1 免疫
1.1 動物
選用體重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。
將動物隨機分為三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，為保證攻擊后有16只或20只小白鼠，可適當(dāng)多免疫幾只小白鼠)，同時飼養(yǎng)健康小白鼠55只，備做對照用。
1.2 免疫原稀釋
將百日咳原液用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然后再稀釋7.5×、37.5×、www.med126.com187.5×，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然后再稀釋成每ml含1.0IU（0.125ml)、0.2IU（0.025ml)及0.04IU（0.005ml)。
1.3 免疫方法
將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。
2 攻擊菌及攻擊菌液的制備
2.1 菌種
小白鼠腦內(nèi)攻擊用58030（18323)菌株。
2.2 培養(yǎng)基
可用包-姜氏培養(yǎng)基（含羊血20%～30%)或其他適宜的培養(yǎng)基。
2.3 培養(yǎng)溫度及時間
放35～37℃培育，第一代不超過72小時，攻擊時菌種的培育時間為20～24小時。原代菌種放2～8℃可保存2周。
2.4攻擊菌液的制備
將培育20～24小時的菌苔經(jīng)肉眼檢查為純菌后，刮入生理鹽水或pH7.3±0.1緩沖生理鹽水，用滅菌脫脂棉過濾，測定濃度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬，作為試驗組的攻擊菌液，然后再連續(xù)稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個菌，以上5個不同稀釋度的菌液，作為對照組的攻擊m.gydjdsj.org.cn/zhuyuan/菌液。
2.5 工作起止時間
自攻擊菌液制備（開始刮菌)至注射完最后1只小白鼠不得超過2.5小時。
2.6活菌計數(shù)
在攻擊前后，可將0.03ml含8個菌的攻擊菌液，接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中，每個平皿0.2ml，每次不得少于2個平皿，其菌落形成單位約為濁度測定的1/4。
3 攻擊
動物免疫后14天，每只小白鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml菌液（含8萬個菌)，用0.25ml注射器，4號針頭。在試驗組攻擊后再進(jìn)行對照組毒力測定，對照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。
4 記錄結(jié)果
動物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天，將試驗組動物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動物并記錄死亡數(shù)，最初3天死亡的動物不作統(tǒng)計，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動物按死亡計算。
5 結(jié)果計算
5.1 按Wilson-Worcester氏法計算參考菌苗及待檢菌苗的ED50±SD%，每個ED50標(biāo)準(zhǔn)差的范圍一般應(yīng)為64%～156%。
5.2 按Reed-Muench氏法計算對照組LD50，1個LD50的菌數(shù)應(yīng)不高于800個菌。
5.3 計算均質(zhì)性因子“α”。
5.4IU計算
待檢原液每ml應(yīng)含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50×參考菌苗每ml的IU數(shù)
6 效力評價
百日咳原液按成品菌苗嘗試稀釋后，每個接種劑量的免疫效價應(yīng)不少于4.0IU。
