凝集素的特性及標(biāo)記原理詳見第五章 ，近年來，凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用日益廣泛，且獲得較為滿意的效果。凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)方法較多，常用的有凝集素—酶（常用為HRP)、凝集素—生物素—酶電鏡標(biāo)記技術(shù)�，F(xiàn)將凝集素—酶電鏡標(biāo)記技術(shù)（包埋前染色)簡介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987)。
（1)固定：常用為PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如為取腦組織，可將已藻注動物在4℃過夜，次日取腦組織置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸鈉緩沖液（含7.5%蔗糖)中漂洗。
（2)振動切片機(jī)（Vibratome)切60μm的厚片。
（3)切片孵育在PBS（內(nèi)含0.1mol/l CaCl2、Mgcl2和MnCl2)10min（有作者主張此步可省略)。
（4)為增強(qiáng)細(xì)胞通透性，切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl2水溶液中，pH7.8,37℃孵育30min。
（5)PBS洗3次，每次2min。
（6)凝集素—HRp 1：10 在PBS中（含0.1%Triton X--100)4℃過夜，最好不斷輕輕振蕩。
（7)PBS洗3次，每次2min。
（8)DAB-H2O2顯色。
（9)1%OSO4水溶液固定。
（10)系列酒精脫水，EPON包埋，切片。
（11)電鏡沿—鈾雙染觀察。
凝集素呈高電子密度常沉積在細(xì)胞膜上，易與電子染色相區(qū)別。
掃描免疫電鏡技術(shù)可為研究細(xì)胞或組織表面的三維結(jié)構(gòu)與抗原組成的關(guān)系提供可能性。
應(yīng)用于掃描電鏡的標(biāo)記物應(yīng)能在掃描電鏡可分辨的范圍內(nèi)，并能對細(xì)胞或組織抗原有較好的定位能力。在選擇標(biāo)記物時應(yīng)根據(jù)研究目的而定，如標(biāo)記細(xì)胞等由于體積較大，可用體積大的標(biāo)記物；如鑒別陽性（標(biāo)記細(xì)胞)與陰性（未標(biāo)記細(xì)胞)，而要定位受體等則需選用較小的，易于辨認(rèn)的標(biāo)記物。
常用的標(biāo)記物為顆粒性標(biāo)記物。依其特性可分為：
1．蛋白類 如血藍(lán)蛋白、鐵蛋白等。
2．病原體類 如煙草花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、噬菌體T4、大腸桿菌f2、噬菌體等。
3．金屬顆粒膠體金、免疫金銀標(biāo)記技術(shù)和同位素放射性自顯影的銀顆粒等。其中以金屬類顆粒標(biāo)記物應(yīng)用最為廣泛。最常用的是膠體金，膠體金商品提供的直徑從3～150nm不等，掃描免疫電鏡常用的金顆粒直徑在30～60nm左右為宜。由于金本身系重金屬，有較強(qiáng)的發(fā)射2次電子的作用，故不需噴鍍金屬膜，這是膠體金應(yīng)用于免疫掃描電鏡的標(biāo)記優(yōu)于其它標(biāo)記物之處。免疫金銀染色能加強(qiáng)細(xì)胞或組織表面金屬顆粒聚集的密度。金、銀粒在電鏡顯示為電子密度高，外形清晰的顆粒易于識別和定位。病原體標(biāo)記物主要利用其特異殊的外形和結(jié)構(gòu)以達(dá)到標(biāo)記定位的目的，如噬菌體T4形似星形的球拍，頭部大約100nm直徑，呈六角形星狀，尾長約100nm，由頸部與頭部相接；煙草花葉病毒為15×30nm的桿狀病毒，而南方菜豆花葉病毒是直徑25nm的園形顆粒，這些病原體的典型外形很易于辨認(rèn)。鐵蛋白由于含有致密的鐵離子核心具有較高的電子密度，從而達(dá)到標(biāo)記定位的目的。血蛋白是由海螺類軟體動物中提取的多分子聚合物，其外形為35×50nm的柱狀體，多應(yīng)用于病毒研究，但也有利用血藍(lán)蛋白與過氧化物等的糖蛋白部份可與凝集素相結(jié)合的特性，進(jìn)行細(xì)胞膜受體的定位。
金屬類標(biāo)記物的免疫標(biāo)記法同切片免疫染色，即將標(biāo)記物與抗體相結(jié)合，通過直接或間接法顯示抗原部位。膠體金可與蛋白A相結(jié)合后與IgG分子中的Fc 段相結(jié)合。哪與卵白素（a－vidin)相結(jié)合可與結(jié)合抗體的生物素（biotin)反應(yīng)。免疫金銀染色法在膠體金標(biāo)記后www.med126.com，再進(jìn)行銀液顯影。病毒（包括噬菌體)標(biāo)記物多采用不標(biāo)記抗體法，即搭橋法。此法的原理是采用同種動物制備抗原的特異性抗體與標(biāo)記物抗體（例如兔抗A抗原與兔抗HRP)。再用另一種動物制備第一種動物血清抗體的抗體（例如羊抗兔IgG抗體)。利用后者為橋，把抗原的特異性抗體與抗標(biāo)記物抗體結(jié)合起來，后者再與標(biāo)記物結(jié)合，以達(dá)到定位抗原的目的，其基本原理與PAP法類同。病原體免疫標(biāo)記可不用標(biāo)記物顯示，而利用其形態(tài)學(xué)特征定位或采用抗原抗體凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特異性抗體在與相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，使后者之間發(fā)生交聯(lián)而凝集，經(jīng)濃縮后用陰性染色法（負(fù)染)便可在電鏡下顯示定位部位。
