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感謝大夫?yàn)槲铱焖俳獯稹撊绾沃委熀头乐?/p>
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在疫苗生產(chǎn)中，利用細(xì)胞增殖病毒制備疫苗，成本低且質(zhì)量穩(wěn)定。因此,此工藝在生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。傳代細(xì)胞雖然具有生長穩(wěn)定、均一、快速等優(yōu)點(diǎn)，但因存在致腫瘤的可能性等弊端，因此不能大量用于生產(chǎn)。所以，各種原代細(xì)胞以安全可靠，得到了大量應(yīng)用，如犢牛睪丸細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、乳豬腎細(xì)胞等。原代細(xì)胞由于受諸多因素的影響，生長很不穩(wěn)定。那么，如何做好細(xì)胞培養(yǎng)是企業(yè)降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。筆者在用乳豬腎細(xì)胞增殖豬細(xì)小病毒時(shí)，總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)供同行參考。1 培養(yǎng)底物的洗滌：一般培養(yǎng)豬腎細(xì)胞的底物多采用轉(zhuǎn)瓶，材質(zhì)有塑料或玻璃的。本試驗(yàn)采用10000mL玻璃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。用洗滌劑進(jìn)行洗滌，不采用酸堿浸泡，因酸堿浸泡的物品有殘留，對(duì)細(xì)胞的生長會(huì)有較大的影響。在多次生產(chǎn)試驗(yàn)中，細(xì)胞生長良好，貼壁效果較為理想。2 供體仔豬日齡：仔豬日齡越小，細(xì)胞分化越好，繁殖能力越強(qiáng)。在生產(chǎn)豬腎原代細(xì)胞時(shí)，我們分別選取1、3、5、7、9、11、13日齡的健康仔豬各2頭，每頭豬腎制備2個(gè)轉(zhuǎn)瓶,相同條件培養(yǎng)，觀察細(xì)胞長成單層的速度和形成單層后進(jìn)行1∶5傳代細(xì)胞的生長速度。結(jié)果用1、3、5、7日齡仔豬腎制備的豬腎原代和次代細(xì)胞生長成單層的速度無顯著差別；用9、11、13日齡仔豬腎制備的原代細(xì)胞生成單層的時(shí)間較前者平均慢1~2 d,利用9日齡豬腎制備的次代細(xì)胞長成單層時(shí)間較長，用11、13日齡仔豬腎制備的次代細(xì)胞生長不好，不能形成單層。3 仔豬生理狀況：用于生產(chǎn)豬腎細(xì)胞的仔豬應(yīng)健康，不應(yīng)感染有傳染��；身體不健康直接影響原代細(xì)胞的生長活力。4 細(xì)胞營養(yǎng)液：乳漢液按《獸用生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》（2000版)規(guī)定的方法制備，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。4.1 稱取各種試劑藥品要準(zhǔn)確，嚴(yán)格按規(guī)程要求的方法按順序稱取，不得將物品的順序顛倒。溶解時(shí)要等先加入的試劑溶解了再加入另一種試劑，甲液和乙液配好后，要將乙液緩緩加入到甲液中并混合均勻。然后按要求加入水解乳蛋白。4.2 乳漢液培養(yǎng)液配好后，應(yīng)檢驗(yàn)溶液的緩沖系統(tǒng)是否具有緩沖能力，如緩沖效果不好或不具有緩沖的能力應(yīng)將其棄之，重新配制。5豬腎細(xì)胞的制備 (1)豬腎組織塊的制備：無菌摘取乳豬腎，除去包膜和腎的髓質(zhì)，盡量將其去凈，因過多的髓質(zhì)會(huì)影響細(xì)胞的生長。做好后，用乳漢液洗滌2~3次，用無菌的剪子將其剪成1~2 mm的小塊后，再洗滌2~3次，洗至液體澄清為止。(2)細(xì)胞消化與分散：在細(xì)胞消化時(shí)，液體的pH應(yīng)調(diào)至略堿性，效果較好。消化時(shí)間不應(yīng)將預(yù)熱時(shí)間計(jì)算在內(nèi)。消化時(shí)間一般為30~50 min，并視消化程度而定。消化期間要振搖數(shù)次。待組織塊周圍有30%左右出現(xiàn)絮狀物時(shí)，就已消化好了，不能等完全出現(xiàn)絮狀物時(shí)再停消。這時(shí)就已消化過重，細(xì)胞的細(xì)胞膜就已部分被破壞。死細(xì)胞較多，不利于細(xì)胞生長。 細(xì)胞分散目前多采用玻璃珠搖動(dòng)使其分散，搖時(shí)用力不要太大。防止在培養(yǎng)時(shí)死細(xì)胞過多，會(huì)產(chǎn)氨使液體的酸堿度升高，不利于細(xì)胞生長。