現(xiàn)代分子生物學(xué)無(wú)論是在理論研究還是實(shí)際應(yīng)用上，都已處于生命科學(xué)的最前沿，它的發(fā)展徹底改變了我們對(duì)生物體的認(rèn)識(shí)。這些發(fā)展對(duì)于研究和治療人類(lèi)的疾病，尤其是性病有著重大的意義。分子生物學(xué)使我們重新認(rèn)識(shí)性病的發(fā)生和發(fā)病機(jī)理。在探討性病的診斷和治療以及有關(guān)預(yù)防疫苗的研制等各方面，都采用了分子生物技術(shù)和方法。利用分子生物學(xué)方法對(duì)各種性傳播性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷，是近年來(lái)的主要進(jìn)展之一。它的優(yōu)點(diǎn)是高度的特異性和極大的提高了檢測(cè)的敏感性�？梢詸z測(cè)到標(biāo)本中只有一個(gè)基因拷貝的病原微生物。用分子生物學(xué)方法診斷那些培養(yǎng)困難的病原微生物顯得更為優(yōu)越。此外，還可以用來(lái)進(jìn)行流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)理及藥物治療監(jiān)測(cè)的研究�，F(xiàn)將基因診斷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及在性病領(lǐng)域常用的有關(guān)分子生物學(xué)的基本方法和原理進(jìn)行概述。
基因診斷操作的對(duì)象為基因或其片段。基因是遺傳學(xué)上的一個(gè)概念，是在染色體上占有一定的位置，表現(xiàn)一定功能的基本單位。基因的物質(zhì)基礎(chǔ)是脫氧核糖核酸（DNA)（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA)。原核細(xì)胞（如細(xì)菌和病毒)的基因單位較小，其排布一般是連續(xù)的。真核細(xì)胞的基因一般較大，其排布是不連續(xù)的，它被稱(chēng)為插入序列的部分所分隔。
DNA和RNA統(tǒng)稱(chēng)為核酸，早在1868年就被瑞士年輕醫(yī)生米歇爾發(fā)現(xiàn)，在真核細(xì)胞中，98%以上的DNA存在于細(xì)胞核，少量的DNA分布在線(xiàn)粒體中。RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，占其總量的90%左右。細(xì)胞外液則無(wú)核酸存在。對(duì)于非細(xì)胞形態(tài)的病毒來(lái)說(shuō)，或含有DNA，或只含有RNA，因此可按所含核酸類(lèi)型的不同，將病毒分為DNA病毒與RNA病毒。
組成核酸的基本單位是單核苷酸，所以核酸又稱(chēng)為多核苷酸。單核苷酸是由磷酸、戊糖及堿基組成。如果戊糖是脫過(guò)氧的，則形成的單核苷酸為脫氧單核苷酸。單核苷酸相互縮合形成RNA，脫氧單核苷酸相互縮合形成DNA。下表列舉常見(jiàn)的核苷酸及縮寫(xiě)符號(hào)。
表1－1 常見(jiàn)核苷酸及其縮寫(xiě)符號(hào)
| 堿 基 | 核糖核苷酸（縮寫(xiě)) | 脫氧核糖核苷酸（縮寫(xiě)) |
| 腺 嘌 呤 | 腺嘌呤核苷酸（AMP) | 腺嘌呤脫氧核苷酸（dAMP) |
| 鳥(niǎo) 嘌 呤 | 鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（GMP) | 鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸（dGMP) |
| 胞 嘧 啶 | 胞嘧啶核苷酸（CMP) | 胞嘧啶脫氧核苷酸（dCMP) |
| 尿 嘧 啶 | 尿嘧啶核苷酸（UMP) | 胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP) |
由于核酸的合成是一個(gè)耗能的過(guò)程，故參與DNA或RNA合成的脫氧或未脫氧的單核苷酸是三磷酸核苷酸，合成時(shí)磷酸鍵水解釋放出能量，以供核酸的合成。
表1－2 三磷酸核苷酸的種類(lèi)及符號(hào)
| DNA | RNA |
| 腺嘌呤脫氧三磷酸核苷酸（dATP) | 腺嘌呤三磷酸核苷酸（ATP) |
| 鳥(niǎo)嘌呤脫氧三磷酸核苷酸（dGTP) | 鳥(niǎo)嘌呤三磷酸核苷酸（GTP) |
| 胞嘧啶脫氧三磷酸核苷酸（dCTP) | 尿嘧啶三磷酸核苷酸（UTP) |
| 胸腺嘧啶脫氧三磷酸核苷酸（dTTP) | 胞嘧啶三磷酸核苷酸（CTP) |
（一)DNA的堿基組成規(guī)律
組成DNA分子的脫氧核苷酸主要有四種，即dAMP，dGMP、dCMP和dTMP（d代表“脫氧”的意思)，此外還含有少量的稀有堿基（主要是甲基化堿基)。50年代初，E.Chargaff等人對(duì)來(lái)自不同生物的DNA進(jìn)行完全水解，對(duì)堿基進(jìn)行了定量測(cè)定，總結(jié)出如下規(guī)律，一般稱(chēng)它為Chargaff規(guī)則。
1．所有DNA分子中，嘌呤堿總摩爾數(shù)等于嘧啶堿總摩爾數(shù)，即A+G=T+C，并且以摩爾為單位，A=T、G=C。
2．DNA的堿基組成具有種屬的特異性，即不同生物種屬的DNAm.gydjdsj.org.cn/hushi/具有各自獨(dú)特的堿基組成。
3．DNA的堿基組成沒(méi)有組織、器官的特性，即同種生物中不同組織及器官的DNA在堿基組成上是一致的。
4．生物體內(nèi)DNA的堿基組成不受年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境的改變之影響。在所有DNA分子中A=T、G=C這一規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，為DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立提供了重要的依據(jù)。
（二)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)
與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，核酸的結(jié)構(gòu)也可分一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行討論。核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指其多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。核酸的空間結(jié)構(gòu)是指多核苷酸鏈內(nèi)或鏈間通過(guò)氫鍵等折疊卷曲的構(gòu)象。核酸的空間結(jié)構(gòu)又有二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之分。
DNA是由四種脫氧核糖核酸通過(guò)3′.5′——磷酸二酯鍵彼此連接而成的線(xiàn)形或環(huán)狀大分子。DNA分子沒(méi)有側(cè)鏈。其骨架由脫氧核糖和磷酸組成DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)即是DNA多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。
由于生物遺傳信息儲(chǔ)存于DNA的核苷酸序列中，若能搞清各種生物DNA的脫氧核苷酸排列順序，則對(duì)生命活動(dòng)本質(zhì)的認(rèn)識(shí)將有重大意義。
（三)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)
目前公認(rèn)的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種模型的建立，主要有兩個(gè)方面的根據(jù)。一是前面提到的50年代初E.Chargaff等人對(duì)各種DNA堿基組成的定量分析結(jié)果。二是Wilkins小組用X光衍射法研究DNA的晶體,測(cè)得DNA分子呈螺旋結(jié)構(gòu)。1953年j .Watson和F.Crick通過(guò)進(jìn)一步研究,提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。從而大大推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)如下：
1．DNA分子由兩條走向相反（一條5′→3′，另一條3′→5′)但互相平行的脫氧核糖核苷酸鏈組成，以一共同軸為中心，盤(pán)繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
2．堿基在雙螺旋內(nèi)側(cè)。一條鏈堿基上-NH的氫原子與另一條鏈堿基上的氧原子或氮原子形成氫鍵。氫鍵總是發(fā)生在A(yíng)與T，G與C之間，前者有兩個(gè)氫鍵，后者有三個(gè)氫鍵。這稱(chēng)為堿基配對(duì)或堿基互補(bǔ)規(guī)律。由此，兩條多核苷酸鏈又可稱(chēng)為互補(bǔ)鏈。
3．各堿基對(duì)處于同一平面，且垂直于雙螺旋的中心軸。相鄰堿基對(duì)之間尚存在范德華（Vander Warls)引力，從而進(jìn)一步穩(wěn)定了雙螺旋結(jié)構(gòu)。
4．雙螺旋的直徑為2nm，每個(gè)螺距為3.4nm，內(nèi)包含10個(gè)堿基對(duì)，因此每個(gè)堿基對(duì)距離為0.34 nm。
（四)DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)是指雙螺旋鏈作進(jìn)一步的扭曲構(gòu)象。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)形式。目前發(fā)現(xiàn)許多病毒DNA，線(xiàn)粒體DNA，都是環(huán)型雙鏈DNA，而具有超螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)超螺旋型DNA的一條鏈上出現(xiàn)缺口時(shí)，超螺旋結(jié)構(gòu)被松開(kāi)，可解旋形成開(kāi)環(huán)型結(jié)構(gòu)。
DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與其結(jié)合的蛋白質(zhì)有關(guān)。真核細(xì)胞染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。核小體是由組蛋白H2A，H2B，H3和H4各二個(gè)分子組成的八聚體，外繞DNA形成核心顆粒。連接各核心顆粒的區(qū)域稱(chēng)連接區(qū)，它是由組蛋白H1及大約60-100個(gè)堿基對(duì)DNA組成。一個(gè)完整的核小體由核心顆粒與連接區(qū)組成。各個(gè)核小體彼此相聯(lián)沿染色質(zhì)纖維的縱軸列成一種串珠狀重復(fù)性結(jié)構(gòu)。串珠狀核小體長(zhǎng)鏈可進(jìn)一步卷曲，形成螺旋筒結(jié)構(gòu)。在形成染色單體時(shí)，螺旋筒再進(jìn)一步卷曲、折疊。人體每個(gè)細(xì)胞中長(zhǎng)約1.7μm的DNA雙螺旋鏈，最終被壓縮8400多倍，分布于各染色單體中。
（一)RNA類(lèi)型
細(xì)胞內(nèi)含有三類(lèi)主要的RNA，即核蛋白體RNA（RibosomalRNA， rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Transfer RNA，tRNA)及信使（Messenger RNA，mRNA)。
1．rRNA。是核蛋白體的組成部分，含量最多，約占細(xì)胞內(nèi)全部RNA的74~80%，在真核細(xì)胞中有四種rRNA，分子大小不均。它們分別與70多種蛋白質(zhì)相結(jié)合而構(gòu)成核蛋白體大小亞基，是蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機(jī)”。
2．tRNA。占細(xì)胞內(nèi)RNA總量的10~25%，分散于胞液中。種類(lèi)很多，每種氨基酸都有與
其相對(duì)應(yīng)的一種或幾種tRNA。tRNA分子由70~90個(gè)核苷酸組成，所以分子量較小，tRNA的生理功能是運(yùn)輸活化了的氨基酸，參與蛋白質(zhì)的生物合成。
3．mRNA。占細(xì)胞內(nèi)RNA總量的2~5%，其代謝活躍，更新迅速，所以半衰期較短。細(xì)胞內(nèi)mRNA的種類(lèi)很多，但每種mRNA的含量卻很少，它是蛋白質(zhì)生物合成的直接模板。
