免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗:第三節(jié)　單克隆丙種球蛋白病的檢測方法

單克隆丙種球蛋白病的實驗室診斷主要依靠血液學(xué)和免疫學(xué)手段。其中免疫學(xué)檢測尤為重要。一般，免疫球蛋白的多數(shù)分析測定技術(shù)都可用于丙種球蛋白病的檢測。當(dāng)臨床上考慮為多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥或其它漿細(xì)胞惡變疾病時，首先應(yīng)該做血清蛋白區(qū)帶電泳，如果發(fā)現(xiàn)有異常球蛋白區(qū)帶，繼而進(jìn)行免疫球蛋白測定與免疫電泳，作進(jìn)一步定量分析和免疫球蛋白分類鑒定。注意作追蹤觀察，以助病情、療效的了解和預(yù)后的推斷。良性或繼發(fā)患者往往是在體檢或其他檢查中，進(jìn)行血清蛋白區(qū)帶電泳而發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)疑為冷球蛋白血癥或輕鏈病時，均應(yīng)進(jìn)行冷球蛋白測定或本周蛋白測定加以證實。

一、血清蛋白區(qū)帶電泳

蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳是血清蛋白的經(jīng)典分析方法，血清（或尿液)標(biāo)本中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)可明顯分開形成不同的區(qū)帶，通過正常m.gydjdsj.org.cn/zhuyuan/的電流圖譜進(jìn)行比較分析，很容易發(fā)現(xiàn)患者電泳圖譜不一狹窄而濃縮的集中帶，即M區(qū)帶（圖26-1)，這是由于M蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度均一，因而其電泳遷移率十分一致。如果將這些區(qū)帶電泳圖譜掃描，還可計算出異常蛋白的含量和百分比。這種M區(qū)帶較多見于γ或β區(qū)，偶亦可見于α區(qū)。M區(qū)帶的電泳位置可大致反應(yīng)出免疫球蛋白的類型，IgG型多位于α區(qū)至γ慢區(qū)，IgA型多位于γ1與β區(qū)，IgM型多位于β2或γ區(qū)，IgD型多位于β或γ區(qū)。但是區(qū)帶電泳不能完全確定免疫球蛋白的類型，最終確定還需用特異性抗體進(jìn)行鑒定。

在某些情況下還可以出現(xiàn)假的狹區(qū)帶，易與M蛋白混淆，應(yīng)注意區(qū)別。例如溶血標(biāo)本中血紅蛋白形成的β位區(qū)帶，陳舊血清中聚合IgG形成的近原位窄區(qū)帶，以及由類風(fēng)濕因子形成的位于γ區(qū)中間的細(xì)區(qū)帶都易于M區(qū)帶相混淆，遇到這些可疑情況時，應(yīng)進(jìn)一步做免疫電泳等分析加以區(qū)別。

非分泌型骨髓瘤患者血清蛋白區(qū)帶電泳中不能檢出單克隆丙種球蛋白的M區(qū)帶，往往呈現(xiàn)低丙種球蛋白血癥的特征，臨床上卻存在漿細(xì)胞骨髓瘤的表現(xiàn)。為明確診斷需對患者骨髓中惡性漿細(xì)胞進(jìn)行表面免疫熒光染色分析，或提取其惡性漿細(xì)胞，經(jīng)溶解后再行免疫球蛋白分析。輕鏈病有時血清中也檢測不出M蛋白，這就需要進(jìn)行尿中本周蛋白的檢測。多克隆丙種球蛋白病是臨床上更為常見的一類疾病，其病因與單克隆丙種球蛋白病明顯不同，是受一些抗原刺激引起多株細(xì)胞過度免疫應(yīng)答的結(jié)果。因此，血清蛋白電泳圖譜是在γ區(qū)域呈現(xiàn)著色深濃、寬闊而不勻的區(qū)帶，易與M蛋白相區(qū)別。多克隆丙種球蛋白病中免疫球蛋白的升高譜型大多無特異性，一般以IgG升高為多，可伴IgA或IgM升高，也可IgA或IgM單獨(dú)升高。低丙種球蛋白血癥則表現(xiàn)為γ區(qū)的缺失。結(jié)締組織中多克隆丙種球蛋白增高有隨疾病嚴(yán)重程度而升高的趨勢，而肝病中的增高程度也可用來估計肝損傷的程度。

