ⅱ 的主要功能是與靶序列結(jié)合，決定核酶切割部位的特異性，螺旋Ⅲ配對堿基及其3′端的未配對堿基均為切割活性所必需。核酶的作用原理為核酶的特異性序列通過互補堿基對形成識別并結(jié)合特異性靶RNA，根據(jù)這一特性可以人工設(shè)計針對某一RNA的核酶分子，破壞病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而對機體無害，將針對多個位點的核酶序列串連成一個多靶位核酶分子可以大大提高切割效率，達到治療目的。因為其獨特的優(yōu)點：（1）序列特異性；（2）不編碼蛋白質(zhì)，無免疫原性；（3）可以重復(fù)使用。使其在基因治療領(lǐng)域中倍受青睞，其研究進展也相當(dāng)迅速。
基因治療是目前分子水平研究領(lǐng)域中的一個熱點，即將具有正常功能的基因置換或增補患者體內(nèi)缺陷的基因,從而達到治療目的。經(jīng)過國內(nèi)外科學(xué)家十余年的努力，基因治療已從實驗室研究階段過渡到臨床試用階段，其治療范圍已從過去的單基因疾病擴大至多基因疾病，治療病種涉及面廣，目前成為臨床治療一種很有潛力的新方法。
1 核酶在抗HIV中的研究進展
HIV可分為HIV-1和HIV-2，至少可以編碼9種蛋白，研究者從不同角度選擇合適的靶基因。HIV的PBS（Primer binding site）是一個18核苷酸序列和tRNA的3′末端互補。實驗分析展示這段序列是一段高度保守序列，Amer等［2］針對這段序列設(shè)計了錘頭狀核酶，抑制了HIV-1在體內(nèi)的復(fù)制，5′端引導(dǎo)序列是一個誘導(dǎo)區(qū)域，對所有HIVRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯都十分重要。通常在此位置剪切產(chǎn)生5′片段，可競爭抑制HIV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。Weersinghe等［3］以此為靶位點，設(shè)計了不同的核酶，使HIV-1的表達下降達95%。Phylactou等［4］在ф位點設(shè)計剪切位點，此位點是HIV的包裝序列，使P24表達水平下降80%～90%。Westaway等［5］設(shè)計錘頭狀核酶剪切U5 破壞HIV的翻譯，U5區(qū)是連接mRNA帽狀結(jié)構(gòu)的起始區(qū)，此實驗取得理想的結(jié)果。Wang等［6］相繼報道了抗HIV-1新的核酶靶位點：nef開放讀碼框，細(xì)胞內(nèi)的研究結(jié)果表明，核酶可在逆轉(zhuǎn)錄開始和原病毒DNA整合前發(fā)揮有效作用。因此認(rèn)為nef開放讀碼框是核酶抗HIV-1感染的新的有效靶位點。HIV-1tat基因是反式激活基因，對HIV的復(fù)制至關(guān)重要，Konopka等［7］針對tat基因的編碼區(qū)設(shè)計錘頭狀核酶RZ2,將其克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，轉(zhuǎn)染到人外周血T淋巴細(xì)胞，檢測RZ2的活性，實驗證明此核酶有效抑制HIV-1ⅢB的復(fù)制。
為提高核酶的切割效率，對設(shè)計合成后的核酶可采用體外修飾，通常對2′-OH進行修飾。實驗證明其體外活性可提高6倍，穩(wěn)定性提高2倍。據(jù)報道國外一些實驗室已設(shè)計出第二代核酶，針對靶RNA分子的不同位點進行破壞，大大提高核酶的剪切效率。Chen等設(shè)計了9位點核酶，Sun等設(shè)計了3位點核酶抑制HIV-1的轉(zhuǎn)錄。Alessandro等［8］在前體RNA被剪切和轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)之前，設(shè)計特異性的核酶并將其插入剪接體U1小核RNA（SnRNA）中，其衍生物和反向mRNA5′端剪切位點互補，在人類T細(xì)胞系中測試該核酶的活性。