（二)RNA的堿基組成
RNA分子中所含的四種基本堿基是：腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有一些稀有堿基，如假尿嘧啶及帶有甲基化的堿基等。RNA的堿基組成，不像DNA那樣具有嚴(yán)格的A-T，G-C的規(guī)律。RNA結(jié)構(gòu)也不像DNA那樣整個(gè)分子都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，而且只有局部呈雙螺旋結(jié)構(gòu)。
（三)RNA分子結(jié)構(gòu)
除少數(shù)病毒外，RNA分子均為單鏈結(jié)構(gòu)。與DNA相似，核苷酸通過(guò)3′.5′—磷酸二酯鍵連接而成多核苷酸鏈。單鏈結(jié)構(gòu)的RNA，在局部區(qū)域由于自身回折也可盤(pán)曲形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙鏈部位的堿基一般也彼此通過(guò)氫鍵而互相配對(duì)，即A-U，G-C。有些不參加配對(duì)的堿基往往被排斥在雙鏈外，形成環(huán)狀突起。在不同的RNA分子中，雙螺旋區(qū)所占比例也不相同。
1．tRNA結(jié)構(gòu)
在所有RNA中，對(duì)tRNA的研究為最多，了解得也較清楚。tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)多呈三葉草形。由于雙螺旋結(jié)構(gòu)所占比例甚高，所以三葉草形結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。tRNA是核蛋白體的組成部分。目前雖已測(cè)出不少的tRNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其功能的研究還需進(jìn)一步深入。
2．mRNA結(jié)構(gòu)
mRNA分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是，極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3′—端有一段長(zhǎng)約200個(gè)堿基的多聚腺苷酸，稱(chēng)為mRNA的“尾”。這種結(jié)構(gòu)可能與mRNA在細(xì)胞核內(nèi)合成后移至細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程有關(guān)。在mRNA分子的5′—端接一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸，稱(chēng)它為mRNA的“帽”。mRNA分子中有編碼區(qū)與非編碼區(qū)。編碼區(qū)是所有mRNA分子的主要結(jié)構(gòu)部分，決定蛋白質(zhì)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)。非編碼區(qū)與蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)控有關(guān)。
3．rRNA結(jié)構(gòu)
rRNA是核蛋白體的組成部分。目前雖已測(cè)出了不少的rRNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其功能的研究還需進(jìn)一步深入。
天然DNA分子的長(zhǎng)度可達(dá)幾厘米，而分子直徑只有2nm。如此細(xì)絲狀的雙螺旋結(jié)構(gòu)使DNA分子具有一系列理化特性。如粘度極大，在外力作用下易斷裂等。
（一)核酸的分子大小與粘度
天然DNA的分子量極大，例如，果蠅巨染色體只有一線(xiàn)形DNA，長(zhǎng)達(dá)四厘米，分子量約為8×102道爾頓。高分子溶液的粘度比一般溶液的粘度要大得多，不規(guī)則團(tuán)分子比球狀分子的粘度要大，而線(xiàn)形分子的粘度更大。因此在溶液中呈線(xiàn)形分子的DNA，即使是極稀的溶液，也具有極大的粘度。RNA溶液的粘度要小得多。當(dāng)核酸溶液在某些理化因素作用下發(fā)生變性，使螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫�(xiàn)團(tuán)時(shí)，粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標(biāo)。
（二)核酸的紫外吸收
嘌呤堿、嘧啶堿以及由它們參與組成的核苷，核苷酸及核酸對(duì)紫外光都有強(qiáng)烈的吸收作用。它們吸收紫外光的共同特點(diǎn)是在260nm處為最大吸收值。而由芳香族氨基酸參與組成的蛋白質(zhì)最大吸收值在280nm處。利用這一特性，可以鑒別核酸樣品作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)含量。
（三)核酸的變性、復(fù)性與雜交
1．核酸變性
核酸變性是指核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，氫鍵斷裂，但并不涉及核苷酸間磷酸二酯鍵的斷裂。若磷酸二酯鍵的斷裂稱(chēng)為降解，核酸降解時(shí)，核酸分子量降低。而核酸的變性并不引起核酸分子量的變化。
引起核酸變性的因素很多。由于溫度升高而引起的變性稱(chēng)熱變性。如將DNA的稀鹽溶液加熱到50℃以上幾分鐘，雙螺旋結(jié)構(gòu)即破壞，氫鍵斷裂，DNA分子的兩條鏈彼此分離，形成無(wú)規(guī)則線(xiàn)團(tuán)。變性后的DNA，由于結(jié)構(gòu)上的變化，因而發(fā)生了一系列理化性質(zhì)的改變，如260nm處紫外吸收值升高（稱(chēng)增色效應(yīng))，粘度降低以及生物學(xué)活性喪失等。能使50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱(chēng)為變性溫度（Melting temperature，Tm)Tm一般為70~85℃。Tm值與分子中G—C含量有關(guān)，即G—C配對(duì)數(shù)愈多，則Tm值愈高，反之愈低。由于溶液酸堿度的改變而引起的變性稱(chēng)酸堿變性。對(duì)DNA分子來(lái)說(shuō)，堿基對(duì)在pH4.0~11.0之間最為穩(wěn)定,超此范圍,可引起DNA分子酸堿變性。乙酸、丙酮等有機(jī)溶液及尿素也可引起核酸的變性。
2．核酸復(fù)性
變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分離的鏈重新締合而形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性或退火。復(fù)性后的DNA可基本恢復(fù)一系列的理化性質(zhì)，生物學(xué)活性也可得到部分恢復(fù)。
變性核酸的復(fù)性是有條件的。如將熱變性的DNA溶液驟然冷低溫，DNA不可能復(fù)性。只有緩慢地將它冷卻時(shí)，DNA才有可能復(fù)性。另外，變性DNA片段越大，則復(fù)性越慢。變性DNA濃度越大則越易復(fù)性。
3．核酸雜交
不同來(lái)源的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補(bǔ)，就可以經(jīng)退火處理復(fù)性現(xiàn)象，形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種依據(jù)相應(yīng)堿基配對(duì)而使不完全互補(bǔ)的兩條鏈相互結(jié)合稱(chēng)為分子雜交。因此分子雜交的基礎(chǔ)是DNA的變性與互補(bǔ)，也可以雜交形成新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前雜交技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究。將已知的特定基因（如先天性遺傳疾病的某些特定基因)用同位素標(biāo)記，制備成基因探針，利用分子雜交技術(shù)，基因探針可與同源序列互補(bǔ)形成雜交體，因此可用檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)有無(wú)特定基因或DNA片段，如臨床上已應(yīng)用于產(chǎn)前診斷遺傳性疾病。
DNA作為遺傳物質(zhì)的基本特點(diǎn)就是能夠準(zhǔn)確地自我復(fù)制，而DNA的互補(bǔ)雙螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于維持這類(lèi)遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準(zhǔn)確性都是極為重要的。
（一)DNA復(fù)制的方式
從前面的內(nèi)容可知，DNA是由兩條互補(bǔ)的多核苷酸鏈組成的，其中一條鏈上的核苷酸排列順序可以決定另一條鏈上的核苷酸順序。據(jù)此推測(cè)，在復(fù)制過(guò)程中，首先DNA雙螺旋的兩條多核苷酸鏈之間氫鍵斷裂，雙鏈解開(kāi)，然后每條鏈各自作為模板，以脫氧核糖核苷酸為原料，按照堿基配對(duì)規(guī)律，合成新的互補(bǔ)鏈。這樣形成的兩個(gè)子代DNA分子與原來(lái)的親代DNA分子的核苷酸順序完全相同。在此過(guò)程中，每個(gè)子代分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。實(shí)驗(yàn)證明，DNA半保留復(fù)制的方式是正確的。由于DNA在代謝上的穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)許多代的復(fù)制，DNA分子上的遺傳信息仍可傳給后代。
（二)參與復(fù)制的酶類(lèi)
DNA的復(fù)制過(guò)程極為復(fù)雜，但其速度甚快，這是由于許多酶參與了復(fù)制過(guò)程。
1．DNA聚合酶（DNApolymerase)。四種脫氧核糖核苷酸（dNTP，N代表A、T、G、C四種堿基)是DNA合成的原料。在原有DNA模板鏈存在時(shí)，DNA聚合酶催化四種dNTP通過(guò)與模板鏈的堿基互補(bǔ)規(guī)律，合成新的DNA鏈，故此酶又被稱(chēng)為DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNa directed DNA polymerase，縮寫(xiě)為DDDP)。
值得注意的是，DNA聚合酶不能自行從頭合成DNA鏈，而必須有一個(gè)原有的多核苷酸鏈作為引物，DNA聚合酶只能在引物的3′末端上逐步合成DNA鏈。由此可見(jiàn)，DNA鏈的合成方向是從5′端至3′端進(jìn)行的。
無(wú)論在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，均存在著多種DNA聚合酶，它們的性質(zhì)不完全相同。目前認(rèn)為，在真核細(xì)胞中，DNA聚合酶α在復(fù)制中起關(guān)鍵作用，而DNA聚合酶β主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。
2． 引物酶。由于DNA聚合酶不能自行從頭合成DNA鏈，因此在復(fù)制過(guò)程中首先需要合成一小段RNA的多核苷酸鏈作引物，在這段RNA引物的基礎(chǔ)上引導(dǎo)DNA鏈的合成，催化RNA引物合成的酶是引物酶，實(shí)際上它是一種特殊的RNA聚合酶。
3．DNA連接酶。因?yàn)閺?fù)制過(guò)程中，DNA鏈的合成方向只能由5′端→3′端方向進(jìn)行，因此其中有一條新鏈的合成是不連續(xù)的。起初生成的是許多短鏈。需要DNA連接酶將它們連接起來(lái)。
4．參與DNA解旋、解鏈的酶及因子。已知DNA具有超螺旋結(jié)構(gòu)。復(fù)制時(shí)必須松弛DNA模板的超螺旋結(jié)構(gòu)，并使DNA的雙鏈分開(kāi)，暴露堿基，否則不可能在模板上按堿基配對(duì)原則合成新的互補(bǔ)DNA鏈。松馳模板DNA超螺旋，分開(kāi)雙鏈主要由拓?fù)洚悩?gòu)酶，解鏈酶及DNA結(jié)合蛋白等來(lái)完成。
（三)DNA復(fù)制的過(guò)程
DNA復(fù)制大致可分為以下幾個(gè)階段。
1．起始與引物RNA的合成