二、免疫球蛋白定量測定

免疫球蛋白定量測定較常用的方法有單向擴(kuò)散法與免疫濁度法，前者較為簡便，后者更為準(zhǔn)確迅速。惡性單克隆丙種球蛋白病常呈現(xiàn)某一類丙種球蛋白的顯著增高，大多在30mg/ml以上；而正常的免疫球蛋白，包括與M蛋白同類的丙種球蛋白的含量則顯著降低。在良性丙種球蛋白病的血清標(biāo)本中，M蛋白的升高幅度一般不象惡性丙種球蛋白病那么高，多在20mg/ml以下；M蛋白以外的免疫球蛋白含量一般仍在正常范圍之內(nèi)。如在單向擴(kuò)散試驗中出現(xiàn)雙圈狀沉淀環(huán)，則標(biāo)本中可能存在某種免疫球蛋白片段的M蛋白。多克隆丙種球蛋白病患者的血清中常有多種類型的免疫球蛋白水平同時升高，每類上升的幅度不太大，但總的丙種球蛋白水平增主比較明顯。

免疫球蛋白的定量檢測，有時會由于不同實驗室所用抗血清特異性的差異，而造成M蛋白定量結(jié)果的不同，特別在使用某一株M蛋白制備的抗血清檢測其他患者的M蛋白時。如能配合作用區(qū)帶電泳光密度掃描，�？杉m正這種誤差。

進(jìn)行免疫球蛋白的定量檢測，不僅有助于丙種球蛋白病的診斷，并對丙種球蛋白病的良、惡性鑒別具有一定的幫助。如做動態(tài)觀察，對丙種球蛋白病的病情和療效的判斷有一定的價值。M蛋白含量的多少�？煞从巢∏榈妮p重，尤其對同一患者，M蛋白含量明顯增高常提示病情惡化；經(jīng)有效治療后，M蛋白含量逐漸下降，而正常免疫球蛋白的含量則由降低趨向正常。

三、免疫球蛋白的分類鑒定

疑為丙種球蛋白病的患者，經(jīng)血清蛋白區(qū)帶電泳和免疫球蛋白測定，已基本證實是否有免疫球蛋白的異常增高和其含量的多少，但是增高的M蛋白究竟是哪一類免疫球蛋白，仍需進(jìn)一步分類鑒定，常應(yīng)用各種類型的特異性抗血清，做不同形式的電泳或免疫擴(kuò)散。

（一)免疫電泳

免疫電泳是將區(qū)帶電泳和免疫擴(kuò)散結(jié)合起來的一種免疫學(xué)分析法。血清標(biāo)本先經(jīng)區(qū)帶電泳將各種蛋白成分分離開，繼而用各種特異性抗血清進(jìn)行免疫擴(kuò)散，根據(jù)M蛋白在免疫電泳中所形成的特殊沉淀弧，觀察其電泳遷移位置與抗原特異性，可將M蛋白的免疫球蛋白類型和其輕鏈型加以鑒定。一般多用抗IgG、IgM、IgA、κ和λ輕鏈等5種抗血清進(jìn)行實驗，用抗正常人血清作為對照。M蛋白與相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)所出現(xiàn)的沉淀弧較為特殊，較普通沉淀弧寬，凸出呈弓形，不難辨認(rèn)。如有下列情況，可作出判斷或提示。

1．如果待測血清標(biāo)本與某型免疫球蛋白重鏈及輕鏈抗血清產(chǎn)生相同遷移度的特殊沉淀弧，提示存在單克隆丙種球蛋白（M蛋白)，此現(xiàn)象多見于IgG、IgA或IgM型多發(fā)性骨髓瘤或原發(fā)性巨蛋白血癥等（圖26-2)。