結(jié)果顯示該核酶抑制HIV-1在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，并使P24表達水平大大降低。Koizumi等［9］設(shè)計了三種核酶，一個發(fā)夾狀核酶HR112，兩個錘頭狀核酶RZ115和RZ119，分別導(dǎo)入CEM細(xì)胞系中，特異性地切割HIV-1RNA長末端重復(fù)序列（Long terminal repeat，LTR）的U5區(qū)，結(jié)果顯示此三種核酶具有抗HIV-1ⅢB的作用，且HR112和RZ119有極強的抗HIV-1感染作用。
2 核酶在抗生殖道感染的研究進展
尖銳濕疣（Condyioma accuminatum）又稱生殖道疣，是一種由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的性傳播疾病。近30年來，其發(fā)病率持續(xù)增高，已鑒定的HPV有70多型，其中與尖銳濕疣最為相關(guān)的是HPV6、11型，其HPV早期基因組（E1、E2、E4、E5、E6和E7基因）的轉(zhuǎn)錄是HPV在宿主細(xì)胞中增殖的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)在于上游調(diào)控區(qū)（LCR）中，調(diào)控蛋白是E2蛋白，為45～48KD，以二聚體形式結(jié)合于DNA，全長E2蛋白是一個典型的反式激活蛋白，它能以二聚體的活性形式特異的結(jié)合于上游調(diào)控區(qū)的E2結(jié)合位點ACCN6GGT，可使HPV早期基因組的轉(zhuǎn)錄水平提高20～100倍。此外E1是HPVDNA的復(fù)制蛋白，復(fù)制結(jié)構(gòu)功能域位于蛋白的末端，E1功能的實現(xiàn)是通過與上游調(diào)控區(qū)（URR）中的復(fù)制起點（0rigin,Ori）內(nèi)跨越nt1位，長18bp的一段反向重復(fù)結(jié)構(gòu)結(jié)合后發(fā)揮ATP酶依賴的DNA解旋酶作用而開始從ori起始整個HPV基因組DNA復(fù)制的。E6基因能與抑癌基因p53的產(chǎn)物及細(xì)胞內(nèi)的E6相關(guān)蛋白（E6-AP）結(jié)合而導(dǎo)致p53基因降解失活，E7蛋白與Rb抑癌基因的結(jié)合影響Rb與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，使E2F與Rb分離而影響Rb表達。Huang等針對HPV6a 6b、11E1 mRNA的3′端和E2 mRNA的5′端（兩個起始密碼子AUG之間的區(qū)域）中的保守序列，分別設(shè)計合成具有反義抑制和切割活性的錘頭狀核酶，進行體外切割實驗，篩選出具有高效切割活性的2～3種核酶，分別合成Ribozyme的基因串聯(lián)后形成多功能Ribozyme基因，并合成只具有反義作用的反義基因作對照。
宮頸瘤是常見的人類生殖道腫瘤，研究證實宮頸瘤組織及其細(xì)胞系中，一般都有HPVE6/E7基因的高水平表達，HPVE6/E7蛋白可通過其N-端38個氨基酸與腫瘤抑制基因產(chǎn)物RB蛋白結(jié)合而使其功能失活，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂和細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定。Alvarez等［10］針對HPV16E6/E75端和3斷設(shè)計出抗E6/E7的發(fā)夾狀核酶RZ343和RZ523特異性切割E6、E7RNA片段，應(yīng)用啟動子RSV-LTR提高轉(zhuǎn)錄效率，通過鈣-磷酸鹽共沉淀法將pRSV-RZ523導(dǎo)入CV-1細(xì)胞糸中，斑點-印跡雜交法顯示此核酶在CV-1細(xì)胞中高效表達，密度掃描結(jié)果顯示表達水平約為9.0pmol/106個細(xì)胞，表達的活性核酶的量至少為50fmol/106個細(xì)胞，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)4周后，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，說明核酶的長期表達對細(xì)胞本身無明顯的毒性影響。