DNA復(fù)制有固定的起始部位，在真核細(xì)胞DNA雙鏈上有多個(gè)起始部位。復(fù)制時(shí)，解鏈酶等先使DNA的一段雙鏈解開(kāi)，形成復(fù)制點(diǎn)。這個(gè)復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個(gè)叉子，故稱(chēng)為復(fù)制叉。引物酶能辯認(rèn)起始部位，并以四種核糖核苷酸為底物，以解開(kāi)的一段DNA鏈為模板，按5′-3′方向合成RNA片段。在這一階段只合成了引物RNA，為DNA鏈的合成做好了準(zhǔn)備工作。
2．DNA片段的生成
在細(xì)胞內(nèi)，DNA的兩條鏈都可作為模板，同時(shí)合成兩條DNA鏈。由于DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械�，即一條鏈?zhǔn)?′→3′方向，而另一條鏈則是3′→5′方向。但是，DNA聚合酶催化DNA鏈的合成只能順著5′→3′方向進(jìn)行。因此，在新的DNA鏈中有一條連續(xù)合成的（稱(chēng)前導(dǎo)鏈)，而另一條是不連續(xù)合成的（稱(chēng)隨從鏈。在隨從鏈合成過(guò)程中，先合成的是較短的片段（稱(chēng)為岡崎片段)，然后將這些片段再連結(jié)起來(lái)，形成完整的DNA鏈。岡崎片段的合成方向仍然是5′→3′，反應(yīng)直至下一個(gè)引物RNA的5′端為止。
3．RNA引物的水解
DNA片段合成一定長(zhǎng)度后，鏈中的RNA引物被核酸酶水解而切掉。此時(shí)出現(xiàn)的缺口由DNA片段繼續(xù)延長(zhǎng)而填補(bǔ)。
4．完整的DNA分子的形成
相鄰的兩個(gè)DNA片段在DNA連接酶作用下連接起來(lái)，形成大分子DNA鏈，與其對(duì)應(yīng)的模板DNA鏈一起生成子代雙螺旋DNA，即完整的DNA分子。
DNA復(fù)制過(guò)程十分準(zhǔn)確，極少發(fā)生錯(cuò)誤，由此保證了子代DNA與親代DNA分子完全相同，這是遺傳穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)。某些因素可使DNA結(jié)構(gòu)改變，則導(dǎo)致子代DNA結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化，稱(chēng)為遺傳的變異。
這是最早用于性病診斷的重組DNA技術(shù)�；驹硎蔷哂幸欢ㄍ葱缘膬蓷l核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，此雜交過(guò)程是高度特異的。雜交的雙方是待測(cè)核酸及探針。待測(cè)核酸序列為性病病原體基因組或質(zhì)粒DNA。探針以放射核素或非放射性核素標(biāo)記，以利于雜交信號(hào)的檢測(cè)。
所謂雜交（hydridization)指兩個(gè)以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid)，雜交體中的分子不是來(lái)自一個(gè)二聚體分子。同一個(gè)二聚體中的兩個(gè)分子在變性解離后重組合稱(chēng)為復(fù)性。利用兩條不同來(lái)源的多核苷酸鏈之間的互補(bǔ)性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術(shù)相對(duì)應(yīng)的另一項(xiàng)技術(shù)被稱(chēng)為探針技術(shù)，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)，我們把標(biāo)記的分子叫探針（Probe)。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標(biāo)記技術(shù)。
（一)DNA的變性
DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，形成無(wú)規(guī)則線(xiàn)團(tuán)，稱(chēng)為DNA變性。加熱、改變DNA溶液中的pH，或有機(jī)溶劑等理化因素的影響，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
（二)DNA復(fù)性
變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。
核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過(guò)堿基對(duì)之間非共價(jià)健的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間，由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時(shí)，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過(guò)程稱(chēng)為變性，一般通過(guò)加熱或提高pH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。使單鏈聚合成雙鏈過(guò)程稱(chēng)為退火或復(fù)性。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。
（三)探針——靶分子反應(yīng)
從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)�？贵w——抗體、外源凝集素——碳水化合物、親合素——生物素、受體——配基（Ligand)以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針——靶分子反應(yīng)，蛋白質(zhì)探針（如抗體)與特異靶分子是通過(guò)混合力（疏水離子和氫鍵)的作用在少數(shù)特異位點(diǎn)上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長(zhǎng)短不同，通過(guò)氫鍵幾十、幾百甚至上千個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合。這就決定它的特異性。
基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類(lèi)，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類(lèi)。DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。
（一)DNA探針
DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針�，F(xiàn)已獲的DNA探針?lè)N類(lèi)很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、真菌、動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞DNA探針，這類(lèi)探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類(lèi)ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴(lài)于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類(lèi)和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類(lèi)學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。
DNA探針（包括cDNA探針)有三大優(yōu)點(diǎn)：第一，這類(lèi)探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。其次，DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。
（二)cDNA探針
cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（complementary DNA)。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進(jìn)而整合入宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時(shí)復(fù)制，這種整合的病毒基因組稱(chēng)為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達(dá)，故無(wú)毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制。如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)于mRNA的cDNA鏈，然后再用RNaseH將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個(gè)有限制酶切點(diǎn)的接頭(Adapter),再經(jīng)特定限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補(bǔ)末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用這類(lèi)載體可以得到包含105以上轉(zhuǎn)化子文庫(kù)，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。
（三)RNA探針
RNA探針是一類(lèi)很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過(guò)程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受多種因素的制約。這類(lèi)RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV)的基因組DNA克隆時(shí)，因無(wú)DNA探針可www.med126.com利用，獲得HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。
隨著體外逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已成功的建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類(lèi)新型載體PSP和PGEM，這類(lèi)載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄。如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA片段，則可以以DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1小時(shí)內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)物。只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的dUTP，則所合成的RNA可得高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長(zhǎng)度并可提高標(biāo)記分子的利用率。
RNA探針和cDNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。
（四)寡核苷酸探針
前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，也常應(yīng)用克隆探針。克隆探針一般較寡核苷酸探針的特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長(zhǎng)的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序列少�？寺√结樀牧硪粌�(yōu)點(diǎn)是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基因更多。但是，較長(zhǎng)的探針對(duì)于靶序列變異的識(shí)別能力又有所降低。對(duì)于僅是單個(gè)堿基或少數(shù)堿基不配的兩個(gè)序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號(hào)相當(dāng)。這既是其優(yōu)點(diǎn)，又是其缺點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)用于檢測(cè)病原微生物時(shí)，不會(huì)因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點(diǎn)則是不能用于檢測(cè)突變點(diǎn)。這種情況，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。
