免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第四節(jié)　ELISA的技術(shù)要點(diǎn)

ELISA的技術(shù)要點(diǎn)包括三個(gè)方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。

一、試劑的制備

ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。

（一)固相載體

可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測(cè)定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。

ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，最后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測(cè)定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，國際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果�，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISwww.med126.comA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。

良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度�？刂品磻�(yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。

與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。

為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較測(cè)定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別最大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定的最合適的固相載體。

除塑料制品外，固相酶免疫測(cè)定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測(cè)定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測(cè)定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。

（二)抗原和抗體

在ELISA實(shí)施過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)。

ELISA所用抗原有三個(gè)來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen)。重組抗原（recombinantantigen)和多肽抗原（peptideantigen)均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對(duì)那些天然抗原不易得到的試驗(yàn)，更顯出其獨(dú)到之處。

用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的�？寡�清成分復(fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，則效果更好。

（三)免疫吸附劑

固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating)。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（最常用的為pH9.6的碳酸緩沖液)中，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking)。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。

（四)酶和底物

ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。ELISA中最常用的酶為辣根過氧化酶（HRP)和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP)。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18％；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白)和輔基（亞鐵血紅素)結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有最高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP催化下列反應(yīng)：

上式中DH₂為供氫體，H₂O₂O為受氫體。HRP對(duì)受氫體的專一性很高，除H₂O₂外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H₂O₂方便。許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（orthopenylenediamine，OPD)、四甲基聯(lián)苯胺（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB)和ABTS[2，2＇-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。

OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反應(yīng)如下：

HRP的純度用RZ（ReinheitZahl，意為純度數(shù))表示，是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥3.0。應(yīng)注意的是酶變性后，RZ可不變而活力降低，故重用酶制劑時(shí)更重要的指標(biāo)為活力。酶活力以單位表示：1min將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個(gè)單位。

在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD，最適pH為9.6。一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP)作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。反應(yīng)式如下：

在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等原因，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。

除HRP和AP以外，在商品ELISA試劑中應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside)，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone)，可用熒光計(jì)檢測(cè)。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計(jì)測(cè)定，而且如用固相載體直接作為測(cè)定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點(diǎn)是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶（酶的化學(xué)發(fā)光底物見第十八章)。

（五)結(jié)合物

酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate)�？乖�由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。

1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP)，也可用二步法（如連接HRP)。舉例如下：

2～5mg純抗體與5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1ml中，4℃下對(duì)同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入1％戊二醛0.05ml，在室溫下放置2小時(shí)。在4℃下對(duì)0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡，即得酶標(biāo)抗體。

辣根過氧化物酶可溶解于50％飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用50％飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體，棄去上清中游離酶。

戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。

制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。

2．過碘酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18％碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH₄)中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)最有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。

按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用SephadexG-200凝膠過濾的好。

二、最適工作濃度的選擇

在建立某一ELISA測(cè)定中，應(yīng)對(duì)包被抗原或抗體的濃度和酶標(biāo)抗原或抗體的濃度予以選擇，以達(dá)到最合適的測(cè)定條件和節(jié)省測(cè)定費(fèi)用。下面以間接法測(cè)抗體和夾心法測(cè)抗原為例，介紹最適工作濃度的選擇方法。

（一)間接法測(cè)抗體

1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇

（1)用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。

（2)將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。

（3)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸亮度（A)，繪制曲線如圖15-10。讀取A值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)抗人IgG的工作濃度應(yīng)為1/1600。

2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度

（1)用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。

（2)將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，保溫，洗滌。

（3)加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫，洗滌。

（4)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。

（5)選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表15-1為本例的測(cè)定結(jié)果，表中數(shù)字為A值。從表中可見1:200為最舒適的工作濃度。

表15-1 間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

（二)夾心法測(cè)抗原

在夾心法ELISA法中可用棋盤滴定法同時(shí)選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度，舉例如下（表15-2)：

表15-2 夾心ELISA包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇

（1)抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為10、1和0.1μg/ml，分別在ELISA板上進(jìn)行包被，每一濃度包括三個(gè)縱行，洗滌。

（2)在一個(gè)橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對(duì)照液，保溫，洗滌。

（3)將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分別加入每一包被濃度的一個(gè)縱行中，保溫，洗滌。

（4)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。

（5)以強(qiáng)陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小于0.1的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。從表15-2可看出包被抗體濃度可選用1μg/ml，酶標(biāo)抗體的稀釋度可選為1:5000。為了進(jìn)一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點(diǎn)，縮小間距再做進(jìn)一步的棋盤滴定。

三、測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)化

要使ELISA測(cè)定得到準(zhǔn)確的結(jié)果，不論是定性的還是定量的，必須嚴(yán)格按照規(guī)定的方法制備試劑和實(shí)施測(cè)定。主要試劑的制備要點(diǎn)已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗滌液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應(yīng)終止液等，配制時(shí)不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應(yīng)觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。

測(cè)定的實(shí)施中，應(yīng)力求各個(gè)步驟操作的標(biāo)準(zhǔn)化，下面以板式ELISA為例，介紹有關(guān)注意事項(xiàng)。

（一)加樣

在ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。在定性測(cè)定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢(shì)，使每滴液體的體積基本相同。在定量測(cè)定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。

（二)保溫

在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)�板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。加入底物后，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便不時(shí)觀察，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)。

（三)洗滌

洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)聚，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA測(cè)定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween)一類物質(zhì)即右達(dá)到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對(duì)聚山梨酯編號(hào)，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。

洗滌如不徹底，特別在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾。

ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；②將洗滌液注滿板孔；③放置2min，略作搖動(dòng)；④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3～4次，有時(shí)甚至需洗5～6次。

（四)比色

如陰性對(duì)照顏色極淺，在定性測(cè)定中一般可采用目視比色。如用比色計(jì)測(cè)定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量。