圖26-2 IgAλ型骨髓瘤的免疫電泳圖譜

孔中為血清標(biāo)本，槽中為抗血清，箭頭所指為骨髓瘤蛋白

a：抗正常人血清；b：抗IgG血清；c：抗IgA血清；

d：抗IgM血清；e：抗κ血清；f：抗λ血清

2．在同一抗輕鏈血清的反應(yīng)中，同時出現(xiàn)二條毗鄰的特殊沉淀�。▓D26-3)，則可能是除M蛋白以外還存在游離輕鏈，偶爾也可見兩種M蛋白，此時應(yīng)進(jìn)一步測定尿中的本周蛋白。

3．患者血清中僅與其中一種抗輕鏈抗血清產(chǎn)生一種特殊的沉淀弧，而其他5種抗重鏈抗血清均不產(chǎn)生此種特殊的沉淀弧，這種情況可能是①伴有腎功能不全的輕鏈病，游離輕鏈較少從尿中排出而滯留于血液中；②存在輕鏈的四分子多聚體，分子量大（90kD)，不易從尿中排出，而留存于血液中；③尚未發(fā)現(xiàn)的新重鏈的免疫球蛋白。

圖26-3I gGκ型骨髓瘤伴κ型本周蛋白尿的免疫電泳圖譜

上孔為尿液，下孔中為血清標(biāo)本，槽中為抗血清，箭頭所指為骨髓瘤蛋白b：

抗IgG血清；c：抗IgA血清；d：抗IgM血清；e：抗κ血清；f：抗λ血清

圖26-4 IgG重鏈病的免疫電泳圖譜

上孔中為尿液，下孔中為血清，槽中為抗血清，

箭頭所指為骨髓瘤蛋白a：抗正常人血清；b：抗IgG血清；c：抗

IgA血清；d：抗IgM血清；e：抗κ血清；f：抗λ血清

4．若患者血清只與IgG、IgA或IgM中的一種抗重鏈血清產(chǎn)生一特殊沉淀弧，但在兩型抗輕鏈血清中無相應(yīng)位置的沉淀弧出現(xiàn)，血清標(biāo)本經(jīng)2-巰基乙醇還原處理后，仍無改變，提示可能是重鏈�。▓D26-4)，需進(jìn)一步測定其分子量。

5．非分泌型丙種球蛋白病血清中某一類型的免疫球蛋白含量一般不會太高，沉淀弧帶偏近抗體槽，以致影響分析。必要時需對血清標(biāo)本進(jìn)行不同稀釋后再作試驗，以資比較。有時某些M蛋白（如IgA或IgM)的四級結(jié)構(gòu)會阻礙輕鏈抗原決定簇與其相應(yīng)抗血清結(jié)合，因而誤診為重鏈病。這時需在血清標(biāo)本中加入2-巰基乙醇（10μl/ml血清)作還原處理后再作試驗，才能獲得正確結(jié)果。作游離輕鏈分析時，由于輕鏈分子量小，擴(kuò)散很快，要每隔10min觀察一次結(jié)果，并注意標(biāo)本濃度不宜過高，否則難以獲得滿意結(jié)果。

如果免疫電泳仍不能完全進(jìn)行M蛋白的分類鑒定，可應(yīng)用免疫選擇電泳與免疫固定電泳作為補(bǔ)充，以便進(jìn)一步鑒定。

（二)免疫選擇電泳

將含抗κ或λ血清的瓊脂制成薄層瓊脂板，打孔后加入待測血清或其他標(biāo)本進(jìn)行火箭電泳，與標(biāo)本相應(yīng)的免疫球蛋白形成火箭樣沉淀峰。然后于孔的兩側(cè)各挖一槽，加入某型免疫球蛋白的抗血清或另一型輕鏈抗血清，溫育擴(kuò)散后，按沉淀弧形成的情況，進(jìn)行分析鑒定。圖26-5為α重鏈病和IgA骨髓瘤的結(jié)果。