此外用紗布濾過時(shí)，紗布的層數(shù)不要過多，2~3層紗布即可，因?yàn)椤凹?xì)胞團(tuán)”生長一般較好。此外組織也可多次消化，效果一般較好，但較繁鎖易造成污染。(3)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)速度：原代細(xì)胞培養(yǎng)一般轉(zhuǎn)瓶的速度為6~10 r/h。在生產(chǎn)中一般慢速比快速貼壁的效果好，先慢速后快速的效果會(huì)更好，貼壁后，一般快速比慢速細(xì)胞生長好。原代細(xì)胞的貼壁時(shí)間一般為10多個(gè)小時(shí)左右，次代細(xì)胞的生長速度較快，多在3~5 h，操作者可以根據(jù)需要調(diào)整轉(zhuǎn)瓶機(jī)的轉(zhuǎn)速來達(dá)到最佳的貼壁效果。6 豬細(xì)小病毒的增殖(1)豬細(xì)小病毒的接毒時(shí)間，應(yīng)待豬腎原代細(xì)胞有30%~50%生長為細(xì)胞單層時(shí)接毒，也有同步接毒的，但效果不好。細(xì)胞少比細(xì)胞多時(shí)產(chǎn)毒效果好，收獲的病毒液毒價(jià)高。我們?yōu)榱吮容^其產(chǎn)毒效果，分別取20%、30%、40%、50%、60%生成單層的豬腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶各2瓶。相同條件培養(yǎng)增毒測其病毒液效價(jià)見表1表1乳豬腎原代細(xì)胞和次代細(xì)胞的增毒效價(jià)細(xì)胞類別 病毒液效價(jià)1 病毒液效價(jià)220% 1∶128 1∶25630% 1∶512 1∶51240% 1∶512 1∶51250% 1∶512 1∶25660% 1∶128 1∶64(2)豬細(xì)小病毒（PPV)的體外復(fù)制是殺細(xì)胞性的，主要表現(xiàn)為細(xì)胞隆起、固縮、溶解。適應(yīng)了細(xì)胞培養(yǎng)的病毒在適宜條件下生長時(shí)，能使細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的病變。但在，最初分離病毒時(shí)，在沒有見到細(xì)胞病變（CPE)時(shí)，應(yīng)將病毒，更確切的說，應(yīng)將受感染的細(xì)胞培養(yǎng)物連傳幾代。免疫熒光顯微鏡的使用大大提高了細(xì)胞培養(yǎng)物中微量PPV的檢出率。雖然有幾種細(xì)胞用作增殖和滴定PPV是敏感的，但最常用還是胎兒或新生豬的原代或次代細(xì)胞。通過對(duì)正處在分裂期的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行感染，由于當(dāng)培養(yǎng)物中很多細(xì)胞處于其分裂周期的S期（即DNA合成期)時(shí)，病毒可獲得復(fù)制所需要的細(xì)胞源性DNA聚合酶。將有助于PPV的復(fù)制。(3)如果將胎兒或成年牛的血清用于PPV繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)物中，應(yīng)預(yù)先測定其中是否含有病毒抑制因子。另外，對(duì)所有的細(xì)胞培養(yǎng)物也應(yīng)檢查有無PPV的污染。(4)利用免疫熒光顯微鏡檢查細(xì)胞培養(yǎng)物中PPV的增殖情況。一般情況下，該病毒的復(fù)制情況如下：如果接種物中含有高滴度的病毒和病毒抗原，很快就能從感染細(xì)胞的胞漿中查到病毒抗原，這種早期細(xì)胞的熒光大多數(shù)是由于細(xì)胞直接吞噬了接種物中的抗原產(chǎn)生。連續(xù)檢查發(fā)現(xiàn)，這些抗原首先在細(xì)胞膜外表面出現(xiàn)，然后見于細(xì)胞漿，通常相對(duì)集中見于靠近細(xì)胞核的位置。病毒復(fù)制的最早，最明確的證據(jù)是新產(chǎn)生的病毒抗原出現(xiàn)在核內(nèi)。隨后，至少一部分感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的新合成的抗原，致使細(xì)胞漿和細(xì)胞核都帶有明亮的熒光。受感染的細(xì)胞隨后隆起、固縮、裂體并釋放出病毒和病毒抗原。培養(yǎng)物中其他處于不適宜病毒復(fù)制階段的細(xì)胞則繼續(xù)向胞漿內(nèi)吞噬，積聚病毒抗原。如果刺激這些細(xì)胞進(jìn)入S期，如通過加入新鮮培養(yǎng)液，則可以誘導(dǎo)出第二個(gè)病毒復(fù)制高峰。(5)血凝試驗(yàn)（HA)：通常在室溫下進(jìn)行，pH接近中性，使用豚鼠紅細(xì)胞。據(jù)記載，巴比妥緩沖液比磷酸鹽緩沖液作稀釋液得到的HA滴度更高（Rucker Bauer等，1978)。
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