外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.07m.gydjdsj.org.cn/zhuyuan/5～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液)做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。
（一)Ficoll分層液法
主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll)，分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin)以增加密度。國外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。分離人外周淋巴細胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因為人的紅細胞密度為1m.gydjdsj.org.cn/jianyan/.093，粒細胞密度為1.092，單個核細胞在1.076～1.090之間。而不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088，馬為1.090。分離時先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面。水平式離心后，離心管中會出現(xiàn)幾個不同層次的液體和細胞帶（圖20-1)。紅細胞和粒細胞密度大于分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹�核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95％，淋巴細胞約占90％～95％，細胞獲得率可達80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過25℃時會影響細胞獲得率。
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圖20-1 Ficoll分層液離心后外周血細胞示意圖
（二)Percoll分層液法
這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個連續(xù)密度梯度的原理，將密度不等的細胞分離純化。用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強度的磷酸緩沖液均勻混合，高速離心后，使分層液形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度，再將已制備的單個核細胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個細胞層。表層為死細胞殘片和血小板，底層為粒細胞和紅細胞，中間有兩層，上層富含單個核細胞(75％)，下層富含淋巴細胞(98％)(圖20-2)。該法是純化單核細胞和淋巴細胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續(xù)較多。
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圖20-2 連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖
