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公開(公告)號(hào)
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CN1188523C
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公開(公告)日
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2005.02.09
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN00129601.9
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申請(qǐng)日期
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2000.09.29
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專利名稱
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一種藍(lán)藻穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體及其用于表達(dá)胸腺素α1的方法
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主分類號(hào)
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C12N15/63
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分類號(hào)
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C12N15/63;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/13;A61K38/16
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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廈門大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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章軍;徐虹;樓士林;歐陽(yáng)青
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地址
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361005 福建省廈門市思明南路422號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所
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代理人
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陳永秀;馬應(yīng)森
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國(guó)省代碼
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福建;35
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主權(quán)項(xiàng)
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用藍(lán)藻穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pPKEUT表達(dá)胸腺素α1的方法，其特征在于首先構(gòu)建含目的基因Tα1的重組質(zhì)粒，根據(jù)Tα1基因片段兩端的序列設(shè)計(jì)PCR引物T1、T2和T2’，T1(5’端引物)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphIBamHIGTTGACACCAGCFCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3’端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCFTCTTCASalISpeIACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’(3’端引物)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalISpeIPCR擴(kuò)增得110bp的Tα1DNA片段；選用pUC18多克隆位點(diǎn)兩端的通用引物U1和U2，以質(zhì)粒pUCUB為模板，按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增出含UB基因的328bp的DNA片段，純化328bp的UBDNA片段和110bp的Tα1DNA片段，用BamHI同時(shí)酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接物為模板，以U1和T2’為引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得380bp的UBTα1DNA片段，純化UBTα1基因片段，用HindIII和SpeI雙酶切UBTα1擴(kuò)增片段，與用HindIII部分酶切、XbaI完全酶切的藍(lán)藻穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pPKE2連接，連接物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，在卡那霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，得重組質(zhì)粒pPKEUT；然后用重組質(zhì)粒pPKEUT轉(zhuǎn)化受體藍(lán)藻synechococcusSp.PCC7942，所說的載體是來源于pPBS1質(zhì)粒構(gòu)建的、含有rbcspolyA終止區(qū)表達(dá)元件的載體。
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摘要
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涉及一種基因工程，以從織線藻Plectonema boryanum中提取的內(nèi)源小質(zhì)粒pPBS1構(gòu)建藍(lán)藻穿梭表達(dá)載體pPKE2，其有大腸桿菌源和藍(lán)藻源質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)，有選擇標(biāo)記、啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)及終止區(qū)，可作為外源基因在藍(lán)藻中表達(dá)的受體菌，本發(fā)明將目的基因胸腺素α1(Tα1)基因和泛素基因融合后插入表達(dá)載體pPKE2的多克隆位點(diǎn)，獲得含目的基因Tα1的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)單胞藍(lán)藻Synechococcus sp.PCC7942中，Southern雜交證實(shí)和Western印跡法檢測(cè)到了Tα1表達(dá)產(chǎn)物。
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國(guó)際公布
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