1．標(biāo)本處理
（1)細(xì)胞懸液：用10ml PBS 內(nèi)含1mg/ml牛血清白蛋白（PBS—BSa )懸浮細(xì)胞，離心250g,5min×2。加入PBS—BSA 至105～106細(xì)胞/ml，振搖成單細(xì)胞懸液。BSA能減低生物標(biāo)本的非特異性吸附，但注意濃度應(yīng)適宜，過高會減弱特異性反應(yīng)。
（2)細(xì)胞附著于固體支持物：由于固定與免疫標(biāo)記的孵育過程會引起細(xì)胞凝集，妨礙細(xì)胞表面的暴露，而且反復(fù)的離心與懸浮會導(dǎo)致細(xì)胞表面形態(tài)的改變。因此，通常將懸液中的細(xì)胞粘附于過濾膜或涂有帶正電荷聚合物的蓋玻片上，在粘附之前可依（1)法清洗標(biāo)本，以除去細(xì)胞表面的附著物。固體支持物可用涂有多聚—L—賴氨酸薄膜的載片或直徑13nm、孔徑0.22或0.45μm的過濾膜，載片制備方法：多聚—L—賴氨酸（Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于載片上，4℃30min后傾倒掉表面液體，令其自然干燥。注意載玻片事先需要清潔液浸泡，水漂洗過夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用綢巾拭干。將細(xì)胞懸液（如細(xì)胞數(shù)少可事先離心，取沉淀細(xì)胞)，滴于濾膜或載片上，由于多聚賴氨酸的粘附性，在固定及免疫標(biāo)記過程中細(xì)胞不至于脫落。但注意勿使細(xì)胞干燥。
（3)組織切片與固體組織：組織切片如為石蠟包埋應(yīng)預(yù)先脫蠟，由二甲苯經(jīng)梯度酒精至水。組織切片與固體組織（勿過大)均應(yīng)以PBS—BSA沖洗，并保持濕潤避免干燥。
2．固定
（1)固定前用PBS—BSA沖洗5min×3。
（2)選擇加入適合的固定劑；可為4%多聚甲醛+0.1%～0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸緩沖液中。室溫固定10～60min，或4℃30～120min。
（3)PBS—BSA沖洗5min×3。
（4)除去殘留的自由醛基，選以下任一方法：
①0.5mg硼氫化鈉/1ml PBS 10min（新鮮配制)
②0.05～0.2mol/l 甘氨醊或賴氨酸—HCl/PBs 30～60min。
③0.1～0.5mol/L氯化鈉/PBs 30～60min。
④PBS—BSA沖洗5min×3。
3．免疫標(biāo)記與透射免疫電鏡的原則及步驟基本相同。
免疫金銀染色法舉例（張留保等，1997)
（1)血細(xì)胞以PBS—BSA沖洗5min×3。
（2)2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h
（3)PBS或TBS反復(fù)沖洗5min×3。
（4)膠體金免疫標(biāo)記程序（略)
（5)暗室顯影液顯影
（6)掃描電鏡樣品制樣
（7)觀察
m.gydjdsj.org.cn/sanji/作者在血細(xì)胞膜外顯示了密集的金銀粒標(biāo)記（特異性標(biāo)記膜的谷胱甘肽過氧化物酶及激素肽)。
4．常規(guī)掃描電鏡標(biāo)本處理
（1)PBS—BSA沖洗5min×3。
（2)后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液，時間視樣本大小而定，一般室溫30min左右。
（3)PBS—BSA洗5min×3。
（4)1%四氧化鋨后固定1～2h
（5)系列梯度乙醇或丙酮脫水
（6)臨界點(diǎn)干燥或冰凍干燥
（7)噴鍍碳與金
（8)掃描電鏡觀察
冷凍蝕刻法（Freeze Ftching)，也稱冷凍復(fù)型法（Freeze Replica)或冷凍切斷（Freeze Fracture)，是研究生物膜結(jié)構(gòu)的重要方法之一。其主要步驟首先是將樣品在液氮中冷凍，然后放到真空噴鍍儀中切斷，切斷后的切面上有細(xì)胞器，其間還有凍成洋的水分。再加熱使冰升華，將水份蒸發(fā)，把細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)暴露出來，這一步驟就稱為冷凍蝕刻。如不進(jìn)行蝕刻就稱為冷凍切斷。向暴露的膜結(jié)構(gòu)上噴鍍鉑—碳投影，再噴碳來加固。這樣就在切斷的樣品表面形成一層復(fù)型膜。在此復(fù)型膜上印下了細(xì)胞切面的立體結(jié)構(gòu)。從真空中取出樣品，把復(fù)型膜下面的組織腐蝕掉，再把復(fù)型膜撈在銅網(wǎng)上，在透射電鏡下觀察復(fù)型膜。
關(guān)于生物膜的分子結(jié)構(gòu)，目前被大家公認(rèn)的并為冷凍復(fù)型電鏡觀察所證實(shí)的是流動鑲嵌型（圖7-1)，即脂質(zhì)—球狀蛋白質(zhì)鑲嵌模型。依照這上模型學(xué)說表明，生物膜是一種流動
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圖7-1 生物膜分子的流動鑲嵌模型及冷凍斷裂面圖解