合成的寡核苷酸探針具有以下特點(diǎn)：第一，由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短。第二，寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)一個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基錯(cuò)配能大幅度降低雜交體的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。最常用的寡核苷酸探針長(zhǎng)18—40個(gè)鹼基，目前的合成可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。
對(duì)于合成的寡核苷酸探針有以下要求：
（1)長(zhǎng)度以18-50堿基為宜，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量也低；較短探針特異性較差。
（2)堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。
（3)探針?lè)肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
（4)避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)。
（5)一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將該序列與核酸庫(kù)中的核酸序列比較，探針序列應(yīng)與靶序列核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源。否則，該探針不能用。
分子雜交是核酸鏈以堿基配對(duì)規(guī)則的一種結(jié)合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來(lái)對(duì)特定核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測(cè)的進(jìn)行標(biāo)記，這條鏈就稱(chēng)為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。放射性同位素標(biāo)記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I半衰期為60天)，3H的半衰期長(zhǎng)達(dá)12.3年，但它所釋放β射線(xiàn)的能量太低，只能用于組織原位雜交。由于同位素標(biāo)記的探針在使用過(guò)程中存在著上述缺點(diǎn)，近年來(lái)，人們?cè)趯ふ曳欠派湫詷?biāo)記物方面取得了很大進(jìn)展。國(guó)內(nèi)已具備生物素類(lèi)標(biāo)記物的生產(chǎn)能力，并有相應(yīng)試劑出售。目前非放射性標(biāo)記物有下述幾類(lèi)：金屬如Hg、熒光物質(zhì)如F2TC、半抗原如地高辛、生物素、酶類(lèi)如辣根過(guò)氧化物酶（HRP)、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP)等，不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測(cè)方法也各異。
核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有：缺口平移；DNA快速末端標(biāo)記；用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNa5"末端，隨引物延伸；聚合酶鏈反應(yīng)。
核酸探針的非放射性標(biāo)記技術(shù)有：光促生物素標(biāo)記核酸、酶促生物素標(biāo)記核酸、寡核苷酸的生物素末端標(biāo)記、酶標(biāo)DNA、酶標(biāo)寡核苷酸、DNA半抗原標(biāo)記。
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術(shù)不斷出現(xiàn)和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類(lèi)型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。
在固相雜交中，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，所以比較常用。常用的固相雜交類(lèi)型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
液相雜交是一種研究最早且操作簡(jiǎn)便的雜交類(lèi)型，由于液相雜交后過(guò)量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高，所以不如固相雜交那樣普遍。近幾年由于雜交檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實(shí)際應(yīng)用，推動(dòng)了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展，下面對(duì)固相雜交和液相雜交分別進(jìn)行介紹。
（一)固相膜核酸分子雜交方法。
固相核酸雜交多是在膜上進(jìn)行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法。
1．DNA的變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時(shí)，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0)和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時(shí)。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度（100μg/ml)和低鹽濃度（0.1SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml，加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8)，室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10mol/l HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100℃后，調(diào)至中性，或只加熱100℃10min)。DNA變性可用OD260增加（約30-40%)來(lái)檢測(cè)，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。
2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um)先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。
3．預(yù)雜交。濕潤(rùn)的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚(yú)精DNA)。鮭魚(yú)精DNA需經(jīng)過(guò)剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴中保溫3-12h，當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68℃時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成水氣泡，輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤(rùn)預(yù)雜交液很重要。
4．雜交�！乃≈腥〕鏊芰洗�，用剪刀剪開(kāi)一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤(rùn)（50ul/cm2)。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚(yú)精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20h。
5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開(kāi)，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤(pán)中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動(dòng)),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動(dòng)保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。
洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C)%]，雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)每增加1%而遞減1℃。
6．結(jié)果顯示。放射性測(cè)定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計(jì)數(shù)法，放射自顯影法比較簡(jiǎn)單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影，定影即可。對(duì)于雜交信號(hào)較強(qiáng)的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強(qiáng)暴光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20℃或-80℃下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于斑點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱等情形，方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊)，80℃真空干燥后裝閃爍瓶，加入2—5ml閃爍液，剪2-3塊無(wú)樣品作為本底對(duì)照，在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動(dòng)計(jì)數(shù)，液體計(jì)數(shù)測(cè)定放射性強(qiáng)度也可以在放射自顯影之后進(jìn)行。
（二)固相核酸分子雜交類(lèi)型
1．菌落原位雜交（colony in situhybridization)。是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。
②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。
③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。
④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸濕的濾紙上，放置10min。
⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L Tris-HClpH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。
⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。
⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。
2．斑點(diǎn)雜交（Dot blot)。是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold)，如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線(xiàn)照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。