圖26-5 免疫選擇電泳圖譜示例孔中為血清標(biāo)本，槽中為抗IgA重鏈抗血清KL表示瓊脂中含抗κ及抗λ抗血清

A：正常人；B：α重鏈��；C：IgA骨髓瘤

圖26-6 免疫固定電泳圖譜示例（IgA-λ型M蛋白)

κ、λ、G、A、M分別代表覆蓋含抗κ，抗λ，抗IgG，

抗IgA和抗IgM的抗血清；箭頭所指為加樣處

（三)免疫固定電泳

該方法類似免疫電泳，將待測血清或其他標(biāo)本在瓊脂平板上作區(qū)帶電泳，分離后于其上覆蓋含抗κ或λ輕鏈或各類重鏈的抗血清濾紙，當(dāng)抗體與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結(jié)合后，便形成復(fù)合物而沉淀下來，再通過漂洗與染色，呈現(xiàn)濃而狹窄的著色區(qū)帶，即可判斷單克隆丙種球蛋白的輕鏈和重鏈型別（圖26-6)。

四、其他檢測方法

（一)本周蛋白的檢測

本周蛋白即尿中游離的免疫球蛋白輕鏈，其檢測對輕鏈病的診斷是必不可少的項目，并對多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白病、重鏈病等疾病的診斷、鑒別和預(yù)后判斷均有一定幫助。

本周蛋白在pH5.0的條件下，加熱至50℃～60℃時出現(xiàn)沉淀，繼續(xù)加熱至90℃后又重新溶解。根據(jù)這種理化性質(zhì)，又將其稱為凝溶蛋白，故可根據(jù)這一特點(diǎn)，用化學(xué)方法進(jìn)行檢測。這種加熱沉淀法簡便易行，但敏感度較低，也不能確定輕鏈的型別。

也可用抗κ和λ型輕鏈抗血清進(jìn)行免疫電泳分析。為提高檢出率，尿標(biāo)本宜先用聚乙二醇通過透膜濃縮。游離輕鏈往往與其中一型的抗血清起反應(yīng)，在β-γ區(qū)附近形成一條致密的弓形沉淀弧。有時輕鏈還含有其他蛋白，要注意識別。如多克隆免疫球蛋白常同時與κ和λ兩型抗輕鏈血清形成沉淀弧，而單克隆免疫球蛋白（M蛋白)雖只與其中一型抗輕鏈血清反應(yīng)，但也與某一型重鏈抗血清產(chǎn)生一位置相同的沉淀弧，通過觀察分析可作出正確判斷。

輕鏈病患者尿中可測得本周蛋白，但由于其分子量較小，易迅速自腎排出，故血中反而呈陰性，檢測時應(yīng)該注意。

（二)冷球蛋白的檢測

冷球蛋白是血清中的一種特殊蛋白質(zhì)，在4℃時自發(fā)沉淀，加溫至37℃時又可溶解，故常利用這種可逆性冷沉淀的特性對其進(jìn)行測定。取患者外周血，分離出血清置4℃冰箱中，一般在24～72h出現(xiàn)沉淀，若1周仍不出現(xiàn)沉淀者方可判斷為陰性。如形成沉淀，再置37℃溫育使其復(fù)溶，也可將冷沉淀物離心洗滌后做定性與定量分析。

進(jìn)行冷球蛋白研究和檢測時，必須注意以下事項：①部分單克隆冷球蛋白可在低于10℃時發(fā)生沉淀，故標(biāo)本采集時必須將注射器和容器預(yù)溫，離心及整個操作過程中也都要注意保溫；②部分冷球蛋白在冷的條件下可迅速沉淀，但有一些則需數(shù)天，因此，這些血清需在4℃下放置1周；③大部分正常人血清也含有多克隆冷球蛋白，但通常在是80μg/ml以下；④冷纖維蛋白原、C反應(yīng)蛋白-蛋白復(fù)合物和肝素沉淀蛋白等也具有冷沉淀特性，實驗時應(yīng)加以區(qū)別。