的、可塑的、鑲嵌蛋白質(zhì)分子的脂質(zhì)雙分子層的膜；脂質(zhì)雙分子層中每一分子分別具有兩極，一端為親水極，朝向膜的內(nèi)、外表面，而另一端的疏水極朝向膜的中線部位，兩排分子彼此相對，構(gòu)成生物膜膜性結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)分子彼此相對有嵌入性和表在性兩種，前者大約占蛋白質(zhì)總量的3/4左右，外形近似球狀，鑲嵌在脂質(zhì)分子層的不同深度內(nèi)，而后者則大多附著于細(xì)胞膜的胞質(zhì)面。在冷凍劈裂后，生物膜的水平斷面大多發(fā)生在單位膜的疏水極。因此，膜的親水部，分別命名為PS（與細(xì)胞質(zhì)，核質(zhì)或線粒體內(nèi)基質(zhì)相鄰的面)和ES（與細(xì)胞外間隙或細(xì)胞內(nèi)間隙或細(xì)胞內(nèi)間隙相鄰的面，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、核質(zhì)間隙、線粒體內(nèi)、外膜之間的腔和其它各種泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分別叫做EF（面向細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、或線粒體基質(zhì)的面)和PF（向細(xì)胞外間隙或內(nèi)間隙的面)。從70年代初期開始，冷凍蝕刻免疫電鏡技術(shù)已開始在應(yīng)用，但由于免疫標(biāo)記必須在冷凍蝕刻步驟以前進(jìn)行，所以僅能標(biāo)記細(xì)胞外表面（ES)。80年代開始建立了斷裂—標(biāo)記細(xì)胞化學(xué)方法，將細(xì)胞膜劈開后，中央的兩側(cè)斷面（EF與PF)以及各種細(xì)胞器的膜的各個表面及細(xì)胞質(zhì)與核質(zhì)都能被標(biāo)記，為此技術(shù)的廣泛應(yīng)用創(chuàng)造了條件。應(yīng)用此法還可對抗原與受體分子進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)。
（1)新鮮或固定的細(xì)胞進(jìn)行直接法或間接法免疫標(biāo)記。
（2)PBS（pH7.5)沖洗3min×2，加入1mmol/l MgCl2蒸餾水洗洗3min×3，離心沉集細(xì)胞。
（3)將細(xì)胞團(tuán)置于小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進(jìn)行斷裂操作，再于-100℃蝕刻1min 。
（4)制做斷裂面復(fù)型。
（5)再次氯酸鈉清洗復(fù)型，蒸餾水洗后進(jìn)行觀察。
本法可顯示斷裂暴露的PF位于中央，周圍則是蝕刻后露出來的ES，標(biāo)記物只出現(xiàn)在ES上。
此法是先進(jìn)行冷凍斷裂，再做免疫標(biāo)記，從而可以對斷裂開的各種膜結(jié)構(gòu)及胞漿斷面進(jìn)行標(biāo)記。
（1)臨界點(diǎn)干燥法
①固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS沖洗3min×3。
如為細(xì)胞懸液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。
②冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用預(yù)冷的解剖刀切割凝膠小塊進(jìn)行冷凍斷裂。
③解凍，置碎塊于30%甘油—1%戊二醛磷酸緩沖液中解凍。
④置換甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。
⑤免疫標(biāo)記。
⑥1%鋨酸，室溫固定30min。
⑦系列梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴鍍鉑—碳膜，次氯酸鈉清洗復(fù)型，蒸餾水洗，撈于有Formvar 膜銅網(wǎng)上透射電鏡觀察。
（2)超薄切片法
步驟：①至⑤同臨界點(diǎn)干燥法。
⑥1%鋨酸，室溫固定2h，系列酒精或丙酮脫水，常規(guī)電鏡包埋。
⑦切半薄片，光鏡定位合適的斷裂部位，再切超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。
斷裂標(biāo)記法目前文獻(xiàn)報(bào)告應(yīng)用較多的是植物凝集素—膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)，常用的如刀豆球蛋白（Con A)-- 膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)，如第六章 所述，Con A 能與細(xì)胞膜中的甘露糖結(jié)合，能標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核被膜以及細(xì)胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微結(jié)構(gòu)水平的定位。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組實(shí)驗(yàn)在免疫標(biāo)記階段應(yīng)設(shè)立對照組。對照組的設(shè)計(jì)同第一章 總論中的免疫對照染色。