通過Rnase保護測定結(jié)果（Result of RNase protection assay）表明，在CV-1細(xì)胞中的E7RNA片段減少90%，有效抑制E7基因的表達。Chen等［11］分別針對核酸位點123nt、309nt、671nt設(shè)計三種錘頭狀核酶切割HPV-18E6/E7基因，核酶在靶位點進行雜交，比率為20：1，體外活性切割實驗表明，三種核酶均有效抑制E6/E7基因轉(zhuǎn)錄，其中RZ309切割效率最高。Lu等［12］設(shè)計兩種核酶，切割編碼HPV-16E6/E7開放閱讀框架（Open reading frames ORF）的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，切割位點為病毒基因鏈RNA上的110nt和558nt，將其插入到腺病毒載體，采用T7噬菌體啟動子，實驗結(jié)果顯示此兩種酶大大降低HPV-16E6/E7基因的表達。
3 核酶在抗肝炎病毒中的研究進展
我國是肝炎病毒感染的高發(fā)區(qū)，一直以來肝炎的治療是臨床醫(yī)生頗為關(guān)注的問題。Birikh等［13］用一條合成的寡脫氧核苷酸鏈而來的三個核酶同時進行實驗發(fā)現(xiàn)，HBVRNA可被核酶介導(dǎo)切割，從同一DNA模板轉(zhuǎn)錄的3條核酶可同時發(fā)揮作用，多核酶的表達將有益于對抗高的病毒目標(biāo)序列變異。Aoki等［14］設(shè)計合成了針對HBVayw株P(guān)基因5′端2360位點的RCP，其作用底物為HBVaywP基因的翻譯起始區(qū)（2140～2422區(qū)段），并將該核酶基因克隆到表達載體pSVL上，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該核酶的基因引入到HepG2215細(xì)胞中(HepG2215細(xì)胞系由頭尾相接的HBV對拷貝基因組轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG而建立的一株能穩(wěn)定分泌HBV各種抗原和完整病毒顆粒的細(xì)胞系)。實驗證明，針對P基因5′端的核酶RCP對HbeAg和HbcAg的表達有一定程度抑制作用。Phylactou等首次使用發(fā)夾式核酶，作為抗HCV感染的有效治療物質(zhì)，阻礙病毒基因組的復(fù)制，保護細(xì)胞免受HCV感染，其設(shè)計合成的核酶針對5′-非翻譯區(qū)（5-UTR）及編碼衣殼蛋白的區(qū)域，實驗表明針對編碼HCV衣殼蛋白區(qū)域的核酶成為有希望抗HCV感染的一種治療途徑。Leontis等［15］使用了5-NCR翻譯有關(guān)的蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)作為敏感的定量研究方法，分別設(shè)計出針對核酸位點136-160，313-317，496-520，及對373-388的四種核酶，證實核酶1、4在無細(xì)胞環(huán)境中均有效。而2、4在細(xì)胞內(nèi)有效。推測核酶1、3的目標(biāo)位點可能為雙鏈區(qū)，而核酶2、4目標(biāo)位點可能為單鏈區(qū)。
Langon等［16］針對HDV設(shè)計合成特異性核酶，切割位點位于基因鏈RNA的688/689nt和反基因鏈RNA的903/904nt，其切割活性的最短序列為84nt,所設(shè)計的核酶為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，通過對反基因鏈RNA核酶25個位置進行代償突變和共突變的實驗，發(fā)現(xiàn)有8對堿基在空間結(jié)構(gòu)上發(fā)揮相互作用。HDV核酶的研究對肝炎疾病的基因治療帶來了希望。