（1)DNA斑點(diǎn)雜交：
①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn)5μl(2~10μg DNA)。
④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>
（2)RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類(lèi)似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化)，方法是將RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛)，使RNA變性，然后取5-8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。
（3)完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類(lèi)似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測(cè)。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。
3.Southern印跡雜交（Southern blot)。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（1)瓊脂糖凝膠電泳。利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.3～25kb)分離開(kāi)，分離大分子DNA片段（800-12000bp)用低濃度瓊脂糖（0.7%)，分離小分子片段（500～1000bp)用高濃度瓊脂糖（1.0%)，300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。根據(jù)分離樣品品質(zhì)，分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。
電泳時(shí)，同時(shí)將分子量標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過(guò)夜，電泳完畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40s。
（2)硝酸纖維素膜吸印。
[1]將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號(hào)。
[2]將膠片放進(jìn)盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH)的盤(pán)中輕晃15min。
[3]換到中和緩沖液（1mol/l Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH)的盤(pán)中輕晃30min。
[4]裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙)，都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路)。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC緩沖液,接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴手套操作。
[5]平盤(pán)上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙,起燈蕊作用,盤(pán)中加入少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚)，不能沒(méi)過(guò)平板，使3mm濾紙充分飽和。
[6]將膠倒扣在3mm濾紙上。
[7]浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對(duì)齊。鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時(shí)，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。
[8]膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。
[9]上面加吸印紙及重物（500g左右)。
[10]通過(guò)濾紙的燈芯作用，平盤(pán)中的緩沖液就會(huì)通過(guò)膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時(shí)更換浸濕的吸印紙，在室溫下轉(zhuǎn)印過(guò)夜。
[11]清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6×SSC中洗一下。
[12]自然干燥，80℃烤2h。
[13]這是的膜就可進(jìn)行雜交，或室溫密封保存。
4．Northern印跡雜交（Northernblot)。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱(chēng)為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱(chēng)為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱(chēng)為Western blot。Northern 印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類(lèi)似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2"-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過(guò)程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因?yàn)樗鼤?huì)影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測(cè)定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過(guò)久，會(huì)使RNA信號(hào)降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時(shí)，甲基氫氧化銀是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。
RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。
<1>試劑：
10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS)，pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L EDTA pH8.0。
5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/lEDTA，0.4%溴酚藍(lán)。
甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L)，應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。
20×SSC；
去離子甲酰胺；
50mmol/LNaOH(含10mmol/L NaCl)；
0.1mol/LTris，pH7.5。
<2>步驟：
[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。
[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。
[3]使RNA變性（最多20μg)，RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。
[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。
[5]加2ml5×載樣緩沖液。
[6]上樣、同時(shí)加RNA標(biāo)記物。
[7]60伏電泳過(guò)夜。
[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。
[9]室溫下將膠浸到50mmol/l NaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。
[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。
[11]20×SSC洗膠1h。
[12]20×SSC中過(guò)夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。
[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。
5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization)。組織原位雜交簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。
用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長(zhǎng)度以100-400nt為宜，過(guò)長(zhǎng)則雜交率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16-30nt)能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針，因此，寡核苷酸探針和不對(duì)稱(chēng)PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。
探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標(biāo)記的探針半衰期長(zhǎng)，成像分辨率高，便于定位，缺點(diǎn)是能量低，35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過(guò)高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。
原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進(jìn)一步完善和提高。
6，固相夾心雜交。Dunn等最早介紹了夾心雜交類(lèi)型，Ranki等又作了進(jìn)一步的改進(jìn)，夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：（1)樣品不需固定，對(duì)粗制樣品能做出可靠的檢測(cè)；（2)用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強(qiáng)，因?yàn)橹挥袃蓚�(gè)雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
固相夾心法雜交需要兩個(gè)靠近而又互相重疊的探針，一個(gè)做固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測(cè)探針，樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個(gè)探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)，需要注意的是兩探針必須分別亞克隆進(jìn)入兩個(gè)分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號(hào)。
夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)和更容易對(duì)小量樣品進(jìn)行操作。Dahlen等利用微孔板進(jìn)行夾心雜交，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，他們先吸附DNA探針加到凹板中，然后用紫外線(xiàn)照射使其固定到塑料板上，用微孔板進(jìn)行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物素標(biāo)記探針，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標(biāo)記探針（3×108cpm/μg)作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點(diǎn)還有可同時(shí)操作多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動(dòng)化。
