中國(guó)幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌在雙相培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的特性

幽門螺桿菌（Helicobacter Pylori, Hp)的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為在人類胃炎病原學(xué)中具有重要的作用，此菌1982年首次發(fā)現(xiàn)，由Marshall等所描述并命名為Campylobacter Pyloridis，后來(lái)根據(jù)國(guó)際細(xì)菌命名規(guī)則（ICNB)改正為C.Pylori。1989年Goodwin等建議把Hp從彎曲菌屬劃出來(lái)，而成立一個(gè)新的屬，稱為幽門螺桿菌（HelicobacterPylori, Hp)，目前已在國(guó)際性刊物和國(guó)際會(huì)議上應(yīng)用此名稱。幽門螺桿菌為微需氧菌，地氧較敏感，此菌營(yíng)養(yǎng)要求高，在普遍蛋白胨水或肉湯中不能生長(zhǎng)，在固體培養(yǎng)基上Goodwin（1985)推薦以腦一心浸液瓊脂為基礎(chǔ)，加入7%馬血清，1%Isovitalix(BBL)，萬(wàn)古霉素2mg/L，萘啶酮酸20mg/L，兩性霉素2mg/L。該菌最適宜生長(zhǎng)溫度37°C，42°C條件下則不能生長(zhǎng)，37°C下培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)3d～4d后在微氧條件下，固體培養(yǎng)基上可0.5mm～1mm直徑灰白色透明的菌落，在血平皿上有時(shí)可見(jiàn)菌落周圍有輕度溶血，該菌培養(yǎng)時(shí)要求溫度高，尤其初代分離時(shí)，相對(duì)濕度至少要在98%以上，為此我們用布氏瓊脂液體一固體雙相培養(yǎng)基，對(duì)幽門螺桿菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽門螺桿菌89404株自北京市積水潭醫(yī)院球潰瘍病患者的胃粘膜中分離；菌株鑒定結(jié)果：氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性。1%甘氨酸生長(zhǎng)，馬尿酸水解為陰性，37°C生長(zhǎng)（+)，25°C生長(zhǎng)為（－)。在3.5%NaCl中不生長(zhǎng)，對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、痢特靈等敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素抗藥，在布氏血瓊脂上生長(zhǎng)良好，有輕微溶血。

1.2 液體—固體雙相培養(yǎng)基的制備取25cm3組織培養(yǎng)瓶，高壓來(lái)菌后加入6%脫纖維羊血布氏瓊脂20ml，平放，待凝固后，將瓶子垂直，再加入新鮮配制的布氏肉湯9ml，置4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將全羊備注中加89404的菌株自-70°C冷凍保存的幽門螺桿菌融化，取0.2ml菌液接種在6%布氏血瓊脂平思慮中，于5%O2，10%CO2，85%N2的混合氣體條件下于37°C培養(yǎng)3d后觀察，選取新培養(yǎng)的Hp89404用10%小牛血清布氏肉湯（pH7.2)洗下，作1:10稀釋，每個(gè)嘗試各換1支吸管，再經(jīng)充分混勻后，取10^-4及10^-5兩管進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，然后取10^-4 菌液1ml(10.15×10²cfu/ml)，直接接種在液體—固體雙相培養(yǎng)基中，此時(shí)按0h培養(yǎng)的菌數(shù)計(jì)算，即在雙相布氏血瓊脂培養(yǎng)中，每毫升含菌液濃度為1.02×10²/cfu/ml，然后將雙相培養(yǎng)物置混合氣體培養(yǎng)箱中，經(jīng)不同時(shí)間（24h～144h)在布氏血瓊脂平皿上進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定。

1.4 pH值測(cè)定 將不同時(shí)間的菌株液取出，用精密pH試紙測(cè)定培養(yǎng)液的pH值，在測(cè)定前預(yù)備試驗(yàn)用數(shù)字式電pH樣校正。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺桿菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特點(diǎn)

在固體布氏血瓊脂平皿上，經(jīng)37°C48hm.gydjdsj.org.cn/zhuyuan/混合氣體培養(yǎng)后，用10%小牛血清布氏湯洗下，菌液濃度掃標(biāo)準(zhǔn)比濁管18億/ml菌配制，按10倍稀釋法，取10-4管接種子固體布氏血瓊脂上，經(jīng)37°C72h培養(yǎng)后，菌落計(jì)數(shù)為1.02×10²cfu/ml，同樣以10-4接種在雙上培養(yǎng)基則為1.14×10⁴cfu/ml，而且在雙相培養(yǎng)基上菌形彎曲較固體培養(yǎng)基上典型，球狀菌體數(shù)量也較少。

2.2 Hp89404在雙相培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特點(diǎn)

為了解幽門螺桿菌生長(zhǎng)特點(diǎn)，選擇自胃病患者胃粘膜標(biāo)本中分離的菌株（Hp89404)，采用布氏瓊脂雙相培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于不同時(shí)間各取培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)還進(jìn)行pH值測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 幽門螺桿菌（89404)在布氏血雙相培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

從附表可見(jiàn)，幽門螺桿菌經(jīng)培養(yǎng)0～24h，上潛伏期到緩慢生長(zhǎng)期，在血雙相培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)12h～20h開(kāi)始出現(xiàn)渾濁，24h～48h以后，即可出現(xiàn)迅速對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并持續(xù)到120h，達(dá)到生長(zhǎng)高峰，此時(shí)菌落數(shù)最高達(dá)2.87×10⁵cfu/ml，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落單位形成數(shù)則漸次下降，在144h時(shí)菌數(shù)為9.75104cfu/ml。從顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，培養(yǎng)24h～48h,見(jiàn)菌形呈較為典型的彎曲形、螺桿狀或海鷗展翅樣，到72h～96h為多形態(tài)性，有球狀菌形出現(xiàn)。從液相培養(yǎng)液pH測(cè)定中24h～144h表明pH上原來(lái)7.2下降到6.4～6.9。

3 討論

幽門螺桿菌的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)條件要求較高，胃粘膜培養(yǎng)物在固體培養(yǎng)基布氏血瓊脂條件下，經(jīng)37°C24h～48h微氧培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，在固體培養(yǎng)基上可見(jiàn)成睛集落細(xì)小 的灰白色透明的菌苔，初代培養(yǎng)經(jīng)鏡檢形態(tài)為典型海鷗展翅樣或S形彎曲菌，但經(jīng)繼代培養(yǎng)，特別是72h以后的培養(yǎng)物菌體�？勺兂啥嘈螒B(tài)性，微球形則尤為多見(jiàn)，用雙相培養(yǎng)物菌液均勻混濁，菌生長(zhǎng)較快，保存時(shí)間相對(duì)也較長(zhǎng)，這是否由于液體—固體雙m.gydjdsj.org.cn/shouyi/相培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)及溫度均有利幽門螺桿菌的存活，有待進(jìn)一步研究。