4 核酶在抗白血病中的研究進展
bcr-abl融合基因編碼的具有異常蛋白酪氨酸激酶活性的p210蛋白是導(dǎo)致慢粒細(xì)胞白血病（Chronic myoloid leukemia, CML）發(fā)生的主要原因。Daley等［17］對bcl-abc融合基因cDNA序列，在融合位點的上游第-296bp,-1bp及下游15bp處分別設(shè)計3個相鄰的錘頭狀核酶基因及側(cè)翼序列，用于核酶的相互連接。實驗結(jié)果顯示，以上3個核酶均可特異性結(jié)合于融合基因mRNA 相應(yīng)位點，給多步基因重組后，3個單核酶按相應(yīng)順序定向克隆到pDES載體中，構(gòu)建成功單核酶pDES-RZ1，雙核酶pDES-RZ12及三核酶切割載體pDES-RZ123。三核酶的聯(lián)合作用明顯提高核酶切割效率，抑制了融合蛋白的激酶活性。在急性早幼粒白血病病人（Acute promyelocytic leukemia,APL FAB，M3）中,t(15,17)的重新排列產(chǎn)生了一個融合性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Fusion transcript)PML/RARа,而PML/RARа的表達和白血病基因的復(fù)制及治療藥物全反式維甲酸的作用密切相關(guān)。Nason等［18］針對PML/RARаmRNA設(shè)計合成錘頭狀核酶APL1.1(51nt)，將其克隆到pGEM4載體中，采用T7啟動子，用ECORⅠ酶切，在NB4APL細(xì)胞中表達，培養(yǎng)周期6天，剪切過程中核酶5′端和3′端自動釋放，試驗結(jié)果顯示PML/RARа蛋白在該細(xì)胞中表達明顯降低。
5 核酶在抗移植排斥反應(yīng)的研究進展
同種異型骨髓移植常易發(fā)生移植排斥反應(yīng)，長期以來是臨床醫(yī)生最焦慮的問題，用嚙齒類動物建立模型研究穿孔素（Perforin）和FAS配體（FAS L），此為兩種獨立的裂解途徑組成成分，大量實驗顯示這兩種成分誘導(dǎo)了移植排斥反應(yīng)。Du等［19］設(shè)計兩種錘頭狀核酶在CTLL-2細(xì)胞中高效切割靶RNA的穿孔素和FAS配體，在tRNA誘導(dǎo)的RNA多聚酶Ⅲ啟動子表達這兩種核酶，將其插入來源于乳頭瘤病毒多拷貝質(zhì)粒，構(gòu)建嵌合型有特異性二級結(jié)構(gòu)的抗穿孔素和抗FASLtRNA核酶，此二級結(jié)構(gòu)能使核酶易從tRNA功能域中分離出來。實驗結(jié)果分析表明成功構(gòu)建的核酶在CELL-2細(xì)胞中使穿孔素和FAS配體基因表達明顯降低。
綜上所述，近幾年來隨著對核酶研究的深入，為人類在基因治療的道路上帶來了曙光。由于其可以無法恢復(fù)地使靶基因失活，可在體外循環(huán)使用，并且其催化效率較反義寡核苷酸明顯提高等獨特優(yōu)勢而受到科研工作者的關(guān)注。10年來在治療研究領(lǐng)域中所取得的重大進展都表明核酶在臨床疾病的治療中具有極大的潛在應(yīng)用前景。但是核酶技術(shù)尚未完善，靶位點的最佳選擇、載體的選擇、導(dǎo)入體內(nèi)的穩(wěn)定性、切割效率，這些因素都阻礙著核酶在臨床疾病基因治療上的實施。近來，伴隨著多位點核酶的設(shè)計并將其串聯(lián)組成多功能核酶提高切割效率，運用逆轉(zhuǎn)錄載體技術(shù)的提高，對核酶進行化學(xué)修飾，及陽離子脂質(zhì)體導(dǎo)入技術(shù)的發(fā)展都給核酶技術(shù)的研究帶來更大的希望。不久的將來，核酶會成為一種極有前途的抗病藥物，其特異性、高效性將在人類基因治療領(lǐng)域中取得一定成果。
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