7． 其它雜交類(lèi)型
（1)固化探針雜交。該法較少使用，原理是使未標(biāo)記固化探針通過(guò)雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進(jìn)行測(cè)定，探針濃度為2μg/ml,80℃雜交，可在10-15min完成，檢測(cè)的敏感性為5×106靶序列。
（2)反向雜交：這個(gè)雜交類(lèi)型是用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化探針DNA雜交，故稱(chēng)為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次雜交中，可同時(shí)檢測(cè)樣品中幾種核酸。這種雜交方式主要用于進(jìn)行中的核轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)和多種病原微生物的檢測(cè)，前者是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中標(biāo)記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標(biāo)記樣品核酸。
8．固相膜核酸雜交膜的選用。雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進(jìn)行檢測(cè)。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射性標(biāo)記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性不是很清楚，推測(cè)為非共價(jià)鍵結(jié)合，經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會(huì)脫落。硝酸纖維素膜的另一特點(diǎn)是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點(diǎn)是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（>10×SSC),與小片核酸(<200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。
尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強(qiáng)度大，耐用，可與小至10bp的片段共價(jià)結(jié)合，在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需烘烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標(biāo)本，它通過(guò)疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350-500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80-100μg/cm2)強(qiáng)許多。尼龍膜的缺點(diǎn)是對(duì)蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。
9．“噪音”的排除�！霸胍簟保╪oise)是固相膜雜交方法常遇到的問(wèn)題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計(jì)數(shù)，即本底。這個(gè)問(wèn)題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應(yīng)液和對(duì)膜進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強(qiáng)度的增加，空白膜（未固定DNA對(duì)照膜)上的“噪音”水平增加，而在50%甲酰胺-6×SSC的雜交反應(yīng)液中“噪音”最低。目前，最常使用的消除噪音的方法是用Denhardt液與固定膜預(yù)保溫，這樣可以充分封閉膜上的多條非特異結(jié)合位點(diǎn)。
（三)液相核酸分子雜交類(lèi)型
1、吸附雜交
（1)HAP吸附雜交，羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法，在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上，通過(guò)離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計(jì)數(shù)器上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。
（2)親和吸附雜交：生物素標(biāo)記DNA探針與溶液中過(guò)量的靶RNA雜交，雜交物吸附到酰化親和素包被的固相支持物（如小球)上，用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng)，加入酶顯色底物。這個(gè)系統(tǒng)可快速（2h)檢測(cè)RNA。
（3)磁珠吸附雜交：Gen-Probe公司最近應(yīng)用丫啶翁酯（Acridinium ester)標(biāo)記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)，探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽(yáng)離子磁化微球體)上，溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學(xué)發(fā)光測(cè)定。
2、發(fā)光液相雜交
（1)能量的傳遞法。Heller等設(shè)計(jì)用兩個(gè)緊接的探針，一個(gè)探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團(tuán)（供體)標(biāo)記，另一個(gè)探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，并且這兩個(gè)探針靠得很近，兩個(gè)靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標(biāo)記（光發(fā)射標(biāo)記)。當(dāng)探針與特異的靶雜交后，這些標(biāo)記物靠得很近，一種標(biāo)記物發(fā)射的光被另一種標(biāo)記物吸收，并重新發(fā)出不同波長(zhǎng)的光，調(diào)節(jié)檢測(cè)器使自動(dòng)記錄第二次發(fā)射光的波長(zhǎng)，只有在兩個(gè)探針?lè)肿涌康煤芙鼤r(shí)，才能產(chǎn)生激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。
（2)丫啶翁酯標(biāo)記法。丫啶翁酯標(biāo)記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標(biāo)記探針?lè)肿由系难距の条タ梢杂脤?zhuān)門(mén)的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學(xué)發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點(diǎn)是檢測(cè)的敏感度低（1ng的靶核酸)，僅適用于檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列，如rRNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、液相夾心雜交
（1)親和雜交 在靶核酸存在下，兩個(gè)探針與靶雜交，形成夾心結(jié)構(gòu)。雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上，而雜交物上的檢測(cè)探針可產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。用生物素標(biāo)記吸附探針，及125I標(biāo)記檢測(cè)探針。這個(gè)系統(tǒng)的敏感性可檢測(cè)出4×105靶分子，該試驗(yàn)保持了固相夾心雜交的高度特異性。
（2)采用多組合探針和化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 第一類(lèi)探針是未標(biāo)記的檢測(cè)探針和液相吸附探針，它們有50個(gè)堿基長(zhǎng)，其中含有30個(gè)細(xì)菌特異序列堿基和20個(gè)堿基的單鏈長(zhǎng)尾；第二類(lèi)探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標(biāo)記檢測(cè)探針的單鏈長(zhǎng)尾用于結(jié)合擴(kuò)增多體（標(biāo)記探針)，液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上。典型的試驗(yàn)可有25個(gè)不同的檢測(cè)探針和10個(gè)不同的吸附探針，第一個(gè)標(biāo)記檢測(cè)探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶)，可實(shí)現(xiàn)未標(biāo)記檢測(cè)探針的擴(kuò)增，使用化學(xué)發(fā)光酶的底物比用顯色反應(yīng)酶的底物敏感。這個(gè)雜交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質(zhì)�？剐缘臋z測(cè)，敏感性能達(dá)到檢測(cè)5×104雙鏈DNA分子。
4、復(fù)性速率液相分子雜交
這個(gè)方法的原理是細(xì)菌等原生物的基因組DNA通常不包含重復(fù)順序，它們?cè)谝合嘀袕?fù)性（雜交)時(shí)，同源DNA比異源DNA的復(fù)性速度要快，同源程度越多，復(fù)性速率和雜交率越快。利用這個(gè)特點(diǎn)，可以通過(guò)分光光度計(jì)直接測(cè)量變性DNA在一定條件下的復(fù)性速率，進(jìn)而用理論推導(dǎo)的數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算DNA-DNA之間的雜交（結(jié)合)度。
聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新�？蓪O微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，從而大大提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力，能檢測(cè)單分子DNA或?qū)γ?0萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。
PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福利亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻(xiàn)者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年首次報(bào)道PCR方法以來(lái)，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來(lái)越大的作用。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對(duì)該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡(jiǎn)單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能。我們的方法迅速在全國(guó)各大醫(yī)院得到推廣。
