加州鱸魚,細(xì)菌性出血病的檢測
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2013年5月份江蘇省吳江市八坼鎮(zhèn)附近網(wǎng)箱養(yǎng)殖的加州鱸接連發(fā)生發(fā)病死亡現(xiàn)象，發(fā)病對象主要為2齡加州鱸，病害主要以細(xì)菌性出血病為主，給養(yǎng)殖戶造成了不小的經(jīng)濟損失。加州鱸又名大口黑鱸，隸屬于鱸形目、鱸亞目、太陽魚科、黑鱸屬。加州鱸是廣溫肉食性淡水名貴魚類，具有個體大、生長快、適應(yīng)性強、肉味鮮美等優(yōu)點。該魚喜棲息于沙質(zhì)或沙泥質(zhì)且混濁度低的緩流靜水中，是發(fā)展池塘養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一；同時該魚較貪食，易上鉤，又是發(fā)展休閑漁業(yè)的好品種。該實驗對此次加州鱸病害的細(xì)菌性病原體為研究對象，通過分離純化，形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合16SrRNA基因序列同源性檢索，對該病原菌進(jìn)行初步判斷；通過藥敏實驗，了解該病原菌對各種抗生素的耐藥性和敏感程度，在此理論基礎(chǔ)上，結(jié)合實際養(yǎng)殖情況和發(fā)病情況，對該病建立了有效的防治技術(shù)，治療效果良好。材料與方法1.材料蘇州市天德水產(chǎn)科技有限公司提供的某養(yǎng)殖戶的患病鱸魚（瀕死)若干條、BHI培養(yǎng)基、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司)。2.方法（1)病例檢驗2013年5月，對江蘇省吳江市八坼鎮(zhèn)附近加州鱸網(wǎng)箱養(yǎng)殖的發(fā)病情況、病理變化等進(jìn)行檢查。（2)細(xì)菌分離與純化采用平板劃線法，在BHI固體培養(yǎng)基上對瀕死的患病加州鱸的肝、脾和腎等實質(zhì)性器官進(jìn)行接種培養(yǎng)。接種后將培養(yǎng)皿置于28℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。選擇呈優(yōu)勢生長的單菌落，在BHI固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，從而得到單一菌種，并對得到的純菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢。（3)16SrRNA基因序列的PCR擴增測序及同源性檢索對分離得到的純菌株進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行提取后，采用16SrRNA基因通用引物進(jìn)行擴增。所用引物：27F：5ˊ-AGAGTTT?GATC(C/A)TGGCTCAG-3ˊ1492R：5ˊ-GGTTACCTTGT?TACGACTT-3ˊ(Martinetal,1998)20μl反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性1分鐘，45℃復(fù)性1.5分鐘，72℃延伸1.5分鐘，30個循環(huán)后，72℃溫育2分鐘。（4)藥敏實驗采用紙片擴散法，病原菌接種BIH液體培養(yǎng)基，28℃震蕩培養(yǎng)24小時，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度為1.0×108CFU/ml，將菌液均勻涂布在BIH平板上，貼上藥敏紙片，28℃培養(yǎng)24小時，測量抑菌圈大小并判定結(jié)果。（5)治療方法根據(jù)病原菌鑒定和藥敏試驗結(jié)果，以外用和內(nèi)服相結(jié)合的方法進(jìn)行治療，外用藥選用二氧化氯，內(nèi)服藥選用湖南威克爾的福康（氟苯尼考粉)和武漢華揚的鹽酸
多西環(huán)素粉。具體的治療方法是按說明書的用量在網(wǎng)箱
中使用二氧化氯，�？岛望}酸多西環(huán)素粉以每次每1千克魚體重分別用藥0.1克~0.15克和0.02克的劑量進(jìn)行拌料投喂，每日1次，連續(xù)用藥7天。實驗結(jié)果1.自然發(fā)病病例臨床特征發(fā)病加州鱸主要為2齡加州鱸，大小為25厘米左右，鰓充血，肛門紅腫突出，尾鰭和腹鰭充血，背鰭基部有潰爛，解剖后，肝脾腫大，肝充血，脾黑紅，氣囊內(nèi)壁充血，肌肉出血。2.細(xì)菌分離通過平板劃線法進(jìn)行分離和純化，在患病加州鱸肝、脾和腎處都得到大小、形態(tài)一致的菌落，最終分離出單一的純菌株。該菌在BHI固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24小時后，形成3毫米~4毫米，圓形光滑、邊緣整齊、乳白色、中間凸起的菌落。革蘭染色呈紅色，為陰性桿狀菌。3.16SrRNA基因序列同源性檢索PCR擴增出該菌株的16SrRNA基因片段大小約為1500bp，測序結(jié)果表明其片段長度為1447bp。將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已報道的細(xì)菌基因序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與嗜水氣單胞菌的同源性達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)初步判斷該菌為嗜水氣單胞菌。4.藥敏實驗由藥敏實驗結(jié)果可知，該菌對喹諾酮類（左
氧氟沙星、
諾氟沙星)、
氯霉素類（氟苯尼考)、呋喃類（
呋喃妥因)、
四環(huán)素類（強力霉素)、頭孢菌素類（
頭孢哌酮)和大環(huán)內(nèi)酯類（新生霉素)等藥物敏感，對磺胺類（磺胺異惡唑)、氨基糖苷類（
鏈霉素)等藥物不敏感或耐藥。5.治療效果根據(jù)病原菌的鑒定結(jié)果，選用二氧化氯為外用藥，�？岛望}酸多西環(huán)素為內(nèi)服藥，以網(wǎng)箱內(nèi)潑灑二氧化氯溶液和投喂�？�、鹽酸多西環(huán)素相結(jié)合的方法進(jìn)行治療。用藥后第4天，死魚數(shù)量逐漸減少，魚的攝食量也逐步增加，病情得到初步控制，用藥一周后死魚現(xiàn)象消失，治療效果好。
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