PCR擴(kuò)增DNA的原理是：先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開(kāi)為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對(duì)根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)，過(guò)少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火)，在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP)為原料按5"到3"方向?qū)⒁镅由臁⒆詣?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開(kāi)始第二次循環(huán)擴(kuò)增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補(bǔ)序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開(kāi)—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過(guò)程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。
PCR的擴(kuò)增倍數(shù)Y=（1+E)n,這里Y是擴(kuò)增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴(kuò)增效率。設(shè)PCR擴(kuò)增效率E為100%、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴(kuò)增到33554432個(gè)拷貝，即擴(kuò)增3355萬(wàn)倍：若E為80%、n=20、則擴(kuò)增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴(kuò)增產(chǎn)物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴(kuò)增數(shù)量減少1048576個(gè)拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物約減少97%。可見(jiàn)PCR循環(huán)擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)都對(duì)擴(kuò)增數(shù)量有很大影響。PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線(xiàn)上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。PCR反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間主要取決于反應(yīng)開(kāi)始時(shí)樣品中的靶DNA的含量和擴(kuò)增效率，起始模板量越多到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間就越短、擴(kuò)增效率越高到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增都對(duì)到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間有影響。
（一)特異性高：首次報(bào)導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段，其酶活性在90℃會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時(shí)引物是在37℃延伸（聚合)易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯(cuò)配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時(shí)不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過(guò)程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬(wàn)分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對(duì)的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測(cè)病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
（二)高度敏感：理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬(wàn)倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測(cè)分析量的DNA。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測(cè)。
（三)快速及無(wú)放射性：一般在2小時(shí)內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時(shí)便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來(lái)擴(kuò)增檢測(cè)，省去費(fèi)時(shí)繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無(wú)放射性易于推廣。
（四)簡(jiǎn)便：擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測(cè)。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中。
（五)可擴(kuò)增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對(duì)長(zhǎng)度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長(zhǎng)的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對(duì)外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。
（一)試劑
（1)引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生
物都有自己特異的引物。
（2)耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的，能耐受高溫90℃-100℃。
（3)10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購(gòu)買(mǎi)。
（4)5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測(cè)定�，F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
（5)DNA模板：用處理液將待測(cè)標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測(cè)的DNA。
（二)操作程序
過(guò)去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下：
（1)向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液1/10體積
ddH2O 補(bǔ)到終體積（終體積50μl-100μl)
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。
（2)加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
（3)冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合。現(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
（4)PCR的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來(lái)一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進(jìn)行特異性的DNA擴(kuò)增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴(kuò)增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對(duì)Impraim的方法進(jìn)行了改進(jìn)。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
在應(yīng)用PCR方法檢測(cè)RNA病毒時(shí)，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)镻CR只能對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過(guò)程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。
（一)模板核酸
PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。不過(guò)RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。不同來(lái)源的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴(kuò)增，處理不當(dāng)或處理過(guò)程中DNA掉失都會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測(cè)的靶DNA都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴(kuò)增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
（二)引物
PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計(jì)與合成對(duì)PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC)純化。因?yàn)楹铣傻囊镏袝?huì)有相當(dāng)數(shù)量的“錯(cuò)誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產(chǎn)物以及可檢測(cè)到的堿基修飾的完整鏈和高分子量產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和信號(hào)強(qiáng)度的降低。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20℃至少保存12-24個(gè)月，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個(gè)月。引物不用時(shí)應(yīng)存于-20℃保存。
PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴(kuò)增效果，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會(huì)出現(xiàn)假陰性。引物濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會(huì)增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競(jìng)爭(zhēng)DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴(kuò)增量降低。一般認(rèn)為PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最適濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此濃度。
（三)緩沖液
PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20℃時(shí)其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實(shí)際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時(shí)會(huì)增加產(chǎn)量。
反應(yīng)混合液中50mmol/L以?xún)?nèi)的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/lNaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml)或明膠（0.01%)或Tween20（0.05% ～0.1%)有助于酶的穩(wěn)定，反應(yīng)中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT)也有類(lèi)似作用，尤其在擴(kuò)增長(zhǎng)片段（此時(shí)延伸時(shí)間長(zhǎng))時(shí)，加入這些酶保護(hù)劑對(duì)PCR反應(yīng)是有利的。
（四)Mg2+
Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著降低；過(guò)高時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實(shí)際濃度。因?yàn)門(mén)aq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。
（五)三磷酸脫氧核苷酸（dNTP)
四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP)是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。過(guò)高的dNTP濃度會(huì)導(dǎo)致聚合將其錯(cuò)誤摻入（即所謂的“熱力背信”)，因此應(yīng)當(dāng)避免。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。
（六)耐熱DNA聚合酶
PCR之所以能得到廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)門(mén)aq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq)中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡(jiǎn)化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的最適溫度很高（79℃)，使引物在高溫下進(jìn)行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強(qiáng)度并減少了與錯(cuò)配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實(shí)驗(yàn)失敗的常見(jiàn)原因。
（七)溫度循環(huán)參數(shù)
1．變性溫度與時(shí)間
PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開(kāi)，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)變性就越充分。但溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)影響TaqDNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第一個(gè)循環(huán)變性最重要，需時(shí)間較長(zhǎng)，因模板DNA的鏈比較長(zhǎng)。
2．復(fù)性溫度與時(shí)間
變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯(cuò)配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時(shí)間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)增加非特異的復(fù)性。
3．延伸溫度與時(shí)間
引物延伸溫度一般為72℃。這個(gè)溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會(huì)影響其產(chǎn)量，72℃時(shí)，核苷酸的合成速度為35-100個(gè)核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對(duì)于長(zhǎng)達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的。然而，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)很低濃度底物的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要長(zhǎng)些。
4．循環(huán)數(shù)：
循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時(shí)、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時(shí)也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。
在將Taq DNA聚合酶引入PCR反應(yīng)，并使之達(dá)到自動(dòng)化之后，PCR反應(yīng)已變得十分的簡(jiǎn)單了。但是PCR樣品的采集及制備卻并非同樣簡(jiǎn)單，而且，許多PCR的失敗都?xì)w因于標(biāo)本的制備不當(dāng)。用于PCR的標(biāo)本必須經(jīng)適當(dāng)處理后才能使用，因?yàn)闃?biāo)本中的許多雜質(zhì)能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，處理標(biāo)本可使待擴(kuò)增DNA暴露，能與引物復(fù)性。關(guān)于PCR標(biāo)本制備各種專(zhuān)業(yè)書(shū)中介紹了許多，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)操作復(fù)雜、不慎便容易造成污染，且不實(shí)用�，F(xiàn)介紹一種簡(jiǎn)單快速的處理方法即3%異硫氰酸胍和待檢標(biāo)本混合100℃，10min，離心取上清作為PCR模板即可。
所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒(méi)有出，我們把它稱(chēng)作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱(chēng)為假陽(yáng)性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見(jiàn)的問(wèn)題就是假陰性和假陽(yáng)性問(wèn)題。
（一)假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見(jiàn)的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過(guò)關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來(lái)擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會(huì)獲得成功。如果沒(méi)有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問(wèn)題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿)的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對(duì)變異較大的擴(kuò)增對(duì)象，宜采用巢式（Nested)PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。
（二)假陽(yáng)性：PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)镻CR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽(yáng)性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個(gè)重要手段。擴(kuò)增片段的檢測(cè)和分析才是目的，根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，點(diǎn)雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測(cè)的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于產(chǎn)物的精確分析。
（一)凝膠電泳分析法
PCR產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以前者最常用，通過(guò)電泳可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測(cè)中，僅通過(guò)凝膠電泳判斷擴(kuò)增片段大小即可滿(mǎn)足檢測(cè)的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀(guān)察結(jié)果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測(cè)擴(kuò)增的情況，還可以用來(lái)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
（二)點(diǎn)雜交
當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適。這種方法的基本過(guò)程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。點(diǎn)雜交還有助于檢測(cè)突變DNA的突變類(lèi)型，用于人類(lèi)遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對(duì)人們認(rèn)識(shí)某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗(yàn)，用非放射性物質(zhì)（生物素、熒光素和地高辛等)標(biāo)記的寡核苷酸探針?lè)治鯬CR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡(jiǎn)便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測(cè)速度快。
（三)微孔板夾心雜交法
該法是通過(guò)一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果，該法需要兩個(gè)雜交過(guò)程來(lái)檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測(cè)法高。該法已用于HBV的檢測(cè)，其敏感度可達(dá)5個(gè)HBvDNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡(jiǎn)便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類(lèi)似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,適于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。
（四)PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測(cè)。因?yàn)?"端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列。因此，可以通過(guò)修飾一個(gè)引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過(guò)另